用时再与检测区内的荧光供体混合；也可以标记在所述表面标记物上,此时,有机染料标记在表面标记物上,表面标记物标记在上转换荧光纳米材料上，上转化荧光纳米材料固定在纸基材料的检测区内。本发明对所述有机染料在表面标记物上的标记方法没有特殊限制，可以直接购买标记有有机染料的表面标记物。所述荧光猝灭剂为荧光受体时，优选单独存在，使用时再与检测区内的荧光供体混合。本发明对所述层状氧化石墨烯或氧化碳球的来源没有特殊限制，可以直接购买得到，也可以按照本领域技术人员熟知的方法制备得到。
[0080]在本发明中，当有机染料标记在表面标记物上时，纸芯片的制备方法如下:
[0081]在纸基材料上形成检测区；
[0082]向所述检测区内加入荧光供体材料溶液，所述荧光供体材料包括上转换荧光纳米材料、标记在所述上转化突光纳米材料上的表面标记物和标记在所述表面标记物上的有机染料；
[0083]去除所述荧光供体材料溶液中的溶剂，得到固定有荧光供体材料的纸基材料；
[0084]所述固定有荧光供体材料的纸基材料即可作为纸芯片使用。
[0085]由于荧光染料可直接标记在表面标记物上，因此，其可以与表面标记物、上转换荧光纳米材料等直接固定在纸基材料的检测区内，其他步骤与上述制备方法相同，本发明在此不再赘述。
[0086]在本发明中，所述氨基或羧基修饰的上转化荧光纳米材料可以按照以下方法制备:
[0087]取2mL0.25mol/L稀土硝酸盐溶液，其中，稀土离子为摩尔比为80:18:2的钇离子:镱离子:铒离子，向其中加入18mL无水乙醇，再加入含0.9000g聚丙烯酸(聚丙烯酸与稀土离子摩尔比为1:1)或0.3400g聚乙烯亚胺的水溶液8mL，搅拌1min ;然后加入含0.2100g氟化钠(F_/Ln3+摩尔比为10: I)或0.1260g氟化钠(F_/Ln3+摩尔比为6:1)的水溶液8mL，搅拌20min后，置于高压反应釜中，在搅拌条件下于200°C反应4h?1h ;停止加热并保持搅拌冷却至室温，离心分离出固体产物，用无水乙醇和超纯水各洗3次，室温下真空干燥12h得到聚丙烯酸或聚乙烯亚胺修饰的上转换荧光纳米材料。
[0088]所述水溶性上转换荧光纳米材料的表面标记可以按如下方法进行:取5mg聚丙烯酸或聚乙烯亚胺修饰的上转换荧光纳米材料溶于2mL?5mLMES缓冲(10mM，pH5.5)或者是HEPES 缓冲(1nM, ρΗ7.4)中，加入 0.8mg ?3.2mg EDC.HCl,2.2mg ?6.6mg Sulfo-NHS或者是Img?5mg sulfo-SMCC，在30°C、轻微振荡条件下孵育0.5h?2h以活化上转换荧光纳米材料表面的羧基或氨基。活化完成后离心分离得活化的聚丙烯酸或聚乙烯亚胺修饰的上转换荧光纳米材料，将其用高纯水洗三次。洗完的沉淀分散于2mL?5mL HEPES缓冲(1mM, pH7.2)中，向其中加入1.5uM_4uM的单链DNA或Img?3mg的染料标记的多肽，在30°C、轻微振荡条件下孵育2h?24h后加入50mgTris以封闭过量的NHS。离心分离，将得到的沉淀用高纯水洗三次以除去过量的单链DNA或多肽，洗完后分散于2.5mlTris-HCl(1mM, 150mM NaCl，ρΗ7.4)中。
[0089]在本发明中，所述层状氧化石墨烯可以按照以下方法制备:取50mL浓硫酸加热至900C，向其中加入1g K2S2O8和1g P2O5,降温至800C，待K2S2O8和P2O5完全溶解后缓慢加入12g石墨粉，30min内加完，80°C条件下反应4h?5h，然后加入2L水，静置一夜后过滤，离心洗涤以除去酸，将得到的预氧化产物进行干燥；取460mL浓硫酸至于冰水浴中，加入所述预氧化产物并搅拌，然后保持反应液温度不超过10°C下缓慢加入60g高锰酸钾，于35°C反应2h后缓慢加入IL蒸馏水，使其温度不超过50°C，继续搅拌2h后加入3L去离子水和50mL30%H202,静置一天后弃去上清液，残留液先用10%HC1洗再用蒸馏水洗，将得到的氧化产物进行干燥；将干燥后产物继续超声2h，使氧化石墨烯逐渐剥落成层状氧化石墨烯。
[0090]以上方法只是对上转换荧光纳米材料、在上转换纳米材料表面标记表面标记物、制备层状氧化石墨烯的举例说明，本领域技术人员可以用其他已知方法制备上述物质。
