康定独活的hplc指纹图谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物质量控制方法技术领域，尤其涉及康定独活的HPLC指纹图谱检 测方法。
【背景技术】
[0002] 康定独活是伞形科独活属植物康定独活Heracleum souliei de Boiss.的干燥 根，由于康定独活与白亮独活的性状类似，通常被认为是藏药白亮独活（珠嘎）的伪品。
[0003] 但是，发明人通过前期的研究发现，在镇痛方面，康定独活表现出显著的疗效，而 白亮独活却没有表现出疗效；在止血方面，康定独活和白亮独活均表现出显著的疗效，但是 白亮独活效果更好。可见，尽管二者性状相似，但是其药效存在明显的差异，如果在临床上 将两者混用，会产生极大的风险。
[0004] 因此，为了防止药物的混用，亟需一种方法监控康定独活的质量并将其与近似品， 尤其是白亮独活区分开来。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种康定独活的HPLC指纹图谱检测方法，它包括 以下步骤：
[0006] (1)对照品溶液的制备：取康定独活药材，粉碎得药材粉末，甲醇超声或回流提 取，过滤，得康定独活对照品溶液；
[0007] (2)参照物溶液的制备：取补骨脂素和佛手柑内酯对照品，混合，加入甲醇，得到 参照物溶液；
[0008] (3)对照指纹图谱的建立：
[0009] 分别取参照物溶液和由不同批次康定独活药材制备得到的对照品溶液，注入高效 液相色谱仪检测，得到各批次药材和参照物的色谱数据；色谱条件如下：
[0010] 检测器：紫外检测器；
[0011] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料；
[0012] 流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇或乙腈；
[0013] 梯度洗脱程序如下：
[0014]
[0015] 对所得色谱数据进行处理，建立康定独活的对照指纹图谱；
[0016] (4)供试品溶液的制备：取待测药材，按照步骤（1)相同的方法制备得到供试品溶 液；
[0017] (5)按照步骤⑶相同的色谱条件，将供试品溶液注入高效液相色谱仪检测，将所 得色谱图与对照指纹图谱进行比对，可鉴别出康定独活及其质量状况。
[0018] 优选地，所述超声提取是在将药材粉末冷浸于甲醇30min后进行的。
[0019] 优选地步骤（1)中，所述药材与甲醇的重量体积比为I :60g/mL。
[0020] 优选地所述紫外检测器的检测波长为309nm。
[0021] 优选地所述色谱柱为Diamonil C18色谱柱，长度为250mm，内径为4. 6mm，填料的粒 径为5 μπι。
[0022] 优选地所述色谱条件的柱温为20_40°C，优选30°C。
[0023] 优选地所述色谱条件的流速为0. 8-1. 2mL/min，优选1.0 mL/min。
[0024] 优选地，所述对照指纹图谱如图3所示。
[0025] 本发明还提供了一种测定康定独活中补骨脂素和佛手柑内酯的方法，其特征在 于：它包括以下步骤：
[0026] a、补骨脂素和佛手柑内酯标准曲线的建立：
[0027] 取补骨脂素和佛手柑内酯混合对照品溶液，按照权上述检测方法中步骤（3)相同 的色谱条件检测，得到补骨脂素和佛手柑内酯的标准曲线；
[0028] b、取康定独活药材，按照上述检测方法中步骤（1)相同的方法，制备得到供试品 溶液，注入高效液相色谱，以步骤a相同的色谱条件检测，根据步骤a的标准曲线得到康定 独活药材中补骨脂素和佛手柑内酯的含量。
[0029] 本发明通过选定特定的参照物，并经过提取方法和色谱条件的大量筛选，最终得 到了本发明康定独活的HPLC指纹图谱检测方法。本发明的指纹图谱出峰多，分离度良好， 重复性好，精密度高，为全面监控康定独活质量提供了有效保障。
[0030] 同时，利用本发明指纹图谱检测方法的提取方法和色谱条件，还可以并测得康定 独活中两种活性成分补骨脂素和佛手柑内酯的含量，从而可以从更多的角度来控制康定独 活的质量。
[0031] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0032] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0033] 图1为1-10批康定独活样品的HPLC指纹图谱，分别为S1-S10。
[0034] 图2为参照物的HPLC色谱图，1为补骨脂素峰，2为佛手柑内酯峰。
[0035] 图3为康定独活的对照指纹图谱，2为补骨脂素峰，4为佛手柑内酯峰。
[0036] 图4康定独活的HPLC-3D图。
[0037] 图5为四种梯度洗脱方式的HPLC谱图，Sl为梯度1，S2为梯度2, S3为梯度3, S4 为梯度4。
[0038] 图6为不同浓度的甲醇提取的HPLC谱图，SI :20%甲醇，S2 :40%甲醇，S3 :60%甲 醇，S4 :80%甲醇，S5 :甲醇。
[0039] 图7为不同冷浸时间的HPLC谱图，Sl :不冷浸；S2 :冷浸30min ;S3 :冷浸60min。
[0040] 图8为不同超声时间的HPLC谱图，SI :超声30min ;S2 :超声60min ;S3 :超声 90min〇
[0041] 图 9 为不同料液比的 HPLC 谱图，SI :1:20 ;S2 :1:40 ;S3 :1:60 ;S4:1:80。
[0042] 图10为佛手柑内酯的标准曲线，横坐标的质量单位为mg。
[0043] 图11为补骨脂素的标准曲线，横坐标的质量单位为mg。
【具体实施方式】
