本发明涉及一种制备超顺磁性纳米复合材料的方法以及使用该方法制备的超顺磁性纳米复合材料，且更具体地涉及一种制备适用于检测目标生物材料的超顺磁性纳米复合材料的方法以及使用该方法制备的超顺磁性纳米复合材料。
背景技术：
：以高灵敏度检测和定量诸如目标生物标志物等生物分子的方法的开发在诸如疾病诊断和新药开发等医学和生命科学领域中被认为非常重要。代表性和广泛使用的是基于抗原-抗体免疫反应、dna杂交、受体反应等的结合实验，其取决于目标材料的类型，并且通过信号传感器确定目标分子的存在，信号传感器将与目标分子的结合转换为可测量的信号。在结合实验中使用磁力的磁性纳米颗粒介导的分离技术是有利的，因为目标生物分子是通过浓缩过程(阳性分离)或通过去除非目标分子(阴性分离)从包含混合在一起的各种杂质或非目标材料的悬浮溶液中分离获得的，从而显示出简化的实验、加工可行性、高灵敏度、改进的特异性、高通量筛选和可扩展性。磁性纳米颗粒介导的分离技术以如下方式进行：与目标分子特异性结合的配体材料附着于颗粒，然后在混合溶液中配体材料识别并结合至目标分子以及使用外部磁力分离磁性颗粒。这里，适用于目标分子传感平台中的磁性颗粒，需要(i)最小化悬浮溶液中各种非特异性物质的非特异性吸附，(ii)保持来自各种生化环境的胶体颗粒的稳定性，和(iii)促进各种官能团的表面结合。为了形成防污生物界面，颗粒优选为亲水的和中性的并且含有氢键受体。为此，聚乙二醇化，即，用聚(乙二醇)涂覆颗粒的表面，所述聚(乙二醇)是一种生物相容性聚合物，迄今仍被认为是设计具有防污生物界面的纳米颗粒的最成功方式。精确吸附的peg层满足上面列出的要求，减少颗粒的非特异性吸附并增加稳定性。本发明人提供了一种制备超顺磁性纳米复合材料，即超顺磁性氧化铁纳米复合材料的方法，该复合材料适用于用于检测目标生物材料的磁分离。因此，所述制备超顺磁性纳米复合材料的方法与制备用于磁分离的磁性纳米颗粒的常规方法相比具有更高的产率和更高的速率并无需复杂的加工，并且能够大规模生产具有均匀尺寸和粒径分布、高水性溶液分散性和高磁化强度并且能够保持超顺磁性的优异性能的超顺磁性纳米复合材料，从而最终实现本发明。技术实现要素：技术问题因此，本发明旨在提供一种制备超顺磁性纳米复合材料的方法，该方法具有更高的产率和高速率并无需复杂的加工，并且能够大规模生产具有均匀尺寸和粒径分布、高水性溶液分散性和高磁化强度并且能够保持超顺磁性的优异性能的超顺磁性纳米复合材料，并且还旨在提供通过该方法制备的超顺磁性纳米复合材料。技术方案本发明提供一种制备超顺磁性纳米复合材料的方法，其包括：混合铁前体、溶剂、稳定剂和还原剂；使混合步骤中的混合溶液在150～300℃，优选200～240℃，和更优选200℃的温度下，以及1.5～10巴，优选1.5～6巴和更优选1.5～2.5巴的压力下进行水热合成以合成纳米团簇形式的超顺磁性纳米复合材料；以及分离合成的超顺磁性纳米复合材料。根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法可进一步包括用极性溶剂洗涤分离的超顺磁性纳米复合材料。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，铁前体可选自由六水合氯化铁(fecl3·6h2o)、氯化亚铁、四水合氯化亚铁、氯化铁和九水合硝酸铁(fe(no3)3·9h2o)组成的组，优选选自由六水合氯化铁(fecl3·6h2o)、氯化亚铁、四水合氯化亚铁和氯化铁组成的组。更优选使用六水合氯化铁(fecl3·6h2o)。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，溶剂可选自由乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、二丙二醇和甘油组成的组。优选使用乙二醇。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，稳定剂可以是具有羧基的化合物。