一种全量程c反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，具体来说涉及一种全量程C 反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP)由肝细胞合成，在胎儿期产生，非母体胎 盘传递。其产生机理是：当机体受感染或组织受损伤时巨噬细胞和其他白细胞等被激活，产 生白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-l(IL-l)、肿瘤坏死因子（TNF-a)等细胞因子及其他 介导物，这些细胞因子和介导物到达肝脏，刺激肝细胞和上皮细胞合成CRP。C反应蛋白因 检测方法灵敏度的不同，可分为普通CRP、超敏CRP (hs-CRP)、全量程CRP。普通CRP临床上 主要用于评价感染、组织损伤和炎症性疾病，同时为炎症性疾病的诊断提供数据支持，也为 疾病的治疗和监控提供了诊疗信息。超敏CRP是诊断低水平炎症状态的灵敏指标，同时血 清hs-CRP水平与动脉粥样硬化及急性脑梗死（ACI)等心脑血管疾病的发生、严重程度及预 后也密切相关。全量程CRP可用于评估疾病活动性和疗效监控，也可用于预示健康人未来 发生心血管疾病的概率，还可用于评价疾病感染的程度。
[0003] 所谓全量程CRP是基于其测定方法更敏感，测定范围更宽广而命名。临床常规测 定CRP的方法为免疫比浊法，测定范围一般为3~200mg/L，但存在灵敏度相对较低，无法准 确测定3mg/L以下水平的CRP含量，因此，无法作为心血管疾病的危险指标，预测健康人将 来心血管疾病发生的危险性。临床超敏CRP测定范围为0. 3~100mg/L，测定范围又相对较 窄，无法准确测定高浓度水平的CRP含量，因此，无法用于感染性疾病的诊断或疗效观察。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为克服现有技术的上述不足，本发明提供一种既可以测定高浓度CRP 含量、又可以测定低浓度CRP含量、且灵敏度高、稳定性强、线性范围宽、重复性好、价格便 宜的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。
[0005] 技术手段：为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：一种全量程C反应蛋白胶 乳增强免疫比浊检测试剂盒，该试剂盒包含试剂RU试剂R2,所述的试剂Rl为磷酸盐缓冲 溶液；所述的试剂R2为两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别与大鼠抗人CRP抗体及小 鼠抗人CRP抗体交联形成的偶联物（包括平均粒径较大的羧基化聚苯乙烯胶乳和平均粒径 较大的羧基化聚苯乙烯胶乳）。
[0006] 其中，所述的两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别为平均粒径范围为 0·2μηι~3μηι的苯乙;)?胶乳Sl和0· 005 μ m~0· 2 μ m白勺苯乙;)?胶乳S2〇本发明戶斤述的 不同粒径的羧基化聚苯乙稀胶乳，其平均粒径在〇. 005 μπι~3 μπι之间，粒径小于0. 005 μπι 时，胶乳颗粒聚集产生的吸光度变化很小，结果很难实现试验敏感度的要求，且制备较为复 杂，延长了生产时间，增加了试剂的生产成本且不利于重复性，但当粒径大于3 μπι的胶乳 颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的吸光度变化超过了检测限，而且颗粒较大会加 速自聚集，分散性降低。
[0007] 本发明不同平均粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳中，平均粒径较小的羧基化聚苯乙烯 胶乳颗粒的粒径优先在〇. 008 μπι~0. 2 μπι之间选择，更为优选地，粒径范围为0. 08 μπι，以 保证所制备的检测试剂盒使得抗原抗体反应试验能够在一个较宽的范围内进行，并且能够 延长时间稳定。本发明中不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳中，平均粒径较大的聚苯乙烯胶 乳颗粒的最佳粒径优选为：〇. 2 μ m~2. 8 μ m之间，更为优选地，粒径为0. 198 μ m。
[0008] 所述的全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒中包含C反应蛋白标准 品，所述C反应蛋白标准品中C反应蛋白含量介于0~500mg/L。
