一种银黄颗粒指纹图谱的测定方法
【专利摘要】本发明涉及的银黄颗粒质量控制方法，具体涉及一种银黄颗粒指纹图谱的测定方法，属于药物分析技术领域，该测定方法是通过以下步骤实现的：（1）对照品溶液的制备；（2）内标溶液的制备；（3）供试品溶液的制备；（4）利用高效液相色谱?质谱法进行分析测定。本发明采用液相色谱与质谱连用的方法，精确测定银黄颗粒共有峰的化学成分，简便准确、灵敏度高、重复性好。本发明能够更全面地监控原料药材、半成品和成品质量，监控生产工艺的稳定性。
【专利说明】
一种银黄颗粒指纹图谱的测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种银黄颗粒指纹图谱的测定方法。
【背景技术】
[0002] 银黄颗粒系由金银花提取物、黄芩提取物组成的复方制剂，具有清热解毒、消炎等 功效，被广泛用于治疗上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽炎、流行性腮腺炎、眼科疾病、烧伤 感染等疾病。目前该品种在国家食品药品监督管理局获得批准文号的有102家企业，生产厂 家众多，加之原料药、生产工艺等方面的差异都会影响产品质量。
[0003] 中药指纹图谱采用各种先进的分析手段(光谱、波谱、色谱等技术)标示中药组分 群体的特性，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息 量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。指纹图谱包括了对已知成分和未知成分的分析， 反映的化学成分信息(具体表现为相对保留时间和相对峰面积)具有高度特异性和选择性， 可较充分地反映出中药复杂混合体系中各种化学成分量分布的整体状况，尤其是在现阶段 有效成分绝大多数没有明确的情况下，能够结合各种色谱、光谱、波谱手段，特征性地鉴定 中药的真伪与优劣，成为中药自身的"化学条码"。
[0004] 《药物分析杂志》2009年第29卷第8期的一篇《银黄颗粒的HPLC特征图谱分析》论文 中，建立了银黄颗粒RP-HPLC指纹图谱测定方法，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱， 流速为1. OmL/min，检测时间为35min，采用自身所含成分绿原酸峰为参照峰，共确定12个共 有峰作为该品种指纹图谱的数学表达。《分析试验室》2015年第34卷第7期的一篇《超高效液 相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定银黄颗粒中化合成分和主要成分》论文中，建立了超高 效液相色谱一四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS)测定银黄颗粒中活性成分的定性和 定量分析方法，以〇. 5%甲酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，流速0.4 mL/min，检测时间25 min，对色谱图中的12种已知成分进行了定量检测。
[0005]但是，指纹图谱只单纯反映中药的化学信息，与药效指标无关联，难以准确评价中 药产品质量，而药效是评价药品质量的终极指标。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供一种银黄颗粒指纹图谱的测定方法，采用液相色谱 与质谱连用的方法，精确测定银黄颗粒共有峰的化学成分，简便准确、灵敏度高、重复性好。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的： 一种银黄颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)对照品溶液的制备:精密称取异鼠李素、黄芩苷、黄芩素、木犀草苷、隐绿原酸、新绿 原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、千层纸素、白杨素、汉黄芩苷、汉黄芩素，分别加甲 醇溶解，再加入等体积的水，分别制成〇. lmg/ml对照品溶液； (2 )内标溶液的制备:精密称取异鼠李素，加甲醇溶解，再加入等体积的水，定容成浓度 为30yg ? mL-1的内标溶液； (3) 供试品溶液制备方法：取银黄颗粒，加入甲醇溶液制成浓度为40mg ? ml/1样品溶 液;将样品溶液与30y g ? ml/1的内标溶液等体积混匀，经0.22ym微孔滤膜滤过，取续滤液作 为供试品溶液； (4) 测定:利用高效液相色谱-质谱法进行分析测定。
[0008]进一步，所述步骤（3)中供试品溶液的制备方法为：取银黄颗粒，精密称取细粉 1. 〇g，置于50 mL圆底烧瓶内，精密加入体积分数为50%甲醇水溶液25mL，称重，加热回流 20min，放冷，补重，过滤，得续滤液1;取续滤液1与内标溶液等体积混匀，经0.22ym微孔滤膜 滤过，得续滤液2作为供试品溶液。
