多品系混杂转基因大豆样品抽样模型及其建立方法
【专利摘要】多品系混杂转基因大豆样品抽样模型及其建立方法，所述抽样模型对于不同品系转基因产品含量的产品进行抽样时分别设定了规则，根据抽样时的相对标准偏差的要求，在不同转基因含量下，对应抽取的最小试样量、最小试样份样数和采样时大集合内的样品破碎粒度进行了指导，建立了抽样模型，并公开其建立方法，本发明为现有技术提供抽样方式的指导，其抽样模型具有科学性、准确性，为测定转基因农产品含量获得更准确有效的数据提供了基础。
【专利说明】
多品系混杂转基因大豆样品抽样模型及其建立方法
技术领域
[0001] 本发明设及转基因农产品含量测定中样品抽样模型及其建立方法，属于转基因农 产品含量测定领域。
【背景技术】
[0002] 在过去30多年里，由于转基因技术的快速发展，转基因植物的种植面积和产量持 续提升。一方面，转基因植物种植面积连续增，另一方面，转基因植物的品种、品系不断增 加，部分品种作物的深加工产品中得W较大规模应用，每个品种的作物可能有很多个品系 的转基因产品问世例如已知有31个品系的转基因玉米、17个品系的油菜、8个品系的大豆已 商品化。
[0003] 转基因植物或食物(GMOs)对人类健康的影响尚不清楚，对环境、生态等方面的影 响更没有确定的结论。在与转基因产品相关的国际贸易中经常发生纠纷，进而对转基因检 测提出了越来越高的要求，作为准确检测先决条件的抽样越来越得到关注。转基因成分在 农产品批中的分布不均、多品系混杂、在深加工产品中的低含量水平都给转基因检测带来 困难。如何准确抽取含有转基因成分的农产品样品，成为摆在科技工作者面前的重要课题。 自国家转基因生物新品种培育科技重大专项经费支持的转基因产品抽样技术研究启动W 来，截至2015年，该项目共完成了对单一品系转基因产品的抽样研究、多品系混杂转基因产 品的抽样研究W及部分转基因深加工产品抽样研究工作。
[0004] 欧盟早在1990年就出台了限制转基因投放环境的法规，随着欧盟转基因法规的逐 步发展，20世纪末，转基因产品阔值被限定为1 %，2001年，Simon Kay等人利用了当年仍有 效的国际标准ISO 542和ISO 13690中的抽样相关术语，在检测方法的L0D = 20copies，L0Q = 100copies的前提下，推荐采用上述两个ISO标准抽样。2003年，欧盟在增加了 C.化oletti 等人的模拟抽样工作内容提交了IS0/DIS21568,按照ISO 542，IS0 664，IS0 13690和系列 统计抽样基础标准ISO 2859，在AQL〉= 1 %的前提下（10%，4%，2%，1%)制定了抽样策略。 2004年，为了执行Reg. 1830/2003，欧盟专家出台了抽样的技术指南(Rec. 787/2004)，2005 年，EC发布了限制没有批准的转基因化10玉米产品的紧急措施，随后又发布了几个EC决议， 用W限制非批准的转基因产品。2009年，ISO 24333的新版标准发布，取代了两个原有标准 ISO 13690和IS06644。然而，它并不适用于外来的未批准GM0的抽样，因为直至那年仍没有 实际抽样数据。
[0005] 在中国，已经发布实施了关于转基因产品的抽样标准，既适用于批准产品也适用 于非批准GM0产品，该标准将会按照本技术报告修订。另一个标准已广泛用于中国。
[0006] 在加拿大和美国，没有单独的转基因产品抽样标准。他们更愿意按照为非转基因 产品设计的标准或方法抽取样品。
[0007] 目前应用于谷物、豆类、食品、饲料等一系列相关产品的抽样标准中，只有很少一 部分使用了科学的抽样技术原理，即便运些应用了科学抽样原理的抽样方案大多采用了理 论计算、计算机模拟等方法，真正采用实际数据研究获得的仅见于Kim H. Esbensen， Claudia F*aoletti,Pentti MinWdnen等人所在的KeLDA研究组的工作。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术中对于多品系样品的抽样缺乏有效可靠的指导方 法，导致在确定其转基因产品含量时存在盲目实验，数据缺乏可信度的问题，本发明提供一 种多品系混杂转基因大豆样品抽样模型，为现有技术提供抽样方式的指导，W便在测定转 基因农产品含量时获得更准确有效的数据。
[0009] 本发明的技术目的通过W下技术方案实现：
