理和代谢联系，FUM获取的这些非 均质细胞的数据已被证实与卵母细胞的健康相关。此类手段避免了照明对卵母细胞的任何 潜在伤害，并且还避免了对证明安全性的临床试验的任何需要。本文使用的术语"卵丘细 胞"和"颗粒细胞"是指此类卵丘细胞：所述卵丘细胞为在卵母细胞周围并为卵母细胞提供 营养的专门的颗粒细胞。这些细胞包围充分生长的卵母细胞，形成卵丘-卵母细胞复合体 ("C0C")。术语载卵丘细胞（cumulus oophorus cells)、卵丘颗粒细胞（cumulus granulosa cells)、载卵丘颗粒细胞（cumulus oophorous granulosa cells)、颗粒-卵丘细胞用于 区别这些细胞与位于Graafian卵泡壁的其它功能不同的颗粒细胞亚群。卵丘细胞为发育 能力的获取提供了关键产物，并且，卵丘细胞与颗粒细胞在它们的激素应答和它们产生的 生长因子方面存在不同。卵丘细胞的缺失或卵丘细胞的数量不足损害胚胎产生。培养中 裸露的（denuded)卵母细胞用标准授精（insemination)无法进行正常受精。卵母细胞的 成功成熟需要卵丘细胞。这些细胞合成了丰富的粘液-弹性细胞外基质（muco-elastic extracellular matrix)，所述粘液-弹性细胞外基质促进卵母细胞从卵泡挤出，并促进 卵丘体（cumulus mass)的体积呈20-40倍增加，并且还可能作为精子的选择性屏障起作 用（Salustri，2000)。关于卵母细胞成熟和卵丘-卵母细胞复合体的细胞外基质形成过 程中的细胞和分子事件，还参见Russel和Salustry(2006)以及Kimura等（2007)。卵丘 细胞显示出糖酵解通路的多种酶还有中性氨基酸转运蛋白的高表达。由卵母细胞分泌的 旁分泌因子促进了它们的表达（Eppig等，2005 ;Sugiura等，2005)，其中，卵母细胞自身不 能摄取L-丙氨酸，并且对用于能量产生的葡萄糖代谢不良，因此依赖卵丘细胞为它们提 供（Biggers 等，1967 ;Colonna 和 Mangia，1983 ;Donahue 和 Stern，1968 ;Eppig 等，2005 ; Haghighat 和 Van Winkle，1990 ;Leese 和 Barton，1984,1985)。由于卵丘细胞为卵母细胞 提供了生长环境，它们的代谢状态可用于反映它们所支持的卵母细胞的代谢状态。因此，在 本发明所有实施方式的一个方面中，所述方法使用一个或多个卵丘细胞来选择用于体外受 精的卵母细胞，或者将卵母细胞排除在体外受精之外。卵丘细胞从授精或ICSI之前的卵母 细胞周围获得，并且分析在体外进行。
[0032] 通常将细胞在37°C放置于含有细胞培养介质并适于成像的孔中。
[0033] 本文所提到的"参比值"通常使用可比来源的正常健康细胞（例如，正常健康的卵 母细胞、正常健康的胚胎、正常健康的卵母细胞周围的卵丘细胞、或来自正常健康的胚胎的 细胞）进行评价。参比值通常为来自经过平均的实验的范围，虽然还提供了包含类似来源 的健康参比细胞的分析，参比值通常是预先确定的。
[0034] 本发明的方法使用通常为独立的（self-contained)显微镜设置的装置，例如箱， 例如通常在体外受精临床中用于选择用于受精的卵母细胞和用于转移的胚胎的台式显微 镜箱。
[0035] 本方法基于对卵母细胞或胚胎的代谢状态的荧光寿命成像显微术（FUM)的使 用。装置内部包含如下设备或基本上由如下设备构成：显微镜和全部外围设备；以及围绕 (enclosing)显微镜载物台的环境室（environmental chamber)。显微镜外部的小槽允许 将含有颗粒细胞、卵母细胞、或胚胎、或来自于胚胎的活检得到的细胞的定制多孔板插入至 显微镜载物台。例如，位于装置外部的屏幕监视器（如触摸屏监视器）包含控件并显示所 获取的数据。
