所述方法通过进一步的试验，得出的最小检测限为0.03ng/mL，检测范围为 0.0lng/mL-lOOOng/mL，批间 CV 小于 10%，批内 CV 小于 4% 0
[0073]实施例2:碱性磷酸酶-金刚烷(ALP-AMPPD)系统用于降钙素原的检测
[0074]1.微流控芯片的制作
[0075]I)抗体标记:i)酶标抗体:2.5mg ALP (50IU/mg)，加入200uL含1.25%戊二醛的10mM的PB (pH6.8)，混匀，室温反应过夜；4°C条件下，电磁搅动，透析至50mM PBS (pH7.2)，12小时，换液4次；1.5mg降钙素原抗体溶于10uL IM的碳酸盐溶液(pH 9.0);将活化的AP加入配好的蛋白质液体中，混匀，4°C条件下反应24小时，加入10 μ L 200mM的赖氨酸溶液，混匀，22°C条件下反应2小时；4°C条件下透析至50mM PBS (pH7.2)，12小时，换液4次；离心，取上清，用50mM TB7.4+0.6% BSA+0.05%他队稀释至试验所需浓度，_20°C保存。ii)磁标抗体:准确移取50 μ L浓度为lmg/mL的链霉亲和素标记磁珠，于2mL离心管中，涡旋震荡30min ;再加入200 μ L浓度为3mg/mL的生物素化PCT单克隆抗体，混合均匀，于37°C在摇床中反应2小时。将反应混合物在磁性分离器进行分离，除去上清液，用0.0lM PBS (含0.01% BSA/0.2%吐温-20，pH 7.4)重复清洗3次。最后将磁珠悬浮于0.0lM PBS (含0.1% BSA)至最终指定浓度。
[0076]2)磁标抗体的包被:采用点样仪或喷点仪将10 μ L lmg/mL磁标抗体溶液滴加在微流控芯片的反应池中，室温干燥30min以上。
[0077]3)微流控芯片的组装:将10 μ L浓度为5mg/mL的HRP，300 μ L清洗液，200 μ L发光试剂分别封装在芯片的对应存储池，同时将其他部件进行组装，形成一个完整的微流控芯片。
[0078]2.降钙素原的定量检测
[0079]I)标准曲线的制作:将PCT标准品用小牛血清稀释，配成浓度一些列浓度为Ong/mL, 5ng/mL，20ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL, 300ng/mL 的降|丐素原标准品各 150 μ L，取 30 μ L加入本发明实施例中制备的微流控芯片测试卡的加样区，盖上血液盖，将试剂盒置于配套的小型设备中，放置15min。每个样本分别重复测定3次。配套仪器根据RLU和PCT浓度间的比例关系，自动拟合计算出PCT浓度，取三次测定平均值，绘制标准曲线。
[0080]2)取待检样本200 μ L，置于本发明实施例中所制作的微流控芯片中进行检测，每次取样30 μ L，重复测定3次，根据I中绘制的标准曲线即可获得待检样品中降钙素原的浓度值。
[0081]3)结果表明:采用本发明所述方法通过进一步的试验，检测灵敏度为0.006ng/mL,检测范围为0.001ng/mL-2000ng/mL，批间CV小于5 %，批内CV小于1.5 %，且未出现HOOK效应，无需对检测样本进行稀释处理。
[0082]实施例3:磁微粒颗粒尺寸筛选
[0083]磁性微球的粒径小，比表面积大，表面含有活性基团，故偶联容量大，但磁颗粒尺寸过小不利于磁铁收集，故进行磁微粒尺寸筛选。
[0084]其他的实验条件参见实施例2，磁微粒颗粒的尺寸按照以下方案进行。
[0085]选择颗粒尺寸分别为0.1 μ m、0.5 μ m、2 μ m、2.2 μ m、3 μ m、10 μ m磁颗粒标记抗C反应蛋白抗体。检测时采用磁性大小经过优选的永磁铁，固定磁铁高度。
[0086]实验结果如下:
[0087]磁微粒粒径尺寸从0.1 μ m、0.5 μ m、2 μ m、2.2 μ m、3 μ m依次增强，3 μ m干扰加大，
10 μm开始减小，信号值最低，综合各因素2.2 μm信号最强，干扰最小。
[0088]结果分析:磁微粒尺寸较小时，比表面积较大，表面所负载的生物分子量大，同时能够很好地分散在溶液中，但要保证磁性微球充分被收集所需的磁场强度大。在本实施例中由于磁珠所受的磁场力不能保证其充分被收集，导致部分有效磁珠在清洗过程中流失，从而导致最终检测信号值不高。当磁颗粒粒径较大时，比表面积小，表面生物分子的标记率相对较低，相同条件下，磁性粒子所受磁场力大，分散的磁珠能够得到充分的收集，但其由于极易发生沉降，导致生物分子间反应不充分，从而减弱发光信号。综合考虑，粒径为I?3 μ m磁性微球效果较好，因此本发明的实施例中2.2 μ m的磁性微球效果最好。