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，稳定剂可以选自由二水合柠檬酸三钠(hoc(coona)(ch2coona)2·2h2o；c6h5na3o7)和分子量为500至50,000，优选2000至8000，和更优选2000的聚(乙二醇)二羧酸组成的组。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，还原剂可选自由乙酸钠、丙烯酸钠、尿素、甲酸钠和乙酸铵组成的组。优选使用乙酸钠。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，铁前体和溶剂可以1:10至1:300，优选1:40至1:200的摩尔比混合。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，铁前体和稳定剂可以1:0.0000013至1:1，优选1:0.0000013至1:0.8的摩尔比混合。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，铁前体和还原剂可以1:1至1:20，优选1:3至1:15，并且更优选1:7至1:15的摩尔比混合。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，极性溶剂可选自由乙醇、水、甲醇、丙酮、液氨、乙酸乙酯、乙醚、四氢呋喃、氢氧化钾、氢氧化钠和二氯甲烷组成的组。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，分离合成的超顺磁性纳米复合材料可以使用离心机或使用磁力来进行，其中每种都可以使用通常有用的方法进行。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，用极性溶剂洗涤分离的超顺磁性纳米复合材料可以以如下方式进行：用极性溶剂洗涤在分离合成的超顺磁性纳米复合材料期间分离的超顺磁性纳米复合材料以除去杂质，由此赋予超顺磁性纳米复合材料高稳定性和均匀的颗粒分布。极性溶剂可包括选自乙醇、醇、液氨、丙酮、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、四氢呋喃、氢氧化钾、氢氧化钠、二氯甲烷和水中的任何一种。在用极性溶剂洗涤分离的超顺磁性纳米复合材料期间，用极性溶剂洗涤分离的超顺磁性纳米复合材料优选进行三次。这里，洗涤过程的次数不限于3，而是洗涤过程可以进行一次或若干次，并且洗涤过程次数这种简单的修改落入本发明的范围内。同时，超顺磁性纳米复合材料可以不进行用极性溶剂洗涤分离的超顺磁纳米复合材料而制备，但为了显示出如上所述的高稳定性和均匀的颗粒分布，优选用极性溶剂洗涤分离的超顺磁性纳米复合材料。用极性溶剂洗涤分离的超顺磁性纳米复合材料可以使用通常有用的方法中的任何一种来进行。在此，用极性溶剂洗涤分离的超顺磁性纳米复合材料可以使用离心机来进行，其是通常有用的方法中的一种，并且在分离合成的超顺磁性纳米复合材料期间同时实现超顺磁性纳米复合材料的分离和洗涤落在本发明的范围内。这是因为分离合成的超顺磁性纳米复合材料可以通过初级程序和次级程序等单独进行，并且可以同时包括分离和洗涤。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，用极性溶剂洗涤分离的超顺磁性纳米复合材料可包括用乙醇溶剂洗涤分离的超顺磁性纳米复合材料，和用水溶剂洗涤用乙醇溶剂洗涤过的超顺磁性纳米复合材料。使用乙醇溶剂的洗涤过程使用乙醇溶剂进行，乙醇溶剂是促进溶剂和还原剂溶解的极性溶剂，凭此最终获得的超顺磁性纳米复合材料可以具有有利的性质，例如表面电荷等。此外，用水溶剂洗涤已经用乙醇溶剂洗涤过的超顺磁性纳米复合材料是有利的，因为可以实现在去离子水水性溶液中的分散，使能够实现用于检测目标生物材料的磁分离。