尿液中修饰核苷的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及液谱质谱联用技术领域，具体而言，涉及一种尿液中修饰核苷的检测 方法。
【背景技术】
[0002] 修饰核苷主要存在于RNA中，是在转录后由特定的甲基转移酶与连接酶作用于多 聚核苷分子而形式。RNA代谢都需要特定的酶来催化，正常核苷酶解后可降解或者磷脂化再 利用，而修饰核苷是正常核苷的糖苷键、碱基、糖羟基被修饰或者两两结合生成的独特性结 构，由于被高度修饰，降解修饰核苷需要的酶活性较高，特异性强，因此，修饰核苷从细胞中 释放出来，最终通过尿液排出。故，尿液中修饰核苷的含量可用来评价人体的核苷代谢状 况。
[0003] 目前，已有报道采用毛细管电泳法对尿液中修饰核苷进行检测，但该方法检测出 的修饰核苷类别少。而且，由于尿液中含有多种微生物。如果长时间以液体形式保存，微生 物就会污染尿液，影响检测结果的准确性，现有的检测方法中都是将待检测尿液取样后存 储于冰箱中冷冻保存，检测时再解冻，不但需要冷冻装置，解冻步骤也使得检测时间变长。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种尿液中修饰核苷的检测方法。针对检测样品易受微生 物污染的缺点，本发明提供的检测方法中将尿液保存于滤纸片上，不但使其稳定性大大提 高，避免微生物的污染，而且还具有简易、方便的优点。
[0006] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0007] 尿液中修饰核苷的检测方法，包括如下步骤：
[0008] (1)尿液预处理后保存于滤纸片上，后通过萃取得到待测样本；
[0009] (2)将所述待测样本通过液质联用检测，得到修饰核苷的种类和含量。
[0010] 本发明提供的检测方法中，通过将尿液保存于滤纸片上再通过萃取过程，运用液 质联用方法，能够快速、有效地对尿液中的修饰核苷进行定性和定量检测。
[0011] 由于将尿液保存于滤纸片上，将尿液样品转换为固体形式进行保存，稳定性大大 提高，从而避免微生物污染检测样品。而且，本发明提供的方法也比现有的冷冻法更为简 易、方便。
[0012] 优选地，步骤（1)中，所述萃取的步骤具体包括:将滤纸片放入甲醇水混合溶液中 经超声、离心后取上清液作为待测样本。
[0013] 本发明提供的检测方法中，为了将保存在滤纸片上的尿液样本充分还原，将滤纸 片放入甲醇水混合溶液中进行超声，使得滤纸片上的各个组分充分溶解到溶液中，后再经 离心得到上清液，将这一上清液作为待测样本。
[0014] 在实际检测过程中，可将保存有尿液的滤纸片打孔，孔径为3_，获得直径为3_的 滤纸圆片，取适量的滤纸圆片置于离心管中，加入甲醇水溶液后进行超声、离心操作。
[0015] 为了保证滤纸片中的各个组分能够充分溶解至溶液中，所用的甲醇水溶液中甲醇 的体积含量为5%-50%，超声时间为20-90min。
[0016] 经超声后，溶液中不但含有修饰核苷，还含有其它固体杂质，影响检测结果的准确 性，为了将杂质尽可能地去除，在本发明提供的检测方法中，将离心的转速控制在10000-18000rpm，时间为5-30min。
[0017]为了保证检测样本的稳定性，步骤(1)中，所述尿液预处理后保存于滤纸片上的步 骤具体包括：向尿液中加入8-溴鸟苷混合后滴于滤纸片上，并风干3小时以上。
[0018] 在上述方法中，加入的8-溴鸟苷作为内标物，用以对修饰核苷进行定量分析。
[0019] 优选地，步骤(2)具体包括：
[0020] (21)称取标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；
[0021] (22)称取内标物，用甲醇水溶液溶解后分别加入所述标准液中，超纯水定容后离 心，取上清液作为待测标准液；
[0022] (23)将所述待测样本和所述待测标准液通过液质联用检测，得到修饰核苷的种类 和含量。
[0023] 本发明提供的检测方法中，采用内标法对尿液中的修饰核苷的含量进行检测。在 检测过程中，称取标准品用甲醇使其完全溶解，得到不同浓度的标准液，向标准液中加入内 标物后经处理得到待测标准液，用以进行液质联用检测，分别以各修饰核苷的峰面积与内 标物峰面积之比对尿样中各修饰核苷的浓度进行线性回归，得到各修饰核苷的线性方程， 用于对尿液中各修饰核苷进行定量分析。
[0024] 为了保证液质联用检测结果的准确性，本发明采用特定的液相条件和质谱条件， 具体的，步骤(23)中，所述液质联用检测的液相条件为:流动相的流速为0.1-1 .OmL/min;进 样量l-20yL;键合相色谱柱;柱温20-40°C; A和B作为流动相，其中A为甲醇水溶液，B为甲酸 甲醇溶液，梯度洗脱程序如表1所示。