[0044] 实验材料：康定独活药材样品产地见表1，1-10批均已过三号筛，备用。
[0045] 仪器及试剂：BP121S型电子分析天平（万分之一，Sartorius德国赛多利斯股 份公司），BP21ID型电子分析天平（十万分之一，Sartorius德国赛多利斯股份公司）， Agilengtl200型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），HPLC色谱柱（Diamonsil? C18, 250X4. 6mm，5ym)(美国迪马公司），KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公 司），DZG-6090型真空干燥箱（上海森信实验仪器有限公司），DZKW-4型电子恒温水浴锅 (北京中兴伟业仪器有限公司），药典筛（上虞市道墟化验仪器设备厂）；佛手柑内酯对照 品（批号：MUST-14032211，纯度3 98%，成都曼思特生物科技有限公司）、补骨脂素对照品 (批号130739-201115,纯度兰95%，中国药品生物制品检定所），甲醇（色谱纯，fisher)、 水为乐百氏纯净水，其余试剂均为分析纯。
[0046] 表1康定独活药材样品产地
[0047]
[0048] 实施例1本发明康定独活的HPLC指纹图谱检测方法
[0049] (1)对照品溶液的制备：精密称取康定独活药材粉末0. 5g，置于50mL锥形瓶中，加 甲醇30mL，冷浸60min后称重，超声（功率200W，频率40KHZ) 30min，取出，放冷，补重，取上 清液过0. 45 μ m微孔滤膜，作为对照品溶液；
[0050] (2)参照物溶液的制备：精密称取补骨脂素对照品和佛手柑内酯对照品适量，混 合，用IOmL容量瓶定容，制成补骨脂素和佛手柑内酯浓度分别为0. 086mg/mL和0. 358mg/mL 的甲醇溶液，作为参照物溶液；
[0051] ⑶对照指纹图谱的建立：
[0052] 分别取由1-10批次康定独活药材制备得到的对照品溶液和参照物溶液，注入高 效液相色谱仪检测，得到各批次药材和参照物的色谱数据，采用"中药色谱指纹图谱相似度 评价系统（2004A) "软件进行指纹图谱分析，结果分别如图1和图2所示；
[0053] 色谱条件如下：采用Diamonil C18色谱柱（250X4. 6mm，5 μ m)，流动相为A为水， 流动相B为甲醇，柱温为30°C，流速为lmL/min，检测波长为309nm，检视时间50min，进样量 20 μ L0
[0054] 梯度洗脱：45 % B 保持 5min、45 % -60 % B 保持 5min、60 % -73 % B 保持 25min， 73% -80% B 保持 5min，80% B 保持 IOmin，即：
[0055]
[0056] 比较10批康定独活HPLC指纹图谱给出的相关参数，去除部分色谱分离度较差的 色谱峰，确定7个峰作为特征峰组成其对照指纹图谱，结果如图3所示。经与参照品比对可 知：2、4号峰分别为补骨脂素、佛手柑内酯。
[0057] (4)供试品溶液的制备：取待测药材，按照步骤⑴相同的方法制备得到供试品溶 液；
[0058] (5)按照步骤⑶相同的色谱条件，将供试品溶液注入高效液相色谱仪检测，将所 得色谱图与对照指纹图谱进行比对，可鉴别出康定独活及其质量状况。
[0059] 实施例2本发明检测方法的条件筛选和方法学考察
[0060] 本实施例下的供试品选自表1中的康定独活药材。
[0061] 1色谱条件
[0062] 采用Diamonil C18色谱柱（250X4. 6mm，5ym)，流动相为A为水，流动相B为甲醇， 柱温为30°C，流速为lmL/min，检测波长为309nm，检视时间50min，进样量20 yL。梯度洗 脱：45% B 保持 5min、45% -60% B 保持 5min、60% -73% B 保持 25min，73% -80% B 保持 5min，80% B 保持 IOmin，即：
[0063] LlN 丄U010i5d04 A i ^ 0/丄 J JM
[0064] I. I检测波长的选择
[0065] 采用二极管阵列检测器，对供试品溶液进行全波长扫描，比较各波长下HPLC-3D 图，结果如图4所示。
[0066] 结果显示，在309nm处，峰较多，能较全面反映康定独活的化学成分信息，且峰强 度较大，因此选择309nm为康定独活HPLC指纹图谱的检测波长。
[0067] 1.2流动相的选择
[0068] 供试品的提取：精密称取康定独活粉末（过3号筛）0. 5g，置于50mL锥形瓶中， 加甲醇30mL，称重，超声（功率200W，频率40KHZ)30min，取出，放冷，补重。取上清液过 0. 45 μ m微孔滤膜，作为供试品溶液。
[0069] 条件考察：分别考察流动相甲醇-7K、乙腈-7K，以浓度5%~95%洗脱60min。结 果表明两种流动相出峰数及峰强度相差无几，出于市售价格的考虑，故选用甲醇-水作为 流动相。
[0070] 1. 3洗脱梯度条件的选择
[0071] 供试品的提取：同1.2。
[0072] 条件考察：采用Diamonil C18色谱柱（250X4. 6mm，5 μ m)，流动相为A为水，B为 甲醇，采用梯度洗脱方式，考察了 4个条件，洗脱方式见表2,结果如图5所示。
[0073] 表2康定独活4种梯度洗脱方式
[0074]
[0075] 结果表明，以S4即梯度4分离为最佳，各主要峰基线达到分离，且峰形好，分离度 高，故以梯度4作为康定独活的梯度洗脱条件。
[0076] 1. 4供试品的制备条件筛选
[0077] 精密称取康定独活药材粉末0. 5g，置于50mL锥形瓶中，加甲醇30mL，冷浸60min 后称重，超声（功率200W，频率40KHZ) 30