[0009] 进一步地，所述高效液相色谱仪色谱条件为:4〖613\^11118；[1103&8色谱柱(4.6111111 X 250mm，5ym);条件为:柱温30°C，流速1 ? 0 mL ? min-1，检测波长235nm，进样量为：10yL，以 乙腈为流动相A，体积分数为0.2%磷酸水溶液为流动相B，体积分数为0.5%的磷酸水溶液为 流动相C进行梯度洗脱。
[0010]进一步地，梯度洗脱的条件为： 0-10 min，5-9%流动相A，95-91%流动相B; 10-31 min，9-16%流动相A，91-84%流动相B; 31-42 min，16%流动相A，84%流动相B;42-65 min，16-20%流动相A，84-80%流动相B;65-90min，20-22% 流动相A，80-78% 流动相 B; 90-120min，22% 流动相 A，78% 流动相C; 120-150min， 22-25%流动相A，78-75%流动相C; 150-170min，25-32%流动相A，75-68%流动相C; 170-185min，32-45%流动相A，68-55%流动相C; 185-200 min，45-60%流动相A，55-40%流动相C; 200-220 min，60-80%流动相A，40-20%流动相C; 220-250min，80-100%流动相A，20-0%流动相 C。所述百分比为体积百分比。
[0011]进一步地，所述质谱法的条件为:采用ESI离子源，正负离子交替扫描模式;离子阱 质量分析器，质量扫描范围：50~1500 m/z;扫描速度26000 喷雾气压力35.0psi; 干燥气温度350°C;干燥气流速gi^mirT1;毛细管电压4000 V;碰撞气:氦气。
[0012] 本发明的有益效果： (1)在梯度洗脱过程中，选择了不同时间段选用不同酸浓度(0.2%和0.5%的磷酸)进 行洗脱，通过改变流动相中磷酸浓度，分离效果好，更好的分辨共有峰的化学成分。
[0013] (2)本发明针对成品所含有效成分的结构特点和理化特征，对供试品溶液配制方 法、流动相、洗脱程序、色谱柱及质谱参数等条件进行了筛选和优化，利于液相色谱与质谱 的连用，且方法重复性及稳定性好;对选取的20个共有峰均进行了线性关系考察，进样量在 相当于样品〇. lmg-0.5mg范围内，各共有峰线性关系良好。
[0014] (3)选用异鼠李素为参照物，对含有内标物质的供试液进行指纹图谱的测定，采用 共有峰与内标峰的相对峰面积比值作为该指纹图谱的数学表达，这样比通常选用中药自身 成分做参照计算各共有峰的相对峰面积，更能体现各共有峰含量的绝对变化与相对变化。 [0015] (4)该方法能够更全面地监控原料药材、半成品和成品质量，监控生产工艺的稳定 性。
【附图说明】
[0016] 图1为实施例1得到的银黄颗粒指纹图谱。
[0017] 图2为本发明对100批银黄颗粒进行了指纹图谱测定，采用中位数法生成对照指纹 图谱。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不 对其内容进行限定。
[0019] 1.1仪器 Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），Waters 2998紫外检测器（美国 Waters公司），Waters Empower色谱工作站（美国Waters公司）；AGBP210S电子天平 (Sartorius公司）；MILLIP0RE纯水机（MILLIP0RE公司）；Agela Venusil MP Cis色谱柱 (4.6mm X 250mm，5ym)(天津博纳艾杰尔科技有限公司）。
[0020] 1.2试药 异鼠李素（批号：110860-200406)、黄芩苷（批号：110715-200514)、黄芩素（批号： 111595-200301)、木犀草苷(批号：111720-200603)购自中国食品药品检定研究院。隐绿原 酸(批号：14030213)、新绿原酸(批号：13112712)、异绿原酸A(批号：14041309)、异绿原 酸B(批号：14022812)、异绿原酸C(批号：14022805)、千层纸素(批号：14062410)、白杨素 (批号：13080712)、汉黄芩苷（批号：13120401)、汉黄芩素（批号：13101809)购自成都普 瑞法科技开发有限公司，纯度>98%。液相色谱用乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，试验 用银黄颗粒样品均购自药店，来源于36个不同厂家的100批样品。
