一种工厂化水产养殖池中不同微生物群落相互影响的量化分析方法与流程

本发明涉及一种工厂化水产养殖池中不同微生物群落相互影响的量化分析方法。

背景技术：

工厂化的水产养殖池可以看成一个简单的小型水生态系统。其主要由养殖动物、饵料和水三个组分组成，结构简单；此外，工厂化的水处理设施能够保障水质的稳定，养殖环境可控。因此，工厂化水产养殖池是较为理想的微生物生态系统研究模型。

以鲍的工厂化苗期培育池为例，介绍一下鲍苗种培育的大致过程和方法。鲍育苗池中主要由鲍、藻、水三种主要部分组成，此外水泥池中还要放置很多塑料薄膜或波纹板作为鲍苗和藻类的物理附着基质。放入鲍苗的前两周需要预先进行藻类的培育，藻类长出后附着于附着基质上，以备鲍苗食用。藻类培育好后开始放入鲍的受精卵，刚开始几天为浮游期，鲍苗在水中自由游泳。第3天，鲍苗开始在附着基上附着，并开口以藻类为食。随着鲍苗逐渐长大，附着基上的藻类逐渐无法满足鲍苗的需要，鲍苗培养至50-60mm左右(约40天)，开始投放人工饲料。在这样的生态系统中，鲍作为消费者匍匐在附着基上，早期通过摄食藻类和水交换改变着体内的肠道菌群；随着鲍苗活动能力的增强，其体表分泌的粘液和排泄物也对藻际菌群(与藻类共生的细菌群落)产生越来越多的影响；水作为养殖环境为鲍和藻同时提供生存支撑，在影响鲍和藻类菌群的同时，水中的微生物也会受到鲍和藻类生长的影响。由此可见，消费者(养殖动物)、食物(藻类或饲料)和环境(水)三个菌群间的关系非常密切，随着消费者的生长发育，各菌群间的相互关系也会发生相应的变化。然而，研究这种多个菌群间的、随着时间动态变化的相互作用关系并没有一个很好的量化分析方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种工厂化水产养殖池中不同微生物群落相互影响的量化分析方法，通过该方法可以从时间和空间维度上研究工厂化水产养殖池中多个微生物群落之间的相互关系。

具体地，本发明提供的工厂化水产养殖池中不同微生物群落相互影响的量化分析方法，包括以下步骤：

(1)自养殖开始，进行多次定期采集养殖池的水生生态系统中的水体、消费者和食物的样品，分别检测水体、食物和养殖动物体内微生物种类和丰度数据；

(2)根据所得的各样品的微生物种类和丰度数据，分析各次取样的水体、消费者和食物样品间的共有微生物情况，获得每个样品微生物与影响因素之间的影响力指数i；

(3)根据获得的每个样品微生物与影响因素之间的影响力指数i获得所述影响因素对样品微生物影响的影响力百分比i％，以影响力百分比为纵坐标，时间为横坐标建立水体、消费者和食物随时间变化的影响变化关系图，用于解读水生生态系统中不同微生物群落间的动态变化关系。

工厂化水产养殖池是一个简单的小型水生生态系统，主要由消费者(养殖动物)、食物(藻类或饲料)和环境(水体)三个组分组成，消费者、食物和环境三个菌群间的关系非常密切，随着消费者的生长发育，各组分间微生物群落的相互关系会发生相应的变化。因此，定期对水生生态系统中的水体、消费者和食物进行采集，获取每个水体、食物和养殖动物体内微生物种类和丰度数据，从而研究相邻时间点的不同组分的样品之间以及同一时间点的不同组分的样品间的相互影响情况。在研究中发现，某个时间点采集的各个样品的微生物基本上受到5个与之时空相邻的样品的影响，因此，本发明所述步骤(2)影响因素为与某个样品时空相邻的样品，以第n个时间点采集的消费者样品an为例，如图1所示，共5个时空相邻样品，也就是说有5个影响因素决定消费者样品an的微生物种类和丰度。这些时空相邻的样品包括两组，一组是处于同一时间点的环境样品wn和食物样品sn；另一组是上一次采样时间点的消费者样品an-1、环境样品wn-1和食物样品sn-1。对于水体和食物样品的分析可以此类推。

本发明所述步骤(2)中，所述影响力指数i可体现每个样品微生物与各个影响因素两两间的相互影响情况，而且当两个样品的微生物种类和丰度完全相同时，i的值最大为0.5，当两个样品中没有共有微生物时，i的值最小为0。在本发明中消费者、食物和环境样品的影响力指数i分别通过以下的公式计算，其中，an为第n个时间点采集的消费者样品，an‐1为第n‐1个时间点采集的消费者样品，sn为第n个时间点采集的食物样品，sn‐1为第n‐1个时间点采集的食物样品，wn为第n个时间点采集的环境样品，wn‐1为第n‐1个时间点采集的环境样品，c值表示两个样品中全部共有微生物中较小丰度值的加和，s为样品中全部微生物丰度的总和。

