参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998;METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.ffassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0049] 实施例1电化学免疫传感器的构建
[0050] 一、材料：
[0051 ] 试剂:Ficolin-3、鼠抗人Ficolin-3单克隆抗体、生物素标记羊抗人Ficolin-3多 克隆抗体购自R&D公司；Avidin-HRP、tween_20、BSA(牛血清蛋白）购自Sigma公司；TMB底物 购自NE0GEN公司其中已包含过氧化氢;其他所有试剂购自国药集团。
[0052] 本发明中所用的缓冲溶液包括:0·01Μ PBS缓冲液（0.01M phosphate，pH 7.4， 0.14M NaCl,2.7mM KC1)；Tris-buffered saline(0.02M Trizma base,0.15mM NaCl,PH 7 · 3)含0 · 1 % BSA;电极冲洗液:PBST (0 · 5 % tween-20 in 0 · 01M PBS)和PBS缓冲液；电极封闭 液:0.01M PBS缓冲液内含1%BSA。将重组人Ficolin-3和鼠抗人Ficolin-3单克隆抗体用 PBS缓冲液稀释至lOOyg/mL置于-20°C冰箱冷冻保存;将生物素标记羊抗人Ficolin-3多克 隆抗体用Tris-buff ered saline稀释至100yg/mL置于-20 °C冰箱冷冻保存。Avidin-HRP用 〇. 5 %酪蛋白溶液稀释1000倍。用于电化学检测的溶液是购买的TMB底物溶液（内含H2〇2)。用 于电化学阻抗图谱（EIS)检测液:K 3Fe (CN) 6/K4Fe (CN) 6 (1:1)和0.1M KC1。所有溶液用 Milli-Q水（18.2ΜΩ .cm电阻）配制。
[0053]二、检测仪器
[0054] CHI 760E电化学工作站属于上海辰华仪器公司产品。
[0055] 三、检测原理
[0056] 本发明采用双抗体夹心法检测目标蛋白Ficolin-3。具体的，电化学免疫传感器的 工作电极采用玻碳电极作为基底电极、Ficolin-3单克隆抗体作为捕获分子，Ficolin-3单 克隆抗体通过静电引力吸附于玻碳电极上。检测时，可先用BSA等物质来封闭工作电极上的 非特异性结合位点。然后将含有目标蛋白Ficolin-3的待检测样本加到工作电极上，工作电 极上的捕获分子将会捕获待检测样本中的目标蛋白Ficolin-3。接下来，再将生物素标记 Ficolin-3多克隆抗体(作为信号探针)加到捕获了目标蛋白Ficolin-3的工作电极上，再加 入亲和素修饰的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)，生物素修饰的信号探针可以特异性地与亲 和素修饰的辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)结合。在TMB和过氧化氢(H202)底物存在时，辣根 过氧化物酶催化过氧化氢的还原，产生一个放大的电流信号，电流信号的大小与目的蛋白 Ficolin-3的浓度直接相关。
[0057] 四、工作电极的制备
[0058] (1)玻碳电极表面处理：将直径为3mm的玻碳电极先用金相砂纸抛光，再依次用 0.3、0.05μπι的Al2〇3浆在麂皮上抛光至镜面，每次抛光后先洗去表面污物，再移入超声水浴 中25 °C清洗，每次3min，重复三次，最后依次用乙醇和Mi 11 i-Q水超声清洗，氮气吹干。
[0059] (2)捕获分子固定:在步骤（1)中吹干的玻碳电极表面立即加入10uL预先稀释的鼠 抗人Ficolin-3单克隆抗体(50μg/ml)，置于4°C冰箱中孵育过夜，获得工作电极。
[0060] 五、检测目标蛋白Ficolin-3
[0061] (1)首先取出四中制备好的工作电极，用PBST冲洗两遍，再用PBS冲洗一遍，并用氮 气吹干，浸润于l〇〇uL电极封闭液中，置于室温lh，封闭工作电极上其他非特异性位点； [0062] (2)将步骤(1)中已经封闭其他非特异性结合位点的工作电极取出，用PBST冲洗两 遍，再用PBS冲洗一遍，并用氮气吹干，在工作电极表面滴加5uL不同浓度(Oμg/ml、25μg/ml、 50μg/ml)的目标蛋白Ficol in-3，室温放置lh。
[0063] (3)将步骤(2)中已经捕获目标蛋白Ficolin-3的工作电极取出，用TOST冲洗两遍， 再用PBS冲洗一遍，并用氮气吹干，取5uL生物素标记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体(终浓度 50μg/ml)滴于工作电极表面，室温放置lh;