[0036] 该装置能够在可通过任何程序获取以及放置于任何介质中的卵母细胞和胚胎以 及卵丘细胞和分离自胚胎的细胞上使用。因此，所述方法易于与体外受精临床中的当前实 践以及进行胚胎或卵母细胞评价的其它设置兼容。
[0037] 活细胞具有能量产生和能量利用化学反应的复杂调控系统。涉及能量生成的代谢 反应分解大分子，例如糖类、脂质或蛋白。大部分的细胞能量生成代谢通路最终导致乙酰辅 酶A(乙酰CoA)产生。例如，糖类被代谢成丙酮酸，丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶系统被氧化成 乙醜CoA。
[0038] 乙酰CoA在一系列氧化反应循环（或者称为三羧酸（TCA)循环、Krebs循环或柠 檬酸循环）中被完全氧化。虽然某些TCA循环的酶也存在于胞液（cytosol)中（在胞液中 这些酶在其它代谢通路中起作用），所有的TCA循环酶位于线粒体中。在一个完整的TCA循 环中乙酰CoA的氧化导致产生两个C0 2分子、一个高能磷酸键（例如，GTP中存在的高能磷 酸键）以及四个还原当量（reducing equivalents)(即，三个NADH和一个FADH2,分别来自 三个NAD+和一个FAD)。
[0039] 先前已将NADH和FAD的测量用于细胞培养以及癌前（precancerous)上皮细胞的 分析（Skala 等，PNAS 104(49) :19494-19499,2007)。Skala 等证明了，蛋白结合的 NADH 的 荧光寿命的减少以及蛋白结合的FAD的荧光寿命的增加与上皮癌的不同状态相关。该研究 还表明了，游离NADH以及蛋白结合的NADH的荧光寿命随着低氧而减少（Bird等，Cancer Res. 65 :8766_8773,2005 ;Schneckenburger 等，J.Fluorescence 14 :649_654,2004);并 且，在口腔癌的仓鼠颊囊模型的癌前情况中，体内游离NADH以及蛋白结合的NADH的荧光寿 命减少（Skala 等，J. Biomed. Opt. 12:024014, 2007) 〇
[0040] 已经表明，出于多种原因，测量卵母细胞/胚胎培养介质中的丙酮酸水平作为评 价代谢活性的手段是不够的。例如，不能预测来自卵母细胞周围的卵丘细胞的丙酮酸对介 质的贡献。此外，由于从未成熟的卵母细胞直至囊胚的发育中的胚胎不断变化的营养（例 如底物）需求，卵母细胞/胚胎的代谢谱很复杂。在卵母细胞和早期胚胎中，由细胞摄取 的绝大部分丙酮酸经由乙酰CoA被输送进线粒体TCA循环和氧化磷酸化（Wales，R.等， (1970)Aust. J. Biol. Sci. 23,877-887)。在培养中需要丙酮酸来支持胚胎的第一次卵裂分 裂（cleavage division)和第二次卵裂分裂（Biggers，J?等，（1967) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 58 (2)，560-567)，而葡萄糖直到四细胞期才能支持发育。葡萄糖是囊胚需要的主要 营养物（Brinster，R.等，（1966) Exp. Cell Res. 42, 303-315)。培养中的细胞随时间表现出 不同的营养需求。例如，培养的细胞的氧化代谢随时间下降；此类细胞变得越来越依赖无 氧糖酵解，并伴随乳酸产生（Morgan，M?等，（1981)Biosci.R印.1，669-686)。因此，例如， 体外培养的小鼠囊胚产生了几乎为新鲜收集的囊胚的两倍的乳酸（Gardner，D.等，（1990) J.Reprod.Fertil.88,361-368)。因此，培养介质中丙酮酸（营养物）的简单测量并不一定 是卵母细胞/胚胎的线粒体或代谢情况的可靠或精确测量。
