和 稳定性。
[0044] 实施例2 采用酶标板作为抗原、抗体的载体，基于金属离子特异响应的巧光检测法在肝癌病人 和非肝癌病人血清样本检测中的应用（可参考图1 )，其各步骤的内容基本同实施例1。实施 例2与实施例1所不同的是： 酶标板1采用96孔透明可拆酶标板，所用抗原3采用肝癌病人和非肝癌病人的血清样 本。
[0045] 步骤（4)W肝癌病人和非肝癌病人血清样本为例进行免疫检测 步骤（4)①、②、④、⑥的内容同实施例1。
[0046] 步骤（4)③用憐酸盐吐溫缓冲液（PBST)清洗步骤（2)的酶标板101S至五次，加 入100yL用憐酸盐缓冲液稀释100倍的肝癌病人和非肝癌病人的血清样本，在37°C条件下 培养1小时。
[0047] 检测实施例2中巧光强度的表征意义 (1)阳性样本一一肝癌病人的血清样本，由于其甲胎蛋白含量较高，显示较强的巧光。 而阴性样本一一非肝癌病人的血清样本，由于甲胎蛋白含量较少，巧光强度非常弱。
[0048] (2)通过与甲胎蛋白浓度的标准曲线进行比对，本发明能够更加方便、准确地检测 到每一例待测血清样本中甲胎蛋白的含量。
[0049] (3)实施例2证明：在免疫吸附试验中，通过不同浓度银纳米粒子引起的检测液巧 光强度的变化，能实现临床样本的检测，但检测的稳定性较差。
[0050] 实施例3 基于金属离子特异响应的巧光检测法在甲胎蛋白（AFP)检测中的应用（参见图2)，应 用中，采用磁珠102作为抗原、抗体的载体。所述磁珠102包括直径50~500nm氨基磁珠、 簇基磁珠、环氧基磁珠W及链霉亲和素磁珠，采用的包被抗体2为单克隆AFP抗体，采用的 抗原3为AFP抗原，采用的银标抗体为用银纳米颗粒5标记的多克隆AFP抗体4,采用的金 属离子巧光分子检测液为含有银离子巧光分子6的巧光检测液。
[0051] 首先，将包被抗体2通过化学反应连接在磁珠102上。
[0052] 然后，将包被抗体2修饰的磁珠102与抗原3结合，并进一步与由标记抗体4与银 纳米颗粒5相连接而得到的银标抗体相连接。
[0053] 第三通过银纳米颗粒5与抗原3的对应关系，越多的抗原3能结合更多的银纳米 颗粒5,可通过银纳米颗粒5实现对抗原3的标记及信号的放大。
[0054] 最后，向标记好银纳米颗粒5的磁珠102中加入银离子巧光检测液(银离子巧光分 子6)， 通过测试银离子巧光检测液的巧光强度能定量出体系中银纳米颗粒5的多少，并最终 实现对抗原3的检测。
[0055] 其具体操作步骤为(结合图2进行说明）： (一）磁珠102的制备氨基磁珠为例） ①取100yL氨基修饰磁珠102转移到1血离屯、管中，磁吸去除上清液，用200yL憐酸 盐缓冲溶液（PBS) (50mM，pH=7. 4)洗涂2次，然后移除上清液。
[0056] ②将新鲜配制的100yL戊二醒溶液（5~20%)加入到步骤(一)①的离屯、管中，縱 满混匀使磁珠102充分悬浮，用锡锥纸包裹离屯、管后在25°C条件下反应1~化，期间应保 持磁珠102处于悬浮状态。
[0057] ③向步骤(一）②装有磁珠102的离屯、管中加入50~200yg生物配体(合适用量 及浓度需要根据具体实验进行优化，保持溶液的抑> 8. 0,可加入0. 01~0. 05%的表面活 性剂（Tween20)W提高磁珠102的分散性)，轻摇至混匀。
[0058] ④将步骤(一）③装有磁珠102的离屯、管用锡锥纸包裹后置于溫度25°C的恒溫箱 中偶联3~1化；在偶联期间保持磁珠102处于悬浮状态。
[0059] ⑥将步骤(一）④的离屯、管置于磁性分离架上磁性分离去除上清液，加入200yL 牛血清白蛋白（BSA)与憐酸盐缓冲溶液（pH=7. 2,含2%的BSA)重悬磁珠102,25°C条件下反 应1小时，封闭磁珠102表面的非特异性吸附位点；在该期间应保持磁珠102的悬浮状态。
[0060] 将装有磁珠102的离屯、管置于磁分离架上磁性分离去除上清液，每次用200yL 牛血清白蛋白（BSA)溶液（pH=7. 2)洗涂3次W上，重新悬浮于保存液中（可根据需要来确定 保存溶液的加入量，W调整磁珠102的浓度)，于4°C条件下保存备用。
[0061] 注：簇基磁珠102的制备步骤基本与氨基磁珠102的制备步骤相同，簇基磁珠102 的制备所不同的是： (1)①取100yL簇基磁珠102转移到1血离屯、管中，磁吸去除上清液，用200yL1-径 基咪挫盐酸缓冲液（0. 2M，pH=7. 0)冲洗2次，然后移除上清液。
[00間（1)②向步骤（1)①的离屯、管中加入50化0. 1~1.0MN，N-径基班巧酷亚胺 (N服）水溶液和50yL0. 1~1. 0M1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐巧DC) 水溶液，縱满混匀使磁珠102充分悬浮，用锡锥纸包裹离屯、管后在37°C条件下反应5~ 2地，期间应保持磁珠102处于悬浮状态。
[0063] 注：环氧基磁珠102W及链霉亲和素磁珠102的制备步骤也基本与氨基磁珠102 的制备步骤相同，环氧基磁珠102W及链霉亲和素磁珠102的制备步骤有不同的是，不需要 (1)②步骤的操作，其他步骤相同。
[0064] (2)制备银离子巧光检测液（同实施例1)。
[0065] ( 3 )制备银标抗体（同时实施例1)。
[0066] 注：W上各步骤可一并做，也可W分开做，是为进行巧光检测的前序部分或者准备 部分。