[0010] 首先，本发明第一方面的技术目的是提供一种多品系混杂转基因大豆样品抽样模 型：
[0011] 将分析样品的粒度和含量、试样量及试样份样数作为对转基因含量测定时对相对 标准偏差影响的主要因素，按照对标准偏差的要求，W及在转基因含量为?0-?~10-6范围 捏，对分析样品的粒度、最小试样量及最小试样份样数要求如下：
[0012]
[
[0014] 在上述本发明所述的抽样模型中，采用的抽样方法为简单随机抽样、分层抽样或 系统抽样，其中更优选为系统抽样。
[0015] 本发明第二方面的技术目的是提供上述多品系混杂转基因大豆样品抽样模型的 建立方法，包括W下步骤：
[0016] 第一步，从分析样品制备试料：采用称重添加法配制转基因原粒含量为10%~ 0.0001 %的样品，采用微型试料抽取装置进行抽样;进行DNA提取和PCR分析，此过程用于制 备标准品；在此过程中存在的方差为不同抽样方法产生的方差、分析样品的不均匀性产生 的方差、其中分析样品的非均匀性不变量HIas计算公式为
[0017]
[0018] 其中，δ为密度，β为释放因子，通常为l，f为形状因子，g为粒度分布因子，d为颗粒 直径；
[0019] 再者，分析样品的抽取试料的RS的十算按下式：
[0020]
[002。 其中，Μτρ为试样量，Mas为样品最小保留量；
[0022]第二步，根据计算的RSD，与理论值和计算机模拟值比较，并根据实测值的趋势确 定实测值的RSD与最小试样量的关系；
[0023] 第Ξ步，W相同的方法分别确定样品粒度与最小试样份样数与RSD的关系；
[0024] 第四步，由W上关系建立多品系混杂大豆样品抽样模型。
[0025] 在上述本发明所述的建立方法中，所述承载方式包括动态批和静态批。所述动态 批包括多种形式的运输方式，例如最常见的转运卡车和转运包装托盘等。
[00%]作为进一步的优选，上述建立方法中所述的抽样方法为系统抽样。
[0027]本发明为现有技术提供了一种多品系混杂转基因大豆样品抽样模型，在测定转基 因农产品含量时提供抽样方式的指导，并提供了建立抽样模型的方法，说明本发明提供的 抽样模型具有科学性、准确性，为测定转基因农产品含量获得更准确有效的数据提供了基 础。
【附图说明】
[00%]本发明附图两幅，
[0029] 图1.转基因低含量范围内（1〇-5~1〇-6)，样品粒度对RSD的影响；
[0030] 图2.转基因低含量范围内（1〇-1~1〇-4)，样品粒度对RSD的影响。
【具体实施方式】
[0031] W下结合技术方案和附图详细叙述本发明的【具体实施方式】。
[0032] 实施例1
[0033] 将转基因玉米原粒和非转基因玉米原粒分别冻干，分别粉碎至-60目、-100目和- 200目，采用直接称重添加法，取非转基因玉米为基体，采用M0N810作为添加物，每个标准分 析样品添加含量为10-?~10-6,使用V型混合器充分混匀并注意防止交叉污染。
[0034] 制备的标准分析样品摊铺在1.5mmX 1.5mmX2.7mm(边长X边长X深）的微型试料 抽取装置中，每个柱形管中将盛装约5mg。对于每个标准分析样品，分别使用系统抽样方法 采取约5mg X 5，25mg X 1各10组，5mg X 10，lOmg X 5，25mg X 2，50mg X 1 各10组，5mg X 20，10m邑 X 10，20mg X 5，50mg X 2，lOOmg X 1各10组和lOmg X 20，20mg X 10，40mg X 5，lOOmg X 2，200m邑 XI各10组。lOmg为接连两组5mg，依次类推。分别将各组样品混合成25mg，50mg，100mg和 200mg的试料，得到25mg试料20个，50mg试料40个，lOOmg试料50个，200mg试料50个。用同一 种DNA提取试剂盒提取试料中的目标DNA，W随机顺序分别测试添加的转基因含量，计算其 单次相对标准差，作为分析样品的总相对标准差(单次分析)的度量。其中，每个试料全部用 于提取DNA，每份DNA提取液实施PCR分析1次。
[0035] 实验结果：
[0036] 按照下式，计算各含量下分析样品的非均匀性不变量HIas，如表1所示；
[0037]
[003引式中，取密度5 = 1.2mg/mm3,释放因子0 = 1，形状因子(研磨后呈近球形)f = 0.5， 粒度分布因子g = 0. 4,颗粒直径按-60 目 d = 0.25mm，-100 目 d = 0.15mm，-200 目 d = 0.075mm，