(1)消费者

第n个时间点的水体与消费者的微生物影响力指数如式一：

第n个时间点的食物与消费者的微生物影响力指数如式二：

第n-1个时间点的消费者与第n个时间点的消费者的微生物影响力指数如式三：

第n-1个时间点的水体与第n个时间点的消费者的微生物影响力指数如式四：

第n-1个时间点的食物与第n个时间点的消费者的微生物影响力指数如式五：

(2)食物

第n个时间点的水体与食物的微生物影响力指数如式十二：

第n个时间点的消费者与食物者的微生物影响力指数如式十三：

第n-1个时间点的消费者与第n个时间点的食物的微生物影响力指数如式十四：

第n-1个时间点的水体与第n个时间点的食物的微生物影响力指数如式十五：

第n-1个时间点的食物与第n个时间点的食物的微生物影响力指数如式十六：

(3)水体

第n个时间点的食物与水体的微生物影响力指数如式二十三：

第n个时间点的消费者与水体的微生物影响力指数如式二十四：

第n-1个时间点的消费者与第n个时间点的水体的微生物影响力指数如式二十五：

第n-1个时间点的水体与第n个时间点的水体的微生物影响力指数如式二十六：

第n-1个时间点的食物与第n个时间点的水体的微生物影响力指数如式二十七：

本发明所述步骤(3)中，影响力百分比i％通过以下公式计算。具体如下：

(1)消费者

由于wn、sn、an-1、wn-1和sn-1这5个时空相邻的样品共同决定了an的微生物种类和丰富度，即5个影响力指数i共同决定着an体内的微生物(图1)。其中an受到来自an-1的影响在其中所占的百分比(ian-1-an％)就可以用如下公式计算。同理也可以得出其它4个影响力的百分比(iwn-an％，isn-an％，iwn-1-an％，isn-1-an％)，5个i％相加总和为100％。

式六：

式七：

式八：

式九：

式十：

式十一：

(2)食物

由于wn、an、an-1、wn-1和sn-1这5个时空相邻的样品共同决定了sn的微生物种类和丰富度，即5个相似性指数i共同决定着sn的微生物。其中sn受到来自sn-1的影响在其中所占的百分比(isn-1-sn％)就可以用如下公式计算。同理也可以得出其它4个影响力的百分比(iwn-sn％，ian-sn％，iwn-1-sn％，ian-1-sn％)，5个i％相加总和为100％。

式十七：

式十八：

式十九：

式二十：

式二十一：

式二十二：

(3)水体

由于wn、sn、an-1、wn-1和sn-1这5个时空相邻的样品共同决定了wn的微生物种类和丰富度，即5个影响力指数i共同决定着wn的微生物(图1)。其中wn受到来自wn-1的影响在其中所占的百分比(iwn-1-wn％)就可以用如下公式计算。同理也可以得出其它4个影响力的百分比(isn-wn％，ian-wn％，ian-1-wn％，isn-1-wn％)，5个i％相加总和为100％。

式二十八：

式二十九：

式三十：

式三十一：

式三十二：

式三十三：

本发明所述步骤(1)中，分别对水体、消费者和食物进行至少连续5次样品采集，即在至少在5个不同时间点进行样品采集，相邻两次采集隔1-7天。

本发明所述步骤(1)中采用16s扩增子测序分析方法对采集的各样品进行微生物种类及丰度分析。

本发明具有如下优点：

应用本发明所提供的方法能够很好地解读不同微生物群落间的动态变化关系，所得结果既有新意又能说明问题。本发明较为直观、量化地展示了一个水生生态系统中各主要微生物群落间的时空动态发展规律及其相互作用关系，为微生物生态系统的研究和解读提供了新的方法，也可为水产养殖的生态调控研究和指导水产养殖管理提供一种新的量化分析方法。

附图说明

图1是鲍样品an体内微生物受到5个时空相邻的样品影响的示意图。

图2是鲍、环境和食物样品各自随时间变化所受到的影响变化关系图。

具体实施方式

以下结合具体实施方法对本发明进行详细说明。

本实施例以鲍苗期的养殖池塘为例对本发明进行详细阐述。

自鲍苗开始养殖起，在整个养殖期间，每隔1-7天分别同时采集一次水、藻和鲍苗样品，连续采集至少5个时间点，即5个时间点分五天采集，每次采集需要间隔固定的天数(如每隔1天或每隔7天采一次)，分别获得5个样品，然后通过16s扩增子测序分析方法获得每种样品各个取样时间点时样品内部所含微生物种类和丰度，即获得鲍样品(a)体内微生物、水体样品(w)微生物、附着基样品(s)微生物的种类和丰度。假定以第n个时间点(即当天)的鲍样品为an，水体样品为wn，附着基样品为sn；第n-1个时间点的鲍样品为an-1，水体样品为wn-1，附着基样品为sn-1，依次类推。

如图1所示，第n个时间点的鲍样品an体内的微生物会受到5个时空相邻的样品影响，即第n个(当天)时间点的水体样品wn微生物、附着基样品sn微生物(藻际微生物)、前一个时间点(即第n-1个时间点)的鲍样品an-1体内微生物、水体样品wn-1微生物和附着基样品sn-1上微生物。其中来自an-1的影响为鲍样品内部影响，可理解为鲍自体菌群的稳定性；来自wn、wn-1、sn和sn-1的影响为外部影响，可理解为外部对自体菌群的影响。

