给它们带来额外的应激。
[0077] 所述方法进一步包括对整个测试细胞、或所述测试细胞的细胞质、或所述测试细 胞的线粒体的NADH自发荧光、或FAD自发荧光、或两种自发荧光的荧光寿命直方图进行平 均。
[0078] 为了能够选择健康细胞以用于进一步的辅助生殖方法，所述方法还包括将来自所 述测试细胞的平均荧光寿命直方图与平均荧光寿命直方图参比值进行比较，以确定来自所 述测试细胞的测量的平均荧光寿命直方图是否在统计学上不同于所述参比值。通常，该比 较使用通常使用计算机可执行软件的非人工机器进行，所述软件包含参比值与来自各单独 的细胞FUM分析的值之间的比较。
[0079] 类似于NADH，在本发明的方法中也可使用FUM对FAD的自发荧光进行分析。
[0080] 来自细胞的NADH的FUM曲线表现出双指数衰减，具有对应于蛋白结合的NADH的 长寿命（约2. 5纳秒（ns))和对应于游离NADH的短寿命（约0. 4ns)。因此，FUM曲线为 双指数，长寿命和短寿命的相对分数（relative fraction)反映了蛋白结合的NADH与游离 NADH的相对分数。这提供了细胞代谢状态的直接读出（Lacowciz等，1992)。长寿命可在 1-3 (纳秒）ns变化，短寿命可在0. 2-0. 7ns变化。
[0081] 游离状态和结合状态中的这些寿命的精确值取决于多种细胞因素，例如， pH(Ogikubo等，2011)。长寿命与短寿命的相对分数以及这些寿命的精确值通常使用最小 二乘拟合来确定。然而，贝叶斯推理法（Baysian inferences approaches)能够允许用 更少的光子得到甚至更精确的参数估计（parameter estimates)和参比估计（reference estimates)，这使得能够使用甚至更少的光获得进一步的可靠性，并进一步使样品暴露最 少化。
[0082] 已在不同组织构造（organization)水平（即，溶液、线粒体和细胞悬浮液、组织切 片以及器官（体外和体内）中）对NADH(还原形式）的吸收光谱和荧光光谱进行了良好表 征。NADH具有处于约300nm_380nm的光吸收带，以及处于420nm_480nm的焚光发射带。虽 然对于不同的环境和测量条件，光谱的形状和最大值有小的差别，认为光谱是相同的。然 而，作为普遍共识，荧光带的强度（不取决于环境的组织构造水平）与线粒体NADH(还原 形式）的浓度成比例，特别是从组织进行体内测量时（参见例如，Avraham Mayevsky和 Gennady G.Rogatsky 的综述，Am J Physiol Cell Physiol，2007年 2 月，第292卷，第 2 期， C615-C640)〇
[0083] 因此，在本发明所有实施方式的一些方面中，可用FUM对NADH的直接自发荧光进 行分析，其中，在双光子荧光激发中使用约740nm的波长，并使用以约460nm为中心的发射 带通滤光器。
[0084] 在本发明所有实施方式的一些方面中，还可用FUM对NADH的直接自发荧光进行 分析，其中，在单光子荧光激发中使用约340nm的波长，并使用以约460nm为中心的发射带 通滤光器。
[0085] 在本发明所有实施方式的一些方面中，可用FUM对FAD的直接自发荧光进行分 析，其中，在双光子荧光激发中使用约900nm的波长，并使用以约550nm为中心的发射带通 滤光器。
[0086] 可用FUM对FAD的直接自发荧光进行分析，其中，在单光子荧光激发中使用约 450nm的波长，并使用以约550nm为中心的发射带通滤光器。
[0087] 根据本发明的方法分析的胚胎为植入前胚胎，并且所述分析在体外进行。类似地， 从胚胎获得的细胞获得自植入前胚胎，并且细胞活检在体外进行。
