一种多巴胺功能化磁性纳米载体的制备及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于蛋白质的固定化领域，涉及一种多巴胺功能化磁性纳米载体的制备及其应用。
【背景技术】
[0002]酶主要是由蛋白质组成的具有催化活性的物质，由于其催化活性高和对底物转一性强等特点，在食品、酿造、医药、环境和化学制品等领域具有广泛的应用前景。但是，游离酶的稳定性差，极易在极端条件如高温、强酸和强碱下变性失活，而且其在催化反应后难以与底物及产物分离，造成了产品污染和生产成本的增加，大大的限制了其在工业上的应用。为了解决以上游离酶的不足，20世纪60年代提出了固定化酶的概念，酶固定化是指使酶在一定空间内呈闭锁状态的过程，制备的固定化酶能连续进行催化反应。研究结果表明，固定化酶不仅保持了酶的专一性和高效性，同时也增强了酶的稳定性，容易与底物及产物分离，实现回收利和连续化生产，提高了产品的产率及质量。
[0003]磁性纳米材料作为一种新型材料，具有毒性小、磁响应强、易分离回收和成本低等优点，在固定化酶领域有着不断深入的研究及应用(参见Ugelstad, H.R.Mfutakamba, P.C.M0rk，et al., Preparat1n and applicat1n of monodispersepolymer particles.J.Polym.Sc1.Polym.Symp，1985) DKouassi等以EDC活化的磁性Fe3O4纳米粒子为载体，成功的制备了固定化胆固醇氧化酶，并将其用于血清中胆固醇含量的分析(参见:G.K.Kouassi , J.1rudayaraj , G.McCarty.Examinat1n ofCholesterol oxidase attachment to magnetic nanoparticles，J.Nanob1technology，2005)DPan等利用戊二酸为活化剂，将β-D-galactosidase共价固定于表面包覆有壳聚糖的磁性Fe304纳米载体上，实验结果表明，所制得的固定化的β-D-galactosidase具有较高的酶活力和稳定性(参见:C.Pan, B.Huj ff.Li，et al.Noveland efficient method for immobilizat1n and stabilizat1n of β-d-galactos idase by covalent attachment onto magnetic Fe3〇4-chitosannanoparticles.J.Mol.Catal.B Enzym.2009) jural等首先米用SiC>2修饰磁性Fe3〇4纳米粒子，然后再利用γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷对其进行修饰，使其表面带有环氧基功能基团，以此功能性粒子为载体对苯甲酰甲酸脱羧酶进行固定化，可得到载酶量为6.75mg/g，酶活收率为53%的固定化酶(参见:B.Tural，T.Tarhan，S.Tural，Covalent immobilizat1n of benzoylformate decarboxylase from Pseudomonasputida on magnetic epoxy support and its carboligat1n reactivity, J.Mol.Catal.B Enzym.2014)。然而，这些固定化方法不仅操作繁琐，而且需要加入偶联剂，对酶的活性有一定的影响，需要改进。本发明利用多巴胺(dopamine)对磁性纳米粒子进行包覆，得到功能化磁性载体表面具有大量醌基及氨基的，生物兼容性优异，能够在极温和条件下与酶蛋白发生共价反应，实现酶蛋白的共价固定化。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种高效的共价固定化酶等蛋白质的方法，无需加入偶联剂，且操作简便。
[0005]本发明的另一目的是提供这种用于有效共价固定化酶等蛋白质的功能化磁性纳米载体的制备方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一种多巴胺功能化磁性纳米载体的制备方法，包括如下步骤:
(I)将FeS044H20和FeC136H20充分溶于蒸馏水中，然后转移至三颈圆底烧瓶中，在合适温度下，高速搅拌和氮气保护条件下，迅速加入25% NH4OH的氨水反应后，加入油酸;搅拌反应后获得的黑色沉淀用无水乙醇和超纯水反复清洗至上清液无色透明，强磁铁沉淀分离，于真空烘箱中50°C烘干，得到油酸磁性纳米颗粒称为Fe3O4OOA。