[0025] 表1梯度洗脱程序
[0026]
[0027]质谱条件为:采用ESI离子源，正离子MRM扫描，雾化气流速8-20L/min，气帘气流速 8-20L/min，碰撞气流速5-15L/min，离子源电压2000-4000V，离子源温度200-400°C。
[0028] 通过上述液相色谱和质谱检测后，可有效地对尿液中的修饰核苷进行定性和定量 分析。并且，分析速度快，完成一次分析只需13分钟。
[0029] 由于修饰核苷种类多，为了保证能够尽可能地将尿液中的修饰核苷分离，进一步 优选地，所述液相条件中，流动相A为0.1-10%甲醇水溶液，B为0.1-10%甲酸甲醇溶液。
[0030] 基于同样的考虑，所述液相条件中，所述键合相色谱柱为C18/C8色谱柱，规格为 (50_100)mmX (1.8-3)mm，（1 ·8-3)μηι〇
[0031] 优选地，步骤(21)中，所述标准品包括假尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、1-甲基腺苷、尿 嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、1-甲基次黄嘌呤核苷、5-甲基尿苷、黄 嘌呤核苷、3-甲基尿苷、1-甲基鸟苷、6-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、Ν4-乙酰基胞苷和Ν2，Ν2-二 甲基鸟苷。
[0032] 在本发明提供的检测方法中，所用的标准品包含16种，可实现16种修饰核苷的定 性和定量分析，使得检测范围提高。
[0033] 优选地，步骤(22)中，所述内标物为8-溴鸟苷。
[0034] 在本发明提供的检测方法中，选用8-溴鸟苷作为内标物，稳定性好，能够用于对尿 液中的修饰核苷进行定量分析。
[0035] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0036] (1)本发明将尿液保存在滤纸片上，使其稳定性大大提高，避免了微生物对检测样 品的污染，解决了尿液无法长时间保存、运输的问题。
[0037] (2)本发明通过对萃取过程的优化，可使得滤纸片上的各个组分充分溶出，能够还 原检测样品的真实性，使得检测结果的准确性大大提高。
[0038] (3)本发明通过对液质联用检测过程中的液相条件和质谱条件的优化，实现对尿 液中修饰核苷的定性和定量分析，灵敏度高，准确性高，分析速度快。
[0039] (4)本发明提供的检测方法中，采用8-溴鸟苷作为内标物，采用假尿嘧啶核苷、胞 嘧啶核苷、1-甲基腺苷、尿嘧啶核苷(U)、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、1-甲基次 黄噪呤核苷、5-甲基尿苷、黄噪呤核苷、3-甲基尿苷、1-甲基鸟苷、6-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、 Ν4-乙酰基胞苷和Ν2，Ν2-二甲基鸟苷这16中修饰核苷作为标准品，可对尿液中的16种修饰 核苷同时进行定性和定量分析，满足实际检测的需要。
【附图说明】
[0040] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0041] 图1为本发明实施例的检测谱图。
【具体实施方式】
[0042] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售购买获得的常规产品。
[0043] 实施例
[0044] 仪器和材料：
[0045] 美国Agilent公司6495串联质谱仪，Angi lent 1290液相色谱仪，色谱柱为Agilent C18 柱，规格为 50_ X 3.0mm，2.7ym。
[0046] 药品与试剂：
[0047] 标准品：假尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、1-甲基腺苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黄 嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、1-甲基次黄嘌呤核苷、5-甲基尿苷、黄嘌呤核苷、3-甲基尿苷、1-甲 基鸟苷、6-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N4-乙酰基胞苷、N2，N2-二甲基鸟苷，均购买自Sigma-Aldrich 公司。
[0048] 内标物:8_溴鸟苷(8-Br-G)，购买自Sigma-