抗体滴加在修饰电极表面，抗体以共价交联的方式固定在壳聚糖-纳米金复合物膜表面。
[0040]实验证明，采用本发明方法制备的壳聚糖-纳米金复合物膜，其电流响应比单独沉积壳聚糖或纳米金具有更好的一致性和稳定性。此外，壳聚糖-纳米金复合物膜良好的生物相容性可增强黄曲霉毒素抗体的有效固定，并有利于保持抗体活性。
[0041]需要说明的是，采用本发明方法制备的壳聚糖-纳米金复合物膜具有一定的普适性，鉴于抗体及酶等生物分子结构上均具有一定数量的羧基结合位点，所以该壳聚糖-纳米金复合物膜适合固定抗体、酶等生物分子，可用于不同靶标物质的检测，而不局限于固定黄曲霉毒素抗体，用于黄曲霉毒素的检测。
[0042]下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但实施例不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0043]实施例1
[0044]将0.5g壳聚糖溶于100mL 0.1M的乙酸溶液中，室温下水浴超声3h后过滤得到0.5%壳聚糖溶液，用1M NaOH调节pH至5。壳聚糖溶液与相同pH值的氯金酸溶液混合得到沉积液，沉积液中壳聚糖和氯金酸的质量体积百分比浓度分别为0.1 %和0.06%。
[0045]将金微电极用氧等离子体刻蚀机清洁，然后浸入0.5M稀硫酸中，在0?1.5V进行循环伏安扫描直至特征曲线稳定重合。用去离子水清洗电极，吹干，得到洁净的金微电极，再将电极浸入沉积液中，采用计时电流法在-1.1V下沉积300s，去离子水清洗电极，室温下自然干燥，制得壳聚糖-纳米金复合物膜。用EDC: NHS摩尔比4:1的混合溶液活化黄曲霉毒素&单克隆抗体的羧基，滴加在壳聚糖-纳米金复合物膜修饰的电极表面，4°C温育3h，PBS溶液清洗，滴加5mg/mL的牛血清蛋白，4°C温育lh，清洗，浸泡在PBS溶液中4°C保存，用于检测黄曲霉毒素。
[0046]扫描电子显微镜(SEM)下的裸金电极和采用本实施例方法制备的壳聚糖-纳米金修饰膜的表面形貌图分别见图3A和图3B。可见，相比图3A所示的裸金电极的表面形貌，壳聚糖-纳米金复合物膜(图3B)呈疏松多孔结构，粒径均一(约10nm)的纳米金均匀分散在膜的内部和表面，说明壳聚糖-纳米金已经成功修饰在金微电极表面。
[0047]电化学生物传感器的响应电流与黄曲霉毒素Βι浓度的分段线性标准曲线见图4A和图4B，说明制备的电化学生物传感器在0.1?lyg/kg和1?20yg/kg的浓度范围内呈现良好的分段线性。其中，图4A所示的线性范围为0.1?lyg/kg，线性拟合公式为y = l.4611-
0.485 lx，相关系数为0.9750;图4B所示的线性范围为1?20yg/kg，线性拟合公式为y =
0.9762-0.0239x，相关系数为0.9576。图中，y为响应电流(μΑ)，χ为黄曲霉毒素Β!的浓度(μg/kg)。
[0048]实施例2
[0049]将0.5g壳聚糖溶于100mL 0.1M的乙酸溶液中，室温下水浴超声3h后过滤得到
0.5%壳聚糖溶液，用1M NaOH调节pH至5。壳聚糖溶液与相同pH值的氯金酸溶液混合得到沉积液，沉积液中壳聚糖和氯金酸的质量体积百分比浓度分别为0.1%和0.045%。
[0050]将金电极用氧等离子体刻蚀机清洁，然后浸入0.5M稀硫酸中，在0?1.5V进行循环伏安扫描直至特征曲线稳定重合。用去离子水清洗电极，吹干，得到洁净的金微电极，再将电极浸入沉积液中，采用循环伏安法在0?-1.5V范围内扫描10圈，去离子水清洗电极，室温下自然干燥，制得壳聚糖-纳米金复合物膜。
[0051]利用本实施例方法制备的壳聚糖-纳米金复合物膜在扫描电子显微镜下的表面形貌图见图5。
[0052]至此，已经结合实施例对本发明进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明壳聚糖-纳米金复合物膜及在其上固定黄曲霉毒素抗体形成用于黄曲霉毒素检测的生物敏感膜的制备方法有了清楚的认识。
[0053]需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，并未进行详细说明。此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换，例如:
[0054](1)电沉积方法可以用计时电位法的形式；
