一种俘获有核红细胞的纳米材料的制作方法
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明属于生物材料领域，涉及一种基于生物可兼容纳米颗粒基底捕获血液中罕有细胞的方法。
[0002]【背景技术】:
胎儿有核红细胞是胎儿造血系统及胎儿外周血液循环的一个特殊标志，是孕妇外周血中的一种罕有细胞。胎儿血循环于受精后3周末建立，其红细胞主要来源于卵黄囊。于妊娠足月时，90%的红细胞来源于骨髓。有核红细胞不仅存在于胎儿的血液循环中，而且可以通过胎盘屏障进入母体外周血液，其数量随着孕周增加逐渐减少。胎儿有核红细胞具有多种特征:①正常人外周血中不存在有核红细胞，若出现则属于病理现象；②属单个核细胞，含胎儿全部基因组；③表面具有较多的相对特异的抗原成份如CD71，CD36和血型糖蛋白(GPA)等；④妊娠妇女外周血中含量较少，在1: 105?1: 109之间；⑤生命周期短，约90天产后在母血中很快消失，用于诊断时不受前次妊娠影响。有核红细胞的特殊性质，为某些病理妊娠的预测和诊断提供了新思路，其中，产前利用母血中的胎儿有核红细胞筛查胎儿遗传性疾病，已经成为近年新发展起来的一项无创性产前诊断技术。但是由于母体外周血中胎儿有核红细胞含量甚微，很难直接用于诊断，必须先经过富集，因此对有核红细胞的分选和捕获是一个重要的研究课题。
[0003]目前，常用的细胞分选技术是流式细胞术，但是该技术使用的设备昂贵、体积庞大、需要专业人员进行操作，而且细胞的用量较大，难以在实验室和医院普及推广。磁激活细胞分选法操作相对简单，费用相对低廉，用时短，其原理是在外加磁场的作用下，将结合磁性微粒的单克隆抗体标记的细胞分离出来。但该方法分离的纯度不高，除需要分离的靶细胞外，淋巴细胞和一些单核细胞也可能被激活，所以，分选时抗体的选择显得至关重要。单细胞显微操作分离法是在显微镜下从形态学上识别靶细胞，并用微操作器将其逐一挑取出，然后进行分析。该技术分选纯度高，但是技术难度大，仪器设备要求高，不易推广。
[0004]近期，利用微流控技术捕获目标细胞的应用越来越广泛，该方法先对基底材料进行特定的表面处理使之具有纳米结构，然后进行表面化学修饰将特定抗体偶联到基底上来捕获目标细胞。纳米材料因此特殊的尺寸和结构而表现出小尺寸效应、高比表面积等诸多不同于一般材料的特性，增大待测细胞与靶点的接触几率，同时，纳米材料的粗糙表面可降低静电力从而减少排斥作用，增大了靶细胞的粘附性，大大提高待测细胞的富集效率，纳米材料的低杨氏模量也有利于细胞的捕获。利用纳米材料捕获细胞是一种较为可行的方法，而有核红细胞作为细胞中的一种特殊细胞，也可以借鉴相关技术对其进行捕获。
[0005]
【发明内容】
:
为此，本发明提供了一种可以解决上述问题或者至少能部分解决上述问题的基于生物可兼容性纳米基底(包含但不仅限于Silicon，Si02，Mn02，Ti02，ZnO, Zr02，Sn02，羟基磷灰石颗粒和聚苯乙烯微球等)用于血液中罕有细胞(包含但不仅限于循环肿瘤细胞，循环纤维细胞，胎儿有核红细胞等)的捕获方法。这种方法可以实现从全血中特异性分离捕获出罕有细胞，并且通过荧光蛋白染色鉴定细胞。具体包括如下步骤: 制备生物可兼容纳米颗粒基底材料步骤:使用的钛酸四丁酯在去离子水中水解后，水热合成纳米颗粒，然后按照Ig合成的纳米颗粒分散到0.05g的月桂酸，0.2g的乙基纤维素和1ml的松油醇和乙醇混合溶液(体积比为1:1)混匀后，无水乙醇稀释制成前驱液，再将前驱液旋转涂覆到干净玻璃表面后，500°C高温退火15分钟烧结成膜。
[0006]化学修饰步骤:修饰过程中先用无水乙醇清洗基底表面后，再用4%的MPTMS和GMBS在室温下分别浸泡I小时和45分钟，然后滴加20ug/ml的链霉亲和素，于4°C下过夜，清洗后滴加10ug/ml的抗体并在室温下放置2小时。
[0007]细胞捕获步骤:利用密度梯度离心法从新鲜血中分理出含有有核红细胞的单核细胞并分散到磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后滴加到修饰完抗体的基底上，于37°C细胞培养箱中静置I小时。