[0089]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种降钙素原定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片结构主要包括盖片(I)和底片(11)，其中盖片(I)上的空气栗(3)，气流微通道(5)，加样口(2)、样本液流通道￠)、第一生物标记物存储池(4)、微混合器(7)以及过渡区(10)依次连接；底片(11)上的过滤器(12)，反应池(13)，清洗池(14)，检测池(15)，溶液释放通道(18)依次连接；检测池(15)通过溶液释放通道(18)与清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)连接；第一生物标记物存储池(4)存储预封装酶或发光剂标记的抗降钙素原抗体溶液；反应池(13)存储预封装磁颗粒标记的抗降钙素原抗体；所述清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)存储预封装清洗液和发光基底液；盖片(I)过渡区(10)和底片(11)过滤区(10)连接；所述标记配体存储池(5)、清洗液存储池(9)、发光基底液存储池(10)为液体密封池，可通过外力挤压而局部破裂，释放液体；过滤器(12)由腔体和滤血膜组成；所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集。2.如权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述第一生物标记物存储池(4)、清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)为液囊或腔体，体积为10?500 μ I。3.如权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的微混合器是宽度为20?300 μ m，深度为10?100 μ m的蛇形，折线形或方形结构。4.如权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的反应池为毛细管微通道，该毛细管微通道为管状通道或矩形通道，允许微液体流进或通过。5.如权利要求4所述微流控芯片，其特征在于，所述反应池为管状通道，直径为0.5?1mm06.如权利要求4所述微流控芯片，其特征在于，所述反应池为矩形通道，宽为0.1?5臟，深度为0.01?2臟，长为5?40mm η7.如权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述发光基底液包含与酶对应的底物及发光增强剂，可混合后注入同一个发光液存储池，或分别注入两个不同的发光液存储池；所述磁颗粒标记的抗降钙素原抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，为顺磁性的Fe3O4或γ -Fe2O3化合物，磁颗粒粒径为0.1?10 μ m。8.如权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片进行样品测定主要包括如下操作: 步骤I)从加样口加入样本，盖上血液盖，将微流控芯片放入配套仪器中，从第一生物标记物存储池释放酶或发光剂标记抗降钙素原抗体后，按压空气栗使样本和酶标抗体混合均匀且发生化学反应，形成一种免疫复合物，然后流入底片过滤器中； 步骤2)样本经过滤器后，到达反应池，复溶包被在该区域的磁颗粒标记抗降钙素原抗体，且与之发生反应，外部磁铁以一定的方式在微流控芯片的运动滑槽上发上相对运动，收集磁颗粒并将磁颗粒转移至清洗池，系统释放清洗液，磁颗粒经充分洗涤后，在磁铁作用下转移至检测池，系统释放发光基底液，根据相对发光强度(RLU)与降钙素原抗原浓度间的比例关系，检测系统可自动换算，可快速报告测试结果，从而实现降钙素原的定量检测。9.如权利要求8所述的一种降钙素原定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，步骤I)所述配套仪器为小型便携设备，所述设备主要包括控制装置和检测装置。10.如权利要求8所述的一种降钙素原定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述配套小型便携设备的控制装置主要作用为对放置其内部的微流控芯片可实施包含控制液体流动，样本混合，释放存储池内试剂，磁铁移动等，检测装置的主要作用为采集发光信号并对其进行分析，最终显示检测结果。
【专利摘要】本发明公开了一种降钙素原定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，其结构主要包括盖片(1)和底片(11)，其中盖片(1)上的空气泵(3)，气流微通道(5)，加样口(2)、样本液流通道(6)、第一生物标记物存储池(4)、微混合器(7)以及过渡区(10)依次连接；底片(11)上的过滤器(12)，反应池(13)，清洗池(14)，检测池(15)，溶液释放通道(18)依次连接；检测池(15)通过溶液释放通道(18)与清洗液存储池(16)和发光液存储池(17)连接。
【IPC分类】G01N33/68, B01L3/00
【公开号】CN105203775
【申请号】CN201510695902
【发明人】范玉霞, 李泉
【申请人】深圳华迈兴微医疗科技有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月26日