首先，需要分析an和5个相邻样品两两间的相互影响(细菌群落的相似性)情况。在此，我们定义了一个中间变量：影响力指数(i)，即即两个细菌群落间的相似性多少，也可理解为相互影响的大小。如i越高，表示两个细菌群落越相似或者彼此影响越大。其中c值表示两个样品中全部共有微生物中较小丰度值的加和，s为样品中全部微生物丰富度的总和。当两个样品的微生物种类和丰度完全相同时，i的值最大为0.5，当两个样品中没有共有微生物时，i的值最小为0。

第n个时间点的水体与消费者的微生物影响力指数如式一：

第n个时间点的食物与消费者的微生物影响力指数如式二：

第n-1个时间点的消费者与第n个时间点的消费者的微生物影响力指数如式三：

第n-1个时间点的水体与第n个时间点的消费者的微生物影响力指数如式四：

第n-1个时间点的食物与第n个时间点的消费者的微生物影响力指数如式五：

由于wn、sn、an-1、wn-1和sn-1这5个时空相邻的样品的微生物共同决定了an的微生物种类和丰富度，即5个影响力指数i共同决定着an体内的微生物(图1)。其中an受到来自an-1的影响在其中所占的百分比(ian-1-an％)就可以用如下式六计算。同理也可以得出其它4个影响力的百分比(iwn-an％，isn-an％，iwn-1-an％，isn-1-an％)，5个i％相加总和为100％。

式六：

式七：

式八：

式九：

式十：

式十一：

最后，以i％为纵坐标，时间为横坐标，可以画出a、w和s样品各自随时间变化所受到的影响变化关系图(参见图2)。

(2)食物

第n个时间点的水体与食物的微生物影响力指数如式十二：

第n个时间点的消费者与食物者的微生物影响力指数如式十三：

第n-1个时间点的消费者与第n个时间点的食物的微生物影响力指数如式十四：

第n-1个时间点的水体与第n个时间点的食物的微生物影响力指数如式十五：

第n-1个时间点的食物与第n个时间点的食物的微生物影响力指数如式十六：

由于wn、an、an-1、wn-1和sn-1这5个时空相邻的样品共同决定了sn的微生物种类和丰富度，即5个影响力指数i共同决定着sn的微生物。其中sn受到来自sn-1的影响在其中所占的百分比(isn-1-sn％)就可以用如下式十七计算。同理也可以得出其它4个影响力的百分比(iwn-sn％，ian-sn％，iwn-1-sn％，ian-1-sn％)，5个i％相加总和为100％。

式十七：

式十八：

式十九：

式二十：

式二十一：

式二十二：

(3)水体

第n个时间点的食物与水体的微生物影响力指数如式二十三：

第n个时间点的消费者与水体的微生物影响力指数如式二十四：

第n-1个时间点的消费者与第n个时间点的水体的微生物影响力指数如式二十五：

第n-1个时间点的水体与第n个时间点的水体的微生物影响力指数如式二十六：

第n-1个时间点的食物与第n个时间点的水体的微生物影响力指数如式二十七：

由于wn、sn、an-1、wn-1和sn-1这5个时空相邻的样品共同决定了wn的微生物种类和丰富度，即5个影响力指数i共同决定着wn的微生物(图1)。其中wn受到来自wn-1的影响在其中所占的百分比(iwn-1-wn％)就可以用如下式二十八计算。同理也可以得出其它4个影响力的百分比(isn-wn％，ian-wn％，ian-1-wn％，isn-1-wn％)，5个i％相加总和为100％。

式二十八：

式二十九：

式三十：

式三十一：

式三十二：

式三十三：

由图2a结果可知，在鲍苗发育的早期，消费者自身、食物和环境对其影响都很重要，其中以食物对它产生的影响最大。鲍苗通过积极摄取来自食物和环境的菌群，稳定而缓慢地建立起自体的内生菌群，随着鲍苗内生菌群的逐渐稳定，受到来自环境的影响也逐渐减小，然而食物对它的影响依然很大。与鲍体内生菌群不同，藻际菌群的变化较为稳定，自始至终环境和消费者的变化对其影响不大(图2b)。相比于消费者和食物的菌群，在整个系统中环境菌群的稳定性最高。在系统早期环境菌群就保持了较高的稳定性，受消费者和食物的影响相对较小，随着时间的延长环境菌群变的更加稳定、更加不易受到其它因素的影响，这也是该生态系统稳定的一个重要保障。

由上可见，应用本发明所提供的方法能够很好地解读不同微生物群落间的动态变化关系，所得结果既有新意又能说明问题。本发明较为直观、量化地展示了一个水生生态系统中各主要微生物群落间的时空动态发展规律及其相互作用关系，为微生物生态系统的研究和解读提供了新的方法，也可为水产养殖的生态调控研究和指导水产养殖管理提供一种新的分析方法。