[0009] 所述的试剂 Rl 为包含 4wt%聚乙二醇、0· 5wt% Nacl 和 0· 05wt% TritonX-IOO 的 磷酸盐缓冲液。
[0010] 其中，所述的试剂R2的制备方法如下：
[0011] (1)将大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体按照质量比为3:7~7:3的比例混 合得到抗体混合物，混合后的溶液中，抗体浓度保持在5~20mg/ml ;
[0012] (2)将步骤（1)得到的抗体混合物分别致敏两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶 乳，其中一种羧基化聚苯乙稀胶乳的平均粒径范围为〇. 2 μ m~3 μ m，另一种为0. 005 μπι~ 0. 2 μ m，分别将上述两种致敏的胶乳溶于0. 15Μ、ρΗ7. 4缓冲液中形成试剂A和试剂B，将试 剂A和试剂B混合，混合比例按胶乳的质量浓度小粒径：大粒径在900 :100~999:1之间进 行，得到试剂R2。
[0013] 本发明进一步提出了上述全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒在检 测CRP浓度上的应用。
[0014] 具体地，在使用时，将所述全量程C反应蛋白胶乳增强免疫比浊检测试剂盒与全 自动特定蛋白分析仪联合使用，检测过程样本用量为3 μ 1，检测时间为5min。
[0015] 本发明采用的胶乳增强免疫比浊法，特别之处在于，使用化学交联与共价交联相 结合的方式，使得反应更快，试剂更稳定，灵敏度更高。小粒径胶乳颗粒使试剂具有宽范围， 可以检测高浓度范围内被检测物的含量，而大粒径胶乳颗粒使试剂具有较高的灵敏度，可 以检测到低浓度范围内被检测物的含量。本发明采用两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳 分别与大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体交联形成的偶联物做试剂R2,使得抗原抗体 反应试验从低浓度到高浓度这样一个很宽的范围内有高灵敏度和高准确性，且两种交联方 式的联合使用，使得试剂的稳定性更强，同时适用于全自动特定蛋白分析仪使用。
[0016] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有优点：
[0017] (1)将两种不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳分别与大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人 CRP抗体交联形成的偶联物做试剂R2,使得试剂在保证高灵敏度的同时也保证了宽线性范 围，同时拓宽了试剂的检测范围。普通CRP检测试剂盒仅限于检测3mg/L以上的CRP含量， 不能用于预测将来心血管疾病发生的危险性以及局部感染或小病灶的检测。然而，本发明 的试剂盒不仅可以准确测定3mg/L以下水平的CRP含量，灵敏度可达0. 01mg/L，能够用于 心血管疾病发生的危险性预测以及局部感染或小病灶的检测，而且还可以测定高浓度水平 CRP含量（含量高达500mg/L)，因而能够用于诊断各种感染性和炎症等疾病。
[0018] (2)采用共价键交联与化学交联相结合的抗体包被技术，使得灵敏度有了较大的 提高，检测线性范围也得以扩大，同时提高了试剂的稳定性；
[0019] (3)采用微孔过滤技术取得大小粒径均一的聚苯乙烯胶乳颗粒，使得试剂更稳定， 不易发生自沉，有效的延长了定标有效期、提高了试剂的均一性、提高了反应的准确性和灵 敏度。
【附图说明】
[0020] 图1为胶乳凝集过程随反应时间示意图。
[0021] 图2为胶乳增强免疫比浊检测原理示意图。
【具体实施方式】
[0022] 本试剂盒涉及的主要原材料如下：
[0023] 大鼠抗人CRP抗体（货号：N0501194)，小鼠抗人CRP抗体（货号：N0501195)、苯乙 烯胶乳（JSR 货号：P0014、P0113)、PEG (聚乙二醇）。
[0024] 本发明主要试剂的配制方案如下：
[0025] 试剂 Rl :4% PEG (聚乙二醇），0· 5% Nacl，0· 05% TritonX-IOO 的磷酸盐缓冲液， 该试剂为无色透明溶液。聚乙二醇是一种敏化剂，可以提高试剂的分析灵敏，氯化钠保持试 剂的电离强度，TritonX-IOO保持胶乳颗粒的分散性，避免胶乳自身凝聚。
[0026] 试剂R2 :用大鼠抗人CRP抗体及小鼠抗人CRP抗体混合后蛋白浓度10mg/ml的混 合液分别致敏粒径为80nm和24