[0055](2)集成在同一电极芯片上的对电极可以用分离的普通棒状金电极或铂电极来代替；
[0056](3)乙酸水溶液可以用盐酸水溶液来代替；
[0057](4)本文可提供包含特定值的参数的示范，但这些参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应值；
[0058](5)上述实施例可基于设计及可靠度的考虑，彼此混合搭配使用或与其他实施例混合搭配使用，即不同实施例中的技术特征可以自由组合形成更多的实施例。
[0059]综上所述，本发明以壳聚糖和氯金酸混合溶液为沉积溶液，在金微电极表面一步式电沉积制备壳聚糖-纳米金复合物膜，得到粒径均一的纳米金均匀分散在膜的内部和表面，实验证明壳聚糖-纳米金复合物膜可以为抗体等生物分子的固定提供相容性好且性能稳定的基底，适用于食品安全中黄曲霉毒素的检测以及生物传感器产业化的实际应用，具有较好的应用前景。
[0060]以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种电化学生物传感器敏感膜的制备方法，其特征在于，包括: 步骤A:将pH值介于4?6之间的壳聚糖溶液与氯金酸溶液以预设比例混合，得到用于电沉积的混合溶液； 步骤B:将电化学生物传感器的电极浸入混合溶液中，采用电沉积方法，在电极表面形成壳聚糖-纳米金复合物膜;以及 步骤C:将用于靶标物质检测的生物分子固定于所述壳聚糖-纳米金复合物膜上。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，所述混合溶液中，壳聚糖的质量体积百分比浓度介于0.05%?0.1%之间，氯金酸的质量体积百分比浓度介于0.03% ?0.06% 之间。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A之前还包括: 将壳聚糖粉末溶解于乙酸水溶液中，过滤不溶物后得到壳聚糖溶液； 将氯金酸粉末溶解于去离子水中，得到氯金酸水溶液。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，电沉积方法为计时电流法或循环伏安法。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于: 当采用计时电流法时，温度为室温，其在-1.1V沉积300s，从而得到壳聚糖-纳米金复合物膜;或者 当采用循环伏安法时，温度为室温，其在0?-1.5V范围内扫描10圈，从而得到壳聚糖-纳米金复合物膜。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，所述电极为微电极，该微电极的面积范围为10—4?1mm2。7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C中，用于靶标物质检测的生物分子为抗体、抗原或酶。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述用于靶标物质检测的生物分子为黄曲霉毒素抗体； 所述步骤C包括:用EDC/HNS活化黄曲霉毒素抗体的羧基，然后将抗体滴加在修饰电极表面，抗体以共价交联的方式固定在壳聚糖-纳米金复合物膜表面。
【专利摘要】本发明提供了一种电化学生物传感器敏感膜的制备方法。该制备方法包括：将酸性的壳聚糖溶液与氯金酸溶液以预设比例混合，得到用于电沉积的混合溶液；将电化学生物传感器的电极浸入混合溶液中，采用一步式电沉积方法，在电极表面形成壳聚糖-纳米金复合物膜；以及将用于靶标物质检测的生物分子固定于壳聚糖-纳米金复合物膜上。本发明采用一步式电沉积方法，简化了壳聚糖-纳米金复合物膜制备步骤，干扰因素引入的概率降低，此外，混合溶液中的壳聚糖可有效避免纳米金在形成和沉积过程中的团聚，使纳米金保持约10nm的均一粒径并且均匀分散在壳聚糖疏松多孔结构的内部和表面，有利于提高抗体等生物分子的固定效率并保持其活性。
【IPC分类】G01N27/327
【公开号】CN105466986
【申请号】CN201510789734
【发明人】夏善红, 马海华, 孙楫舟, 边超, 张元 , 甄彤
【申请人】中国科学院电子学研究所, 河南工业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年11月17日