[0021] 实施例1 一种银黄颗粒指纹图谱测定方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷、黄芩素、木犀草苷、隐绿原酸、新绿原酸、异绿 原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、千层纸素、白杨素、汉黄芩苷、汉黄芩素，分别加甲醇溶解，再 加入等体积的水，分别制成〇. lmg/ml的对照品溶液，在4°C下避光保存。
[0022] (2)内标溶液的制备:精密称取异鼠李素，加甲醇溶解，再加入等体积的水，定容成 浓度为30yg ? mL-1的内标溶液。
[0023]内标物的选择： 共考察了丹皮酚、丹酚酸B、葛根素、异鼠李素、橙皮苷、山奈酚、槲皮素、槲皮苷等对照 品最终选择了异鼠李素为内标。异鼠李素的保留时间为196 min左右，与相邻峰达到基线分 离，无干扰，相邻峰的分离度均>1.5。
[0024]内标物溶媒的选择： 内标物先用甲醇溶解，再加入等体积的水溶液，制备成内标物溶液。内标物溶液经超声 (20min)后澄清，然后再与供试液混合，混合后仍澄清，且放置24h内不浑浊。故用此方法配 制内标溶液。
[0025]内标物浓度的确定： 随机选取10个银黄颗粒样品，制备样品溶液，并加入等体积不同浓度的内标溶液，混 匀，进高效液相色谱仪测定，选择谱图中峰面积适中的异鼠李素浓度，以确定内标物的浓 度。经考察，确定异鼠李素的浓度为30yg ? ml/1。
[0026] (3)供试品溶液制备方法:取银黄颗粒研细，精密称取细粉1.0g，置于50 mL圆底烧 瓶内，精密加入体积分数为50%甲醇水溶液25mL，称重，加热回流20min，放冷，补重，过滤，得 续滤液1;取续滤液1与内标溶液等体积混匀，经0.22ym微孔滤膜滤过，得续滤液2作为供试 品溶液； (4)测定:高效液相色谱-质谱法测定。
[0027] 高效液相色谱仪色谱条件为:Agela Venusil MP Cis色谱柱(4.6mmX250mm，5ym); 条件为:柱温30°C，流速1. OmL ? min-1，检测波长235nm，进样量为10yL，以乙腈为流动相A， 体积分数为〇. 2%磷酸水溶液为流动相B，体积分数为0.5%的磷酸水溶液为流动相C进行梯度 洗脱。
[0028]梯度洗脱的条件见表1:
所述百分比为体积百分比。
[0029] (5)按照上述方法得到的色谱图，如图1所示。
[0030] 以异鼠李素为参照，标定了 20个共有峰，共有峰面积占总面积的85%以上，测定12 个成分的对照品溶液，通过与对照品保留时间和紫外吸收光谱的比对，确定了其中1、3、4、 7、8、9、11、16、17、18、19、20号色谱峰分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿 原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素。
[0031] 结合质谱解析以及对照品的比对，共确定了 14个共有峰的化学成分，分析结果见 表2。质谱法的条件为:采用ESI离子源，正负离子交替扫描模式;离子阱质量分析器，质量扫 描范围：50~1500 m/z;扫描速度26000 m/z.s-S喷雾气压力35.0psi;干燥气温度350 °C; 干燥气流速gi^mirT1;毛细管电压4000 V;碰撞气:氦气。
[0032] 表2为银黄颗粒中部分共有峰成分解析。
[0033]
2.1线性关系的考察 精确称取2.5g银黄颗粒，精密加入50%甲醇溶液25mL，制备供试液，分别吸取lmL、2mL、 3mL、4mL、5mL供试液于5mL量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，摇匀，等体积加入不同浓度的 异鼠李素内标溶液，共制得含样品浓度为O.Olg.mL '0.02 g.mL '0.03 g.mL ' 0.04 g ? mL -\0.05 g ? mL -1的供试液，使所含内标物质的浓度分别为10yg ? mL -\20ii g ? mL -\30yg ? mL -\40yg ? mL -\50yg ? mL -、分别进样10yL，按色谱条件进样测定，以 浓度X(yg*mL -1)为横坐标，以各峰与内标峰面积比值Y纵坐标进行线性回归，结果显示 进样量在相当样品1〇〇~500yg范围内，20个共有峰成分线性关系良好，内标物质在进样量 0.1~0.5yg范围内线性关系良好。线性关系见表3。
[0034] 2.2精密度试验 取同一样品供试液，1〇此进样，连续进样5次，按色谱条件进样测定，以异鼠李素为参照 峰，计算共有峰的相对保留时间和峰面积比值。结果显示各共有峰的相对保留时间RSD< 0.12%，相对峰面积RSD < 1.75%，表明仪器精密度良好。
[0035] 2.3重复性试验 取同一批供试品5份，按制备方法制备供试品溶液，按色谱条件进样测定，以异鼠李素 为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和峰面积比值。结果显示各共有峰的相对保留时 间RSD < 1.01%，相对峰面积RSD < 2.05%，表明分析方法重现性良好。