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，可以使用稳定剂的羧酸根(coo-)基团调节超顺磁性纳米复合材料在水性溶液中的分散性。在根据本发明的制备超顺磁性纳米复合材料的方法中，超顺磁性纳米复合材料的直径可以为100nm至450nm。超顺磁性纳米复合材料的直径优选为150nm至400nm，以及更优选为200nm至350nm。此外，本发明提供通过上述方法制备的超顺磁性纳米复合材料。在根据本发明的超顺磁性纳米复合材料中，超顺磁性纳米复合材料的直径可以为100nm至450nm。超顺磁性纳米复合材料的直径优选为150nm至400nm，以及更优选为200nm至350nm。在根据本发明的超顺磁性纳米复合材料中，超顺磁性纳米复合材料可包含直径大于0至10nm的磁性纳米晶体，其中磁性纳米晶体的表面通过羧酸根(coo-)基团稳定，其中超顺磁性纳米复合材料可以具有聚集在其中的多个磁性纳米晶体，其具有直径为100nm至450nm的纳米簇状形状并且具有亲水性以便分散在水性溶液中。超顺磁性纳米复合材料可具有直径为100nm至450nm，以及更优选为200nm至350nm的纳米簇状形状。在根据本发明的超顺磁性纳米复合材料中，磁性纳米晶体可以是直径大于0至10nm的fe3o4。此外，本发明提供一种超顺磁性纳米复合材料，其包含直径大于0至10nm的fe3o4磁性纳米晶体，其中所述磁性纳米晶体的表面通过羧酸根(coo-)基团稳定，其中所述超顺磁性纳米复合材料具有聚集在其中的多个磁性纳米晶体，其具有直径为100nm至450nm的纳米簇状形状并且具有亲水性以便分散在水性溶液中。所述超顺磁性纳米复合材料可具有直径为100nm至450nm，以及更优选为200nm至350nm的纳米簇状形状。有益效果根据本发明，制备超顺磁性纳米复合材料的方法与制备用于磁分离的磁性纳米颗粒的常规方法相比具有更高的产率和高速率且无需复杂的加工，并且能够大规模生产具有均匀尺寸和粒径分布、高水性溶液分散性和高磁化强度并且能够保持超顺磁性的优异性能的超顺磁性纳米复合材料。由于该方法制备的超顺磁性纳米复合材料具有高磁化强度且能够保持超顺磁性，该超顺磁性纳米复合材料能用于检测目标生物材料的磁分离中。附图说明图1示意性地示出了根据实施例1和2的制备具有磁性纳米簇状形状的超顺磁性纳米复合材料(特别是，超顺磁性氧化铁纳米复合材料)的方法；图2示出了实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料的sem观察结果；图3示出了实施例1的超顺磁性纳米复合材料的尺寸测量结果；图4示出了实施例1的超顺磁性纳米复合材料的ζ电势的测量结果；图5示出了实施例2的超顺磁性纳米复合材料的尺寸的测量结果；图6示出了实施例2的超顺磁性纳米复合材料的ζ电势的测量结果；图7示出了实施例1的超顺磁性纳米复合材料的磁性测量结果；图8示出了实施例2的超顺磁性纳米复合材料的磁性测量结果；和图9示出了分离红细胞(rbc)之前和之后的管的照片以及分离的超顺磁性纳米复合材料和上清液的显微镜图像。具体实施方式通过以下实施例将更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明，而不应解释为限制本发明并且可以进行各种改变和修改。在本发明中，超顺磁性纳米复合材料是指具有直径为100～450nm，优选150～400nm，以及更优选200～350nm的纳米簇状形状的超顺磁性颗粒，其配置为直径为几纳米(直径大于0到10nm)的单个磁性颗粒，即磁性纳米晶体，聚集在其中。在本发明中，“室温”可以指，但不限于15℃至25℃，其使得工人能够进行最容易可行的反应，因为不需要升高或降低温度。取决于周围的条件和环境，上述温度可以高于或低于上述范围。这里，超顺磁性是可以使用磁力控制并且在没有磁力的情况下能够再分散的性质，并且超顺磁性纳米复合材料可以用于需要具有超顺磁性的磁性纳米颗粒的各种领域中。