[0088] 可通过以下方式将使用NADH和FAD的FUM的分析结合：简单地将细胞连续暴露 于适于NADH的波长继而是适于FAD的波长，或者连续暴露于适于对FAD的荧光寿命进行成 像的波长继而是适于对NADH的荧光寿命进行成像的波长。因此，在本发明所有实施方式的 一些方面中，所述方法包括FAD和NADH的连续分析。
[0089] 分析通常仅需很短的时间，例如30秒至5分钟，并且可为多元的（multiplexed) 和自动化的。
[0090] 因此，我们提供了用于对卵母细胞或胚胎的质量进行评价的方法，所述方法包括： (a)在介质中将颗粒细胞、卵母细胞、胚胎或来自胚胎的细胞暴露至荧光寿命成像显微术 (FLIM)，以获取所述颗粒细胞、所述卵母细胞、所述胚胎或所述来自胚胎的细胞中的NADH 自发荧光的荧光寿命直方图；(b)对整个颗粒细胞、卵母细胞、胚胎或来自胚胎的细胞的 NADH自发荧光的荧光寿命直方图进行平均；（c)将NADH自发荧光的平均荧光寿命直方图拟 合至两个指数之和；以及（d)当检测到其中的a小于a参比值且0小于0参比值的细 胞（无论是颗粒细胞、卵母细胞、胚胎还是来自胚胎的细胞）时，选择该卵母细胞或胚胎用 于体外受精或植入；或者，当检测到其中的a等于或大于a参比值且0等于或大于0参 比值的细胞（无论是颗粒细胞、卵母细胞、胚胎还是来自于胚胎的细胞）时，则将该卵母细 胞或胚胎从体外受精中弃去。所述细胞可为胚胎、卵母细胞、或提取自胚胎的细胞、或卵母 细胞周围的卵丘细胞。在一些方面中，所述方法进一步包括如下步骤：当检测到具有a小 于a参比值且0小于0参比值的细胞（无论是卵母细胞还是来自所述卵母细胞周围的 一个或多个卵丘细胞）时，对该卵母细胞进行体外受精；或者，当检测到具有a小于a参 比值且0小于0参比值的来自胚胎的细胞或胚胎时，植入所述胚胎。
[0091] 在本发明所有实施方式的一些方面中，a参比值为1-4,例如，1. 1、1.2、1.3、1.4、 1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2. 0、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、2. 9、3. 0、3. 1、3. 2、3. 3、 3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、3. 9、4. 0,或2-3、或2-4、或1-2、或1-3。在本发明所有实施方式的 一些方面中，a参比值为1.7。
[0092] 在本发明所有实施方式的一些方面中，0参比值为2000ps-3000ps、或 2000ps-2500ps、或 2500ps-3000ps、或 2000ps-2250ps、或 2000ps-2750ps。在所有实施方 式的一些方面中，0参比值为2250ps(皮秒）。图1提供了用于卵母细胞评估的合适的a 值和0值的实例。
[0093] 同时，我们的初步分析使用小鼠卵母细胞作为模型进行。人和小鼠二者的卵母细 胞和胚胎的代谢状态几乎相同。因此，从小鼠卵丘细胞、卵母细胞和/或胚胎的代谢状态 FUM分析中获得的参比值能够直接应用于人卵母细胞和胚胎分析。参比值也可由人卵丘细 胞、卵母细胞和/或胚胎获得。
[0094] 在本发明所有实施方式的一些方面中，在双光子激发中使用约740nm的波长，并 使用以约460nm为中心的发射带通滤光器来进行NADH的FUM。
[0095] 在本发明所有实施方式的一些方面中，在不同时间获得FUM图像，而不是仅获取 单个图像。这种延时数据（time-lapse data)将更丰富，从而能够提供关于细胞的更多信 息。然而，这需要细胞处于装置中较长的时间，它们会暴露于较多的光，由此使所述方法的 侵入性略有增加。