[0064] (4)将步骤（3)中所得加有生物素标记信号探针的工作电极取出，用PBST冲洗两 遍，再用PBS冲洗一遍，并用氮气吹干，取5uL 1 %酪蛋白稀释的Avidin-HRP滴于工作电极表 面，4°C冰箱放置20min;
[0065] (5)将步骤(4)中所得已经加有Avidin-HRP的工作电极用0.01M PBS进行彻底冲 洗，然后将所述工作电极浸没在TMB溶液中检测。采用三电极系统，除了工作电极以外，采用 铂电极为对电极，银/氯化银为参比电极。使用CHI 760E电化学工作站检测。扫描循环伏安 图和时间电流曲线。其中循环伏安法的起始电压0V，最高电压0.8V，最低电压0V，扫描速度 0.1 v/s。时间电流曲线，电压为0.1V，时间100秒。电化学阻抗图谱法(EIS)频率范围是0.1到 105Hz〇
[0066] 检测结果如图2所示。采用电化学阻抗图谱法(EIS)来分析对基底电极每一步修饰 之后，电极表面的情况。裸玻碳电极(a)上孵育鼠抗人Ficolin-3单克隆抗体(b)，再加入含 BSA的电极封闭液（c)，然后分别依次孵育待测Ficolin-3溶液（d)生物素标记羊抗人 Ficolin-3多克隆抗体(e)和Avidin-HRP(f)，可以看出电极表面电阻依次增大，说明每一步 电极都成功修饰。
[0067]如图3所示，其中（A)构建的电化学免疫传感器检测Oμg/ml(实线）、25μg/ml(长虚 线)和50μg/ml (短虚线）的Ficolin-3时响应的循环伏安曲线;说明Ficolin-3和生物素标记 羊抗人Ficolin-3多克隆抗体在工作电极表面发生了特异性结合。从图中我们可以看出随 着目的蛋白Ficolin-3浓度的不断增加，获得的还原峰峰值也明显增大。（B)电化学免疫传 感器对Oμg/ml(实线）、25μg/ml(长虚线）和50μg/ml(短虚线)Ficolin-3响应的时间电流曲 线。随着Ficolin-3浓度的不断增加，氧化还原峰电流值均明显增大。由于充电电流的影响， 电流很快就会达到平衡状态，在100s左右已经达到稳态电流。
[0068] 实施例2电化学免疫传感器及使用条件的优化
[0069] 为了获得更好的分析性能，需要对构建此电化学免疫传感器中的一些实验条件进 行优化。
[0070] (l)Ficolin-3最佳孵育时间优化：
[0071] 阴性空白对照检测时工作电极上孵育不含F i c ο 1 i η - 3的P B S溶液，阳性检测中 Ficolin-3浓度为25μg/ml。工作电极上Ficolin-3孵育不同时间（15min、30min、45min、 60min和75min)，进行电化学检测。取IT扫描第100s时电流值进行分析。如图4所示，随着 Ficolin-3孵育时间的增加，电流值是增加的，同样的阴性空白对照也是随着孵育时间的增 加电化学信号增加。Ip/In值如下表1所不，可以看出在Ficolin孵育时间为60min时，电流信 号比值最大为8.3±0.4,因此采取60min为Ficolin-3最佳孵育时间。
[0072] 表1电化学免疫传感器对Ficolin-3孵育时间的电流响应的Ip/In比值分析
[0073]
[0075] (2)生物素标记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体最佳孵育时间优化：
[0076] 阴性对照中不含生物素标记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体，阳性检测中生物素标 记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体为25μg/ml。各组中待测Ficolin-3浓度为25μg/ml，生物素 标记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体孵育不同时间（30min、60min、90min)，取IT扫描第100s时 电流值进行分析。如图5所述，随着生物素标记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体孵育时间的增 加，阳性检测和阴性对照的电化学电流信号是逐渐增加的。Ip/In值如下表表2所示，可以看 出在生物素标记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体孵育时间为60min时，信号比值最大为13.5土 0.2，采取60min为最佳孵育时间。
[0077] 表2电化学免疫传感器对生物素标记羊抗人Ficolin-3多克隆抗体孵育时间