参考实施例1：材料制备六水合氯化铁(fecl3·6h2o，acs试剂，97％，mw＝270.30)、二水合柠檬酸三钠(hoc(coona)(ch2coona)2·2h2o；c6h5na3o7，99％，mw＝294.10)、无水乙酸钠(c2h3nao2，mw＝82.03)，和无水乙二醇(c2h6o2，99.8％，mw＝62.07)购自sigma-aldrich(st.louis，mo，usa)，聚(乙二醇)二羧酸(peg-二酸；聚乙二醇二酸(cooh-peg-cooh，mw＝2000)购自北京键凯科技股份有限公司(中国，北京)。超纯水(nanopureh2o；>18.0mω)使用milli-q水纯化系统进行纯化。实施例1：制备超顺磁性纳米复合材料的方法使用图1所示的方法合成实施例1的具有磁性纳米簇状形状的超顺磁性纳米复合材料(特别是超顺磁性氧化铁纳米复合材料)。将1.08g(0.1m，3.996mmol)fecl3·6h2o溶解在40ml乙二醇中并搅拌30分钟。此后，将0.8g(0.034m，2.720mmol)二水合柠檬酸三钠(tsc)加入到搅拌过的混合物中，然后以900rpm的速率进一步搅拌1小时。在确认柠檬酸三钠完全溶解完成后，向混合物中加入2.4g(0.731m，58.515mmol)乙酸钠，并进一步在900rpm下搅拌30分钟。此后，将搅拌过的混合物置于特氟隆管中进行水热合成，用不锈钢容器包封以密封，置于水热合成器中，以7℃/min的速率从室温加热至200℃。并在200℃下反应8小时至12小时，同时将温度保持在200℃。当温度达到最高温度(200℃)时，密封合成管的内压保持在1.5巴至2.5巴。在通过水热合成反应合成的产物中，通过磁分离除去上清液，且用30ml乙醇洗涤合成的颗粒五次，并且用去离子水洗涤五次，然后干燥，从而产生超顺磁性纳米复合材料。磁分离以如下方式进行：将样品置于钕永磁体上，并收集颗粒，由此除去上清液，从而分离颗粒。合成的颗粒也可以通过离心分离。如图1所示，形成磁性纳米晶体，即磁铁矿纳米晶体，其配置为其表面通过二水合柠檬酸三钠分子的羧酸根(coo-)基团稳定(即通过化学吸附或锚定二水合柠檬酸三钠分子的羧酸根(coo-)基团和fe-oh基团)，并且通过二水合柠檬酸三钠分子的羧酸根(coo-)基团使颗粒带负电，从而引起静电排斥，由此使颗粒稳定。同时，表面张力同时作用于聚集方向，从而降低了磁性纳米晶体的高表面能，并且通过静电排斥和表面张力的平衡形成了具有均匀尺寸的超顺磁性纳米复合材料。实施例2：制备超顺磁性纳米复合材料的方法使用图1所示的方法合成实施例1的具有磁性纳米簇状形状的超顺磁性纳米复合材料(特别是超顺磁性氧化铁纳米复合材料)。将2.16g(0.2m，7.991mmol)fecl3·6h2o溶解在40ml乙二醇中并搅拌30分钟。此后，将0.8g(0.034m，2.720mmol)0.02g(0.25mm，0.01mmol)peg-二酸(mw为2000的聚乙二醇二酸)加入到搅拌过的混合物中，然后进一步搅拌1小时。在确认peg-二酸完全溶解完成后，向混合物中加入2.4g(0.731m，58.515mmol)乙酸钠，并进一步搅拌30分钟。此后，将搅拌过的混合物置于特氟隆管中进行水热合成，用不锈钢容器包封以密封，置于水热合成器中，以7℃/min的速率从室温加热至200℃。并在200℃下反应8小时至12小时，同时将温度保持在200℃。当温度达到最高温度(200℃)时，密封合成管的内压保持在1.5巴至2.5巴。在通过水热合成反应合成的产物中，通过磁分离除去上清液，且用30ml乙醇洗涤合成的颗粒五次以及用去离子水洗涤五次，然后干燥，从而产生超顺磁性纳米复合材料。磁分离以如下方式进行：将样品置于钕永磁体上，并收集颗粒，由此除去上清液，从而分离颗粒。合成的颗粒也可以通过离心分离。