[0096] 所述方法通常使用含有传统显微镜的几乎全部部件的系统来进行。因此，所述方 法还可与形态学延时数据的分析结合。
[0097] 关于进行FLIM测量，存在三种可能的选项，所有选项均可用于本发明的方法：以 点检测器进行的双光子激发、以点检测器进行的单光子激发、或以面检测器（即，相机）进 行的单光子检测。下表指出了各个选项的优势。在我们的实施例中，我们使用了双光子方 法。
[0098]
[0099] 实施例
[0100] 我们在小鼠卵母细胞中获得了关于NADH的FUM的初步数据。该初步数据在FUM 系统上获得。显微镜由以下部件构成：钛蓝宝石飞秒激光器（ti-sapphire femtosecond laser，Spectra-Physics)、倒置显微镜座（Nikon)、扫描头（Becker&Hickl)、混合式 PMT 检 测器（Hamamatsu)以及用于时间相关单光子计数的电子器件（Becker&Hickl)。组装该显微 镜，以获取初步数据。
[0101] 将卵母细胞放置于显微镜载物台上的介质中，并进行成像。通过对整个卵母细胞 的FUM数据进行平均，对各卵母细胞的单个图像进行分析。将获取的来自NADH的荧光寿 命直方图（对整个卵母细胞进行平均）拟合至两个指数之和。参数a为两个指数的振幅 之比，参数0为较长指数的寿命（以皮秒计）。
[0102] 未受干扰的卵母细胞表现出一定范围的a值和0值（图1，圆圈）。从图1中可 看出，卵母细胞质量取决于卵母细胞的代谢状态。卵母细胞的代谢状态可通过FAD或NADH 的荧光寿命成像显微术（FUM)快速、非侵入性且定量地测量。从卵母细胞的NADH(或FAD) 的FLIM测量中提取两个参数（a和0)。在实施例中，我们使用了小鼠卵母细胞，但由于在 这一阶段哺乳动物细胞（例如小鼠和人类细胞）相对类似，特别是关于它们的代谢状态的 方面，预期类似的计算对人卵母细胞也奏效。各点对应于来自单个卵母细胞的数据。通过 特异性代谢抑制剂（黑色十字）或非特异性损伤（三角）干扰卵母细胞使得两个参数均升 高。未受干扰的卵母细胞（圆圈）表现出一定范围的a值和0值。这些参数表示卵母细 胞的质量。
[0103] 当通过施用代谢抑制剂（图1，黑色十字）或大幅增加激光功率以故意损伤卵母细 胞（图1，三角）来干扰所述卵母细胞时，a和0均升高。在用于成像的低激光功率中并 未发生此类损伤。
[0104] 我们的结果表明，低的a值和0值表示卵母细胞和胚胎健康。发现所有受干扰 的卵母细胞处于a高于1.7且0高于2250的上象限。这表明，这些a值和0值可用作 截止值，高于这些值的卵母细胞由于有可能不健康而被否定，而低于这些值的卵母细胞被 视为健康，并被选择使用。
[0105] 人卵母细胞和小鼠卵母细胞的代谢非常相似，因此，关于小鼠建立的a和0的截 止值也可用于人类分析。
[0106] 定量、快速且客观地获得了a值和0值。因此，所述方法在体外受精临床中高度 有用。
[0107] 参考文献
[0108] 通过引用将本文和整个申请文件中所引用的文献整体并入本文。
[0109]Botros，L.，Sakkas，D.andSeli，E.Metabolomicsanditsapplicationfor non-invasiveembryoassessmentinIVF.MolecularHumanReproductionVol. 14， No.12pp.679-690,2008.
[0110] Lakowciz，J.R.，Szmacinski，H.，Nowaczyk，K.，andJohnson，M.L.Fluorescence lifetimeimagingoffreeandprotein-boundNADH.PNAS. 1992.89. 1271-1275
[0111] Ogikubo，S