剂抗原1.5ml由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔14日后，以弗氏不完全佐剂抗原，在每只兔脚掌两点，背部皮下多点接种，接种总量为3mL，为其第三次免疫；隔14日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA试验试血，免疫兔血清IHA效价达1:512，正式采血，采用37°C温箱放置I小时，4°C冰箱放置2小时，自然析出后3000rpm离心5min分离血清，得到山羊支原体山羊肺炎亚种高免血清，用饱和硫酸铵沉淀法将分离到的血清纯化获得山羊支原体山羊肺炎亚种多抗IgG。
[0036]四、金溶胶的制备
[0037]取Ig氯化金，一次溶解于超纯水中配制成1%的氯金酸水溶液，1%氯金酸水溶液稀释成0.01%100mL,加热至沸，搅拌加入I %柠檬酸三钠水溶液2mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色，继续煮沸15min。冷却后即为胶体金。加入0.02%的NaN3,经一次性灭菌滤器过滤，装入洁净的玻璃瓶中备用。胶体金浓度以检测特定波长下的光吸收值定量，A23?为 1.1 ?1.2。
[0038]五、抗原标记
[0039]取制备的胶体金300mL，用0.lmol/LK2C(V^液调整pH值为7.0,加入山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，终浓度为40 μ g/mlo室温下电磁搅拌30min,且在抗原结合的过程中加入20% BSA 50ul/ml、l%PEG 20000 50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，4°C,2000rpm离心1min,弃沉淀，收集上清液。4°C, 12000rpm离心30min,小心吸去上清液,用0.01mol/L pH7.2的PBS洗涤沉淀物两次，离心后的重悬液其配方为:(0.02M四硼酸钠、0.5% BSA、5%蔗糖、0.05%吐温20)，用重悬液重悬后铺金，37°C干燥I小时，然后再进行试纸条的组装。用0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液回复体积，即为金标抗原。置4°C保存备用，I周后没有发生凝集。测定胶体金抗原溶液Am? =2.5。
[0040]六、试纸条制备:取玻璃纤维纸，用喷膜机按15 μ L/cm将金标山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原喷涂于玻璃纤维纸上，室温干燥，制成金标垫；在20mmX300mm硝酸纤维(NC)膜上，用喷膜机横向线状以1.0 μ L/cm喷涂山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，形成检测带。间隔8mm,以1.0 μ L/cm横向线状喷涂多抗IgG,形成质控带。用含10%BSA的0.02mol/L pH7.2的PBS对喷涂的NC膜进行封闭、洗脱，室温晾干；在PVC底板上分别将洁净的玻璃纤维纸制成的样品垫、包被有检测带和质控带的NC膜、金标垫和吸水纸制成的吸收垫，按下图装配(各部分重叠约按纵向剪切,裁成宽为4.8mm的条状成品。
[0041]试纸条组装的具体操作按如下步骤进行:在PVC背衬板上由上至下分别将胶体金垫2，包括检测线3和质控线4的硝酸纤维素膜7以及吸收垫I按顺序装配，将PVC衬板设在最底部，衬板上部中段设有硝酸纤维素膜7，硝酸纤维素膜7上部左端贴有吸收垫I，硝酸纤维素膜7上部右端设有金标垫2，金标垫2的上部右端设有吸水垫5，再分别用喷枪将前述得到的多糖抗原和IgG在硝酸纤维素膜上制出检测线和质控线，在本实用新型中检测线与质控线两线间距离保持在0.Smm0再将试纸切割成4_宽的条状，即制成如附图1的结构本实用新型的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测试纸条。
[0042]本实用新型试纸条实际检测:将山羊支原体山羊肺炎亚种阳性血清和阴性健康血清用本实用新型的试纸条进行检测，结果阳性血清出现阳性结果，在检测线和质控线均出现两条带，阴性血清则为阴性结果，只在对照线出现一条带，检测线不出条带，如图2示。
[0043]试纸条的特异性:运用该试纸条对山羊支原体山羊肺炎亚种免疫血清进行检测(经间接血凝经间接血凝试剂检测效价均> 1:64)。用该检测试纸条对绵羊肺炎支原体(Y98)和丝状支原体山羊亚种(PG3)两种不同病原的阳性血清进行检测。检测结果为山羊支原体山羊肺炎亚种阳性血清为阳性，在检测线和对照线均出现条带，绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种为阴性，只在对照线出现条带，而检测线上没有任何条带，参见图3。这一实验表明本实用新型的试纸条特异性良好。
[0044]试纸条的敏感性:将山羊支原体山羊肺炎亚种M1601高免兔血清(IHA效价为1:512)进行梯度稀释，用检测试纸条进行检测，当达到1:1024时均能在检测线和对照线出现条带，仍能检测为阳性，表明本实用新型的试纸条敏感性好，参见图4。
[0045]将试纸条密封分别存放于2?8°C条件下，每隔15天取出检测检测山羊支原体山羊肺炎亚种M1601高免兔血清(IHA为1:512)和阴性血清，结果表明该试纸条能在2?8°C条件下保存6个月，且特异性特异性、敏感性均无明显变化。
[0046]相关实验表明，本实用新型的试纸条具有特异性好、敏感性强和重复性的优点。
【主权项】
1.检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条，包括:底板、设置于底板上依次线性排列的样品吸收垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水垫组成，在硝酸纤维素膜上包被有质控线与检测线，其特征在于:胶体金垫包被的抗原为经超声波破碎处理后得到的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，检测线包被的是山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，质控线为山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG。2.根据权利要求1所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条，其特征在于胶体金垫包被的抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种M1601菌株经超声波破碎处理后得到全菌抗原。
【专利摘要】本实用新型公开一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的胶体金试纸条。本实用新型的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条中：胶体金垫包被的抗原为经超声波破碎处理后得到的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，检测线包被的是山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，质控线为山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG。本实用新型能真实地检测山羊支原体山羊肺炎亚种产生的抗体，具有：不与其它任何相似支原体发生交叉反应的特异性；成本低，操作简单，可长期贮存，对人体无毒害的优点。
【IPC分类】G01N33/543, G01N33/558
【公开号】CN204882564
【申请号】CN201520355394
【发明人】贺英, 储岳峰, 赵萍, 高鹏程, 逯忠新, 张建军, 刘永生
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年5月28日