如图1所示，形成磁性纳米晶体，即磁铁矿纳米晶体，其配置为其表面通过peg-二酸分子的羧酸根(coo-)基团稳定(即通过化学吸附或锚定peg-二酸分子的羧酸根(coo-)基团和fe-oh基团)，并且通过peg-二酸分子的羧酸根(coo-)基团使颗粒带负电，从而引起静电排斥，由此使颗粒稳定。同时，表面张力同时作用于聚集方向，从而降低了磁性纳米晶体的高表面能，并且通过静电排斥和表面张力的平衡形成了具有均匀尺寸的超顺磁性纳米复合材料。测试例1：超顺磁性纳米复合材料的物化性质1-1.用sem(扫描电子显微镜)观察超顺磁性纳米复合材料的形状使用sem(s-4700，日立，东京，日本)观察实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料，测定其尺寸和形状。结果如图2所示。图2示出了实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料的sem观察结果。如图2的sem图像所示，在簇的表面上观察到纳米晶体的簇状结构，并且超顺磁性纳米复合材料的粒径分布在实施例1中为305.9±24.7nm，以及在实施例2中为241.7±20.1nm。从实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料的sem图像显而易见，在测量超顺磁性纳米复合材料的分布时的相对标准偏差落在15％以内。因此，能够证实实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料具有均匀的尺寸和粒径分布。1-2.超顺磁性纳米复合材料的尺寸、分布和表面ζ电势分析使用zetasizer(nanozs，可从malvern获得)通过动态光散射粒径分析测量实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料的尺寸、分布和表面ζ电势。分析实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料的平均流体动力学直径、pdi(多分散指数){pdi＝(粒径的标准偏差/平均粒径)2}和表面ζ电势(三次重复测量)。结果示于下面的表1和2以及图3至6中。具体地，表1和2分别示出了实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料的平均流体动力学直径、pdi和表面ζ电势的结果。图3示出了实施例1的超顺磁性纳米复合材料的尺寸测量结果，图4示出了实施例1的超顺磁性纳米复合材料的ζ电势的测量结果。图5示出了实施例2的超顺磁性纳米复合材料的尺寸测量结果，以及图6示出了实施例2的超顺磁性纳米复合材料的ζ电势的测量结果。表1分类尺寸(nm)pdiζ电势(mv)第一次测量255.80.067-15.4第二次测量254.30.086-15.0第三次测量252.60.066-15.0平均值254.20.073-15.1表2分类尺寸(nm)pdiζ电势(mv)第一次测量268.70.100+24.3第二次测量273.10.136+25.7第三次测量273.40.077+26.0平均值271.70.104+25.3对于实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料的pdi，基于pdi范围为0至0.1时为近似单分散样品，pdi范围为0.1至0.7时为中等范围多分散样品，和pdi范围＞0.7时为沉降样品，实施例1和2的pdi值分别为0.073和0.104，其落在小于0.1至约0.1的范围内，对应于近似单分散。简而言之，实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料具有均匀的尺寸和粒径分布。此外，实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料的ζ电势分别为-15.1mv和+25.3mv，落在±10～30mv的ζ电势范围内，由此上述超顺磁性纳米复合材料颗粒被评估为通过静电排斥有效分散。