[0091]本发明还提供了一种生物分子的检测方法，包括以下步骤:
[0092]提供纸芯片，所述纸芯片包括纸基材料、荧光供体和荧光猝灭剂；其中，所述纸基材料上设置有检测区；所述荧光供体材料固定在所述纸基材料检测区内，所述荧光供体材料包括上转换突光纳米材料和标记在所述上转换突光纳米材料上的表面标记物；所述突光粹灭剂包括有机染料或突光受体
[0093]将荧光猝灭剂溶液加入到纸基材料的检测区内，再加入待测样品进行孵育，测定得到的产物的荧光强度，根据所述荧光强度以及浓度与荧光强度的标准曲线计算所述待测样品的浓度。
[0094]当所述荧光猝灭剂标记于所述表面标记物时，所述生物分子的检测方法包括以下步骤:
[0095]提供纸芯片，所述纸芯片包括纸基材料、荧光供体和荧光猝灭剂；其中，所述纸基材料上设置有检测区；所述荧光供体材料固定在所述纸基材料检测区内，所述荧光供体材料包括上转换突光纳米材料和标记在所述上转换突光纳米材料上的表面标记物；所述突光猝灭剂标记在所述表面标记物上；所述荧光猝灭剂为有机染料；
[0096]将待测样品加入到纸基材料的检测区内进行孵育，测定得到的产物的荧光强度，根据所述荧光强度以及浓度与荧光强度的标准曲线计算所述待测样品的浓度。
[0097]除了荧光猝灭剂的加入方式不同，上述两种检测方法无其他区别，因此，以第一种检测方法为例进行说明。
[0098]本发明以上述技术方案所述的纸芯片或者上述制备方法制备得到的纸芯片为检测装置对生物分子进行检测，纸芯片的具体结构及其制备工艺参见上文所述，本发明在此不再赘述。
[0099]将荧光猝灭剂溶液加入到纸基材料的检测区内，使荧光猝灭剂与荧光供体发生反应，然后加入待测样品进行孵育，测定得到的产物的荧光强度，根据所述荧光强度以及浓度与荧光强度的标准曲线即可计算所述待测样品的浓度。
[0100]本发明首先选择最佳荧光猝灭剂浓度，具体方法如下:
[0101]向纸基材料的检测区内分别加入不同浓度的荧光猝灭剂溶液，反应后分别检测得到的反应产物的荧光强度，选取荧光猝灭效率最大时荧光猝灭剂溶液的浓度作为最优浓度。
[0102]当荧光猝灭剂为有机染料且标记在表面标记物上时，可以不进行该步操作。
[0103]本发明优选以生物分子在缓冲溶液中形成的待测样品作为检测对象进行检测浓度的确定，具体方法如下:
[0104]向纸基材料的检测区内分别加入最优浓度的荧光猝灭剂溶液，反应后加入系列浓度的生物分子在缓冲溶液中形成的待测样品溶液，孵育后分别检测得到的反应产物的荧光强度，待测样品溶液浓度的荧光强度记为F，空白溶液的荧光强度记为F0，以(F-FO) /FO为纵坐标、浓度为横坐标制作待测物质在缓冲溶液中的标准曲线，获得该检测方法的适宜检测浓度。
[0105]获得适宜检测浓度后，可以生物分子在全血或血清中形成的待测样品作为检测对象，进行标准曲线的建立以及未知浓度待测样品的检测，标准曲线的建立方法如下:
[0106]向纸基材料的检测区内分别加入最优浓度的荧光猝灭剂溶液，反应后加入系列浓度的生物分子在血清或全血中形成的待测样品溶液，该系列浓度在上述适宜检测浓度范围内，孵育后分别检测得到的反应产物的荧光强度，待测样品溶液浓度的荧光强度记为F，空白溶液的荧光强度记为F0，以(F-FO) /FO为纵坐标、浓度为横坐标制作待测物质在全血或血清中的标准曲线。
[0107]对于未知浓度待测样品的检测而言，具体方法如下:
[0108]向纸基材料的检测区内加入最优浓度的荧光猝灭剂溶液，反应后加入生物分子在血清或全血中形成的待测样品溶液，孵育后检测得到的反应产物的荧光强度，根据该荧光强度以及待测物质在全血或血清中的标准曲线计算该待测样品的浓度即可；
[0109]或者可以为:
[0110]向纸基材料的检测区内加入最优浓度的荧光猝灭剂溶液，反应后加入生物分子在缓冲溶液中形成的待测样品溶液，孵育后检测得到的反应产物的荧光强度，根据该荧光强度以及待测物质在缓冲溶液中的标准曲线计算该待测样品的浓度即可。
[0111]在上述最优浓度荧光猝灭剂溶液的确定、缓冲溶液中标准曲线的建立、全血或血清中标准曲线的建立以及未知浓度待测样品的检测过程中，荧光猝灭剂和荧光供体进行反应的工艺参数、孵育的工艺参数以及检测的参数等相似，具体可以为:荧光猝灭剂