[0041 ]卵母细胞/胚胎含有稳态浓度的NADH，其作为发生在线粒体（例如，三羧酸循环和 电子传递）和胞液（例如，糖酵解）中的代谢反应的结果而存在于细胞中。虽然可能期望 发现代谢活性和卵母细胞/胚胎存活力之间的相关性，过去的努力并未建立任何此类直接 相关性。例如，Conaghan 等，J. Assist. Reprod. Genet 10 (1) :21_30,1993 的研究报道了由 人胚胎进行的丙酮酸摄取对成功植入的胚胎不具有预测性。
[0042] 美国专利号5, 541，081中的发现表明，为了使用NADH来获得关于胚胎/卵母细胞 的代谢状态的信息，首先必须通过将胚胎/卵母细胞放置在对照介质中并获得至少一个对 照NADH荧光测量来降低所述卵母细胞/胚胎的内源NADH浓度。在对照测量后，然后使所 述卵母细胞/胚胎经历具有营养物的不同介质一段时间，并对NADH浓度的改变进行观测。 该分析不仅费时，并且还使胚胎/卵母细胞在从专门的介质移至另一介质时遭受额外且不 必要的应激。
[0043] 与先前报道的胚胎评价方法相反，本发明的方法允许在不使胚胎/卵母细胞/卵 丘细胞/来自于胚胎的细胞经受培养介质改变的情况下，对所述胚胎/卵母细胞/卵丘细 胞/来自于胚胎的细胞内的NADH和/或FAD进行直接分析。由于FLIM的特异性，我们已 经证实了：我们能够观察到蛋白结合的NADH和/或FAD以及游离NADH和/或FAD的荧光 寿命，其中，我们发现该荧光寿命表明胚胎/卵母细胞的代谢活性，并且对例如植入成功性 具有预测性。
[0044] 荧光寿命成像显微术（FUM)是基于来自荧光样品的荧光的指数衰减率差异来产 生图像的成像技术。FUM可用作共聚焦显微术、双光子激发显微术和多光子断层扫描术 (multiphoton tomography)中的成像技术。
[0045] 在FUM中，使用荧光团信号的寿命而非它的强度来创建图像。它的优点在于使厚 层的样品中光子散射的影响最小化。
[0046] 由光子激发的荧光团将经由许多不同（辐射和/或非辐射）的衰减途径，基于衰 减率以一定的概率掉至基态。为了观测荧光，这些途径中的一者必须通过光子的自发发射 来进行。这可以用来在化学传感中实现不基于强度的测量。
[0047] 荧光寿命可通过使用脉冲源在时域中进行测定。
[0048] 通常采用时间相关单光子计数（TCSPC)。具体而言，TCSPC记录单个脉冲后由类 似光电倍增管（PMT)或雪崩光电二极管（APD)这样的东西检测到各光子的时间。对另外 的脉冲进行重复记录，在足够的记录事件后，能够建立横跨所有这些记录的时间点的事件 数量的直方图。然后，可将该直方图拟合至含有感兴趣参数的函数，由此能够相应地对该 参数进行提取。16~64多通道PMT系统可商购，但最近展示的CMOS单光子雪崩二极管 (SPAD)-TCSPC FUM系统可提供额外的低成本选项。
[0049] 在门控方法中仍使用脉冲激发。脉冲到达样品前，一部分光被二向色镜反射，并 被光电二极管检测到，该光电二极管活化控制门控光学增强器（G0I)的延迟发生器（位于 C⑶检测器前面）。该G0I在延迟之后开放时仅允许检测小部分的时间（the fraction of time)。因此，利用可调节的延迟发生器，能够收集多个延迟时间（包含样品的荧光衰减的 时间范围）后的荧光发射。
[0050] 或者，可通过相位调制方法在频域中对荧光寿命进行测定。通过声光调制器（例 如，其将调制荧光）在高频下对连续波源的强度进行调制。由于激发态具有寿命，荧光相对 于激发信号将会延迟，所述寿命可由相移（phase shift)得以确定。另外，将对针对激发和 焚光正弦波的y分量（y-components)进行调制，寿命可由这些y分量的调制比得以确定。 因此，可由相位调制方法确定出关于寿命的2个值。结果是，如果从y分量提取出的寿命与 从相位提取出