实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料通过羧酸根(coo-)基团稳定，因此具有±10～30mv的ζ电势，从而在水性溶液中表现出高分散性。1-3.超顺磁性纳米复合材料的磁性分析为了评估实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料是否具有超顺磁性的高磁化强度并因此具有适用于磁分离的高分离能力，使用超导量子干涉装置测量了磁性。结果显示在图7和8中。图7和图8示出了超顺磁性纳米复合材料的磁滞回线，作为磁性测量的结果。如图7和8所示，实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料在300k的温度下表现出超顺磁性，且实施例1和2的饱和磁化强度值分别为76emu/g和87emu/g。铁磁材料不适合用于磁性纳米颗粒介导的分离技术，因为当具有高剩余磁化强度的铁磁材料重复经受外部磁场时，可强烈地发生颗粒的聚集。然而，通常难以在室温下保持磁性材料的超顺磁性。特别地，无论磁性材料或磁性复合材料的结构如何，容易发生超顺铁磁性转变取决于如何高效调节单个畴。尽管根据本发明的实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料被配置为成千上万的超顺磁性纳米晶体聚集，但是最终的簇，即直径为200nm至300nm的超顺磁性纳米复合材料不会引起铁磁性转变，而是有效地保持了其超顺磁性。此外，根据本发明的实施例1和2的超顺磁性纳米复合材料具有高磁化强度，因此具有适用于磁分离的高分离能力。测试例2：超顺磁性纳米复合材料的磁分离能力的分析2-1.使用超顺磁性纳米复合材料分离全血中红细胞(rbc)的分离测试为了评估实施例1的超顺磁性纳米复合材料的磁分离能力，以从全血中捕获和分离rbc的方式进行了测试，从而测量其分离能力。配置为磁性纳米晶体聚集的实施例1的超顺磁性纳米复合材料的表面通过edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)/磺基-nhs(n-羟基磺基琥珀酰亚胺)介导的共价键诱导方法用抗rbc抗体(fitzgerald，人类rbc抗体，cat#20r-rr006)官能化。具体而言，向10mg/500μl超顺磁性纳米复合材料颗粒中添加10mg/mledc和50μl磺基-nhs，在室温下搅拌15min，加入1mg抗rbc抗体，室温下搅拌2小时，然后用pbs(磷酸盐缓冲液)(ph7.4)洗涤5次。将含有0.5mg/25μl抗rbc抗体官能化的超顺磁性纳米复合材料的pbs(ph7.4)加入到25μl全血样品中，在室温下反应5分钟，然后进行磁分离，从而分离抗rbc抗体官能化的超顺磁性纳米复合材料。此后，在显微镜下观察分离的抗rbc抗体官能化的超顺磁性纳米复合材料和上清液以计数rbc的数量，并且基于下面的等式1计算rbc分离能力(％)。结果如图9所示。[等式1]rbc分离能力(％)＝捕获的rbc数量/(捕获的rbc数量+未捕获的rbc数量)×100如图9所示，在左边的管照片中，其中全血样品和抗rbc抗体官能化的超顺磁性纳米复合材料混合，通过与超顺磁性纳米复合材料表面的抗体的特异性反应捕获rbc，并且通过外部磁场分离磁性颗粒，凭此红色的全血被超顺磁性纳米复合材料分离并变得透明。当在显微镜下观察分离的rbc和通过抗体与rbc结合的超顺磁性纳米复合材料时，看到rbc(浅色)和超顺磁性纳米复合材料(相对深黑色)彼此有效结合，并且没有观察到仅存在rbc的部分。此外，上清液的显微镜图像表明未观察到rbc。基于等式1计算的超顺磁性纳米复合材料的rbc分离能力为99.5％。因此，使用磁性颗粒，在短短5分钟的反应时间内，从含有过量非目标免疫球蛋白的全血中特异性地仅捕获和分离目标rbc，并从而迅速分离。当前第1页12