[0039] 根据下式进一步计算的标准分析样品的抽取试料RSD列于表2;
[0040]
[OOW 其中，Μτρ为试样量，Mas为样品最小保留量。
[0042] 利用计算机仿真技术建立上述标准分析样品的模型，并按照5mg、10mg、25mg、 50mg、1 OOmg、200mg试料量采取试料，实施模拟分析，从而可得到在无分析方差情况下的试 料抽取方差估计，RSD的模拟值如表3。
[0043] 表 1
[0044]
[0049]
[0050] 在现行分析方法的范围内（25mg~300mg)，随着试料量的增加，RSD总体呈下降趋 势。当试料量增加至lOOmgW上时，RSD的下降幅度明显收窄。lOOmg和200mg试料量所导致的 1?50仅差1.5倍左右。而试料量从50111旨增加至100111旨时，1?50下降的幅度有时会超过2.3倍。但 从实测数据分析，最小试料量设定在200mg较为合理，推荐测试方法采用。采用不同试料量 对分析样品总分析相对标准差的影响结果见图1和图2所示。
[0051] 比起理论值，表3的实测值，与计算机模拟值更接近，理论值在高含量和粒度较低 的样品上与实际测试值有较大偏差。因此，由W上数据得出的抽样模型具有可靠的参考价 值。根据W上数据，可W得出的抽样模型是：
[0化2]
[0053]本发明实施例1的实验过程和实验结果，由W上实验结果可知，本发明为现有技术 分别提供了一种多品系混杂转基因大豆样品抽样模型的建立方法和建立出的抽样模型，在 检测转基因产品的含量中，具有较高科学性和参考价值。
【主权项】
1. 多品系混杂转基因大豆样品抽样模型，其特征在于： 将分析样品的粒度和含量、试样量及试样份样数作为对转基因含量测定时对相对标准 偏差影响的主要因素，按照对标准偏差的要求，以及在转基因含量为ΠΓ1~1〇_6范围捏，对 分析样品的粒度、最小试样量及最小试样份样数要求如下： 转基因含量 样品粒度 最小试样量 最小试样份样数 方差要求 10%~CU% -100 H lOOmg 2 10% 以卜 0.1% -0.01% 100 h 200mg 2 10%以下 0.01%~().001% -200 H 200mg 3 10%以 F <0.001% -200 H 2(J0mg 16 30% 以 I、2. 根据权利要求1所述的抽样模型，其特征在于，所述模型中采用的抽样方法为简单随 机抽样、分层抽样或系统抽样。3. 根据权利要求1所述的抽样模型，其特征在于，所述模型中采用的抽样方法为系统抽 样。4. 权利要求1~3任意一项所述的抽样模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤： 第一步，从分析样品制备试料：采用称重添加法配制转基因原粒含量为10 %~ 0.0001 %的样品，采用微型试料抽取装置进行抽样;进行DNA提取和PCR分析，此过程用于制 备标准品；在此过程中存在的方差为不同抽样方法产生的方差、分析样品的不均匀性产生 的方差、其中分析样品的非均匀性不变量HIas计算公式为其中，S为密度，β为释放因子，通常为l，f为形状因子，g为粒度分布因子，d为颗粒直径； 再者，分析样品的抽取试料的RSD计算按下式：其中，Mtp为试样量，Mas为样品最小保留量； 第二步，根据计算的RSD，与理论值和计算机模拟值比较，并根据实测值的趋势确定实 测值的RSD与最小试样量的关系； 第三步，以相同的方法分别确定样品粒度与最小试样份样数与RSD的关系； 第四步，由以上关系建立多品系混杂大豆样品抽样模型。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，抽样前，样品的承载方式包括动态批和静 态批。6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述动态批包括转运卡车和转运包装托 盘。7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抽样方法为系统抽样。
【文档编号】G06F19/24GK105825074SQ201610208148
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】曹际娟, 赵禹, 张琳, 卲筠乔, 徐静
【申请人】曹际娟, 赵禹, 张琳, 卲筠乔, 徐静