[0067] (4)W甲胎蛋白（AFP)为例进行免疫检测 ①取AFP的单克隆包被抗体2修饰的磁珠102 15化（lOmg/mL)放到100yL离屯、管 中，用牛血清白蛋白（BSA)溶液洗涂1~2次后加入不同浓度的AFP3,在37°C条件下解育 1~化；期间应利用垂直混合仪进行颠倒混匀，保持磁珠102的悬浮状态。
[006引②用憐酸盐缓冲溶液（PBS)清洗步骤（4)①的磁珠102 -至二次，加入100~ 200yL步骤（3)制备的银标抗体，在37°C条件下解育1~化。
[0069] ③用憐酸盐缓冲溶液（PBS)清洗步骤（4)②的磁珠102 -至二次，加入100yL步 骤（2)制备的银离子巧光检测液，37°C静置30min后通过巧光光谱仪进行巧光测试。
[0070] 检测实施例3中巧光强度的表征意义 (1)当甲胎蛋白浓度较高时，结合相应量的银标抗体，加入双氧水腐蚀后产生较高浓度 的银离子，从而会促使较多的银离子巧光分子发生反应，检测液会产生较强的巧光。
[0071] (2)当甲胎蛋白浓度较低或者浓度为0时，当甲胎蛋白浓度较低或者浓度为0时， 产生的银离子浓度响应较低或者不产生银离子，从而只有较少量的银离子巧光分子发生反 应或者没有银离子巧光分子发生反应，银离子巧光检测液的巧光强度也相对较弱或者是没 有巧光。
[0072] (3)因此，本发明能利用银标抗体在对甲胎蛋白（AFP)的检测中实现用巧光法检测 甲胎蛋白。
[007引实施例4 基于金属离子特异响应的巧光检测法在肝癌病人和非肝癌病人血清样本检测中的应 用（参见图2)，应用中，采用磁珠102作为抗原、抗体的载体，其步骤基本同实施例3。
[0074] 实施例4与实施例3所不同的是：实施例4步骤（4)的基本内容为： (4)W肝癌病人和非肝癌病人血清样本为例进行免疫检测 ①取AFP的单克隆包被抗体2修饰的磁珠102 15yL(lOmg/mL)放到100yL离屯、管 中，用憐酸盐缓冲溶液（PBS)洗涂1~2次后加入100yL用憐酸盐缓冲溶液（PBS)稀释100 倍的肝癌病人和非肝癌病人的血清样本，在37°C条件下解育1~化；期间应利用垂直混合 仪进行颠倒混匀，保持磁珠102的悬浮状态。
[00巧]步骤（4)②和③的内容同实施例3。
[0076] 检测实施例4中巧光强度的表征意义 (1)阳性样本一一肝癌病人的血清样本，由于其甲胎蛋白含量较高，显示较强的巧光； 而阴性样本一一非肝癌病人的血清样本，由于甲胎蛋白含量较少，巧光强度非常弱。
[0077] (2)通过与甲胎蛋白浓度的标准曲线进行比对，本发明能够更加方便、准确地检测 到每一例待测血清样本中甲胎蛋白的含量。
[0078] (3)实施例4证明：在免疫吸附试验中，通过不同浓度银纳米粒子引起的探针溶液 巧光强度的变化，能实现临床样本的检测，而且检测方便易行，准确率高，稳定性好。
【主权项】
1. 基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光检测法为利用金属离子促使荧 光分子结构发生改变，使所述荧光分子产生一个从无到有的荧光变化，所述荧光变化的强 度能通过荧光光谱仪直接判断和测量。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荧光分子含有金属纳米颗粒，所述金 属纳米颗粒能通过化学反应产生金属离子，所述金属离子与免疫检测中的反应物结合在一 起能引起金属离子荧光强度发生变化，且不同浓度金属离子引起的荧光强度的变化程度是 不同的，用荧光光谱仪对荧光强度的变化进行测量便能实现对待测样品的定量检测。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在基于金属离子特异响应的荧光检测中 采用磁珠作为抗原、抗体的载体。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述磁珠采用活化试剂进行活化，经活化 后的磁珠能与抗原、抗体相结合，进而实现对抗原和抗体的负载。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述活化试剂为采用戊二醛或者水溶性 的碳二亚胺缩合剂。
【专利摘要】本发明基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用，是将传统的金属离子荧光检测方法与金属纳米标记免疫技术相结合并应用于免疫检测中，它解决了传统荧光分子与生物蛋白分子连接困难的问题，实现了对检测信号的有效放大，解决了酶催化反应对实验条件要求苛刻而产生的问题；本发明在免疫检测中采用磁珠作为抗原、抗体的载体，能实现对待测样品的快速分离，使检测过程更简便快速，使检测的准确性、灵敏度都有很大的提高；本发明利用化学反应代替传统的酶催化过程并将荧光检测方法引入生物免疫检测，缩短了反应时间，提高了体系的稳定性，降低了检测成本，可在免疫分析检测及临床研究中发挥重要作用。
【IPC分类】G01N33/533, G01N33/543
【公开号】CN105181956
【申请号】CN201510638224
【发明人】龙亿涛, 赵立军, 马巍, 韩焕兴, 于汝佳
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月30日