[0036] 2.4稳定性试验 取同一批供试品溶液，按色谱条件，分别在0 h、5 h、10 h、15 h、20 h、25 h进样，记录 色谱图，以异鼠李素为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和峰面积比值。结果显示各共有 峰的相对保留时间RSD<0.09%，相对峰面积RSD<2.11 %，表明供试品溶液室温放置在25h 内稳定性良好。
[0037] 2.5相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》，采用多点校正对100批图谱进行 匹配，计算相似度，中位数法生成对照指纹图谱，如图2所示。经计算，样品间相似度在0.964 以上，各批样品与生成的对照指纹图谱相似度均在0.974~0.999之间。表明各批次间银黄颗 粒存在一定差异，但总体上工艺较稳定，产品均一性较好，该方法能较好用于银黄颗粒质量 控制。
【主权项】
1. 一种银黄颗粒指纹图谱的测定方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)对照品溶液的制备:精密称取异鼠李素、黄芩苷、黄芩素、木犀草苷、隐绿原酸、新绿 原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、千层纸素、白杨素、汉黄芩苷、汉黄芩素，分别加甲 醇溶解，再加入等体积的水，分别制成〇. lmg/ml对照品溶液； (2 )内标溶液的制备:精密称取异鼠李素，加甲醇溶解，再加入等体积的水，定容成浓度 为30yg · mL-1的内标溶液； (3) 供试品溶液制备方法:取银黄颗粒，加入甲醇溶液制成浓度为40mg · ml/1样品溶液； 将样品溶液与SOlIg · ml/1的内标溶液等体积混匀，经0.22μπι微孔滤膜滤过，取续滤液作为供 试品溶液； (4) 测定:利用高效液相色谱-质谱法进行分析测定。2. 根据权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，高效液相色谱仪色谱条件 为：Agela Venusil MP Cis色谱柱（4.6mmX250mm，5ym);条件为：柱温30°C,流速 1.0 mL· HiirT1，检测波长235nm，进样量为：IOyL，以乙腈为流动相A，体积分数为0.2%磷酸水溶液为流 动相B，体积分数为0.5%的磷酸水溶液为流动相C进行梯度洗脱。3. 根据权利要求2所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，梯度洗脱的条件为： 0-10 min，5-9%流动相A，95-91%流动相B; 10-31 min，9-16%流动相A，91-84%流动相B; 31-42 min，16%流动相A，84%流动相B;42-65 min，16-20%流动相A，84-80%流动相B;65-90min，20-22%流动相A，80-78%流动相B; 90-120min，22%流动相A，78%流动相C; 120-150min， 22-25%流动相A，78-75%流动相C; 150-170min，25-32%流动相A，75-68%流动相C; 170-185min，32-45%流动相A，68-55%流动相C; 185-200 min，45-60%流动相A，55-40%流动相C; 200-220 min，60-80%流动相A，40-20%流动相C; 220-250min，80-100%流动相A，20-0%流动相 C； 所述百分比为体积百分比。4. 根据权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，质谱法的条件为:采用ESI离 子源，正负离子交替扫描模式;离子讲质量分析器，质量扫描范围：50~1500 m/z ;扫描速度 26000 m/z.s-S喷雾气压力35.0psi;干燥气温度350°C;干燥气流速9L.min-S毛细管电 压4000 V;碰撞气:氦气。5. 根据权利要求1-4之一所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，步骤(3)中供试品溶 液的制备方法为:取银黄颗粒，精密称取细粉1.0 g，置于50 mL圆底烧瓶内，精密加入体积分 数为50%甲醇水溶液25mL，称重，加热回流20min，放冷，补重，过滤，得续滤液1;取续滤液1与 内标溶液等体积混匀，经〇. 22μπι微孔滤膜滤过，得续滤液2作为供试品溶液。
【文档编号】G01N30/02GK105911186SQ201610247197
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】高燕, 吕凌, 丁晓彦, 刘青, 赵渤年
【申请人】山东省中医药研究院