[0008]细胞染色及鉴定步骤:完成细胞捕获后，依次使用多聚甲醛固定，triton X-100打孔和Blocking封阻处理后，滴加免疫荧光蛋白染料，并且在4°C下避光过夜保存。再使用DAPI复染细胞核。然后置于荧光显微镜下观察细胞染色结果。
[0009]根据本发明基于生物可兼容纳米颗粒基底的血液中罕有细胞捕获方法能够有效的从新鲜血中分离捕获出目标细胞，并通过免疫荧光蛋白染色鉴定捕获的细胞，还能直接对其进行其他分析。
[0010]可选地，根据本发明的方法，还包括:
观测和记录步骤:对芯片中的捕获结果进行观测和记录，对经过免疫荧光蛋白鉴定后的结果进行观测和记录。
[0011]可选地，根据本发明方法，还包括:
玻璃清洗步骤:制备纳米基底材料中使用的玻璃，首先在浓H2S04和H202 (体积比为3:1)混合溶液中浸泡1.5小时，然后用去离子水冲洗干净后烘干。
[0012]可选地，根据本发明方法，还包括:
基底修饰过程中清洗步骤:芯片材料修饰MPTMS后分别用无水乙醇和DMSO(二甲亚砜)清洗三遍，然后修饰GMBS后分别用DMSO和PBS清洗三遍。
[0013]可选地，根据本发明方法，还包括:
新鲜血的收取和处理步骤:收取新鲜血及时保存在含有m)TA (抗凝剂)的采血管，并在6小时内处理。然后与PBS按照1:1的比例混匀后缓慢滴加到淋巴细胞分离液的表面，接下来放置到水平转速离心机中400g离心处理30分钟，然后取出单核细胞层分散到PBS溶液中待用。
[0014]可选地，根据本发明方法，还包括:
细胞捕获后的观察步骤:完成细胞捕获过程后，用PBS轻轻清洗三遍，以除去未捕获到的细胞和非特异性吸附的细胞；然后在保持芯片湿润的情况下(保持细胞完整，以免细胞破碎影响后续分析)放置到显微镜下观察细胞捕获情况并记录。
[0015]可选地，根据本发明方法，还包括:
细胞类型鉴定结果和记录步骤:染色后的芯片放置到荧光显微镜上，观察细胞染色结果，并利用CCD拍摄下结果。
[0016]本发明基于生物可兼容性纳米基底(包含但不仅限于Silicon，Si02，Mn02，Ti02，ZnO，Zr02, Sn02，羟基磷灰石颗粒和聚苯乙烯微球等)用于血液中罕有细胞(包含但不仅限于循环肿瘤细胞，循环纤维细胞，胎儿有核红细胞等)的捕获方法具有如下优点，主要表现在:(1)利用水解和水热法合成具有良好生物兼容性的纳米颗粒，然后旋转涂覆在玻璃表面高温退火烧结成膜，制备方法简单、价格低廉，并且可以调控合成粒径大小实现对细胞的高效捕获；(2)利用纳米基底芯片粗糙表面结构与细胞表面化合物结构的相互作用增强捕获效果，同时在基底上修饰抗体实现特异性的捕获目标细胞；(3)从新鲜血中特异性分离捕获出目标细胞，并且保证细胞单层分布在基底芯片上，方便后续细胞研究和分析；(4)利用免疫荧光蛋白染色方法对芯片捕获到的细胞进行分析和鉴定，同时验证了纳米颗粒基底对于从全血中特异性捕获罕有细胞的有效性。
【附图说明】
[0017]通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。其中在附图中，参考数字之后的字母标记指示多个相同的部件，当泛指这些部件时，将省略其最后的字母标记。在附图中:
图1示出了根据本发明方法一种实施方式的基于生物可兼容Ti02纳米颗粒基底的胎儿有核红细胞捕获方法的操作流程图；
图2示出了根据本发明方法一种实施方式的Ti02纳米颗粒基底芯片的示意图；
图3示出了根据本发明方法一种实施方式的Ti02纳米颗粒基底芯片的实物图；
图4示出了根据本发明方法一种实施方式的Ti02纳米颗粒基底芯片的SEM图；
图5示出了根据本发明方法一种实施方式的Ti02纳米颗粒基底芯片的AFM图；
图6示出了根据本发明方法一种实施方式的修饰抗体后的纳米颗粒基底的示意图；
图7示出了根据本发明方法一种实施方式的利用Ti02纳米颗粒基底芯片从胎儿脐带全血中捕获胎儿有核红细胞细胞的示意图；
图8示出了根据本发明方法利用Ti02纳米颗粒基底芯片对胎儿脐带全血中分离出的单核细胞捕获的明场效果图；
图9示出了根据本发明方法从新鲜脐带血中捕获和鉴定的胎儿有核红细胞的数目。
【具体实施方式】
[0018]本发明提供了许多可应用的创造性概念，该创造性概念可大量的体现于具体的上下文中。在下述本发明实施方式中描述的实施例仅作为本发明的具体实现方式的示例性说明，而不构成对本