[0007](2)称取一定量的多巴胺盐酸盐溶解于Tris-HCl溶液中，配制成多巴胺盐酸盐溶液;将上述制备的油酸磁性纳米颗粒研磨均匀加入到多巴胺盐酸盐溶液中，超声混匀后反应，反应结束置空气中快速搅拌;搅拌结束后，用磁铁分离，获得的深棕色沉淀用乙醇和蒸馏水清洗，于真空烘箱中50°C烘干，得到磁性纳米颗粒称为多巴胺功能化磁性纳米载体，记为 Fe304@0A@DP。
[0008]其中，步骤(I)中所述FeS044H20和FeC136H20的摩尔比为1:1?1:5;
所述的合适温度为50-90 °C；
所述FeS044H20的物质的量与25% NH4OH的体积比例为0.5?2 mmol/mL；
所述加入氨水后反应时间为5-20min ；
所述加入的油酸体积为总溶液体积的0.1-1%；
所述搅拌反应时间为20-50min;
其中，步骤(2)中所述多巴胺盐酸溶液的浓度为I?10 mg/mL;优选为2 mg/mL；
所述多巴胺盐酸溶液中油酸磁性纳米颗粒的浓度为10 mg/mL；
所述超声时间为10?50 min;反应温度为25-30 °C，反应时间为2_24 h；
所述快速搅拌时间为12 ho
[0009]上述方法所得到的多巴胺功能化磁性纳米载体用于酶等蛋白质的固定化的应用，具体应用方法为:
称取干燥的多巴胺功能化磁性纳米载体(磁性Fe304@0A@DP纳米载体)多份，分别加入经缓冲液稀释的蛋白质或酶溶液，振荡混匀后固定化反应，通过Fe3O4OOAODP表面的醌基与蛋白质或酶分子中的氨基发生化学反应将蛋白质或酶固定在载体表面;反应结束后，离心收集固定化蛋白质或酶，固定化蛋白质或酶用缓冲液洗涤，计算固定化效率。
[0010]所述蛋白质或酶，包括脂肪酶，纤维素酶或青霉素G酰化酶。
[0011 ]所述缓冲液为pH 6.0-9.0磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液。
[0012]本发明的有益效果如下:
(I)该载体表面有一层松软的聚多巴胺氧化膜，表面积较大，且制备方法简单。本发明采用了三种不同的，且形状各异的蛋白质用于固定化，利用功能化磁性纳米粒子作为固定化载体，能够高效地进行固定化，固定化收率与固定化效率均可高达80-90%。
[0013](2)本发明无需偶联剂，本发明采用多巴胺盐酸盐对磁性油酸纳米粒子进行修饰，使磁性纳米粒子表面带有大量的醌基和氨基功能性基团，可直接与蛋白质中游离的氨基发生共价反应，能够有效地固定化蛋白质；
(3)本发明可用于形状各异的蛋白质的固定化，适用范围广；
(4)本发明可采用多巴胺对其他不同载体表面进行修饰，使其多巴胺功能化，制备出具有不同特性的固定化载体；
(5)本发明较其他固定化方法，减弱了固体载体对蛋白质分子的摆动自由度的限制，提高了固定化酶的活力，具有较好的固定化效率；
(6)本发明提高了蛋白质固定化的收率与效率，且操作简单。
【附图说明】
[0014]图1为实施例1制备的磁性纳米粒子Fe3O4OOA与Fe3O4OOAODP的TEM图。
[0015]图2为实施例1制备的Fe3O4OOA与Fe3O4OOAODP的红外分析图。
[0016]图3为实施例1的固定化的酶浓度图。
[0017]图4为实施例2的固定化的酶浓度图。
[0018]图5为实施例3的固定化的酶浓度图。
[0019]图中，■为蛋白质固定化收率;?为酶活力回收收率即固定化效率。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0021]以下实施例所用主要仪器和材料。
[0022]实验材料:考马斯亮蓝G-250、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三羟甲基氨基甲烷、一水柠檬酸、柠檬酸钠、氯化铁(FeCl36H20)、硫酸亚铁(FeS044H20)、异丙醇、无水乙醇、硝基苯酚(P-NP)、对硝基棕榈酸酯(p-NPP)、曲拉通(TritonX-100)、多巴胺盐酸盐。
[0023]实验仪器:紫外可见分光光度计(UV-2450/2550，日本岛津制作所)、水浴恒温振荡器(SHZ-88，江苏省金坛市医疗仪器厂)、电热恒温鼓风干燥箱(Q/BKYY31-2000，上海跃进医疗器械厂)、Thermo Fisher离心机(PIC0-17，美国Thermo Scientific公司)、快速混勾器(SK-1，江苏省金坛市中大仪器厂)、Genex Beta移液器(DU/DC，上海康敏检验设备有限公司)；电子天平(FA1004，上海市安亭电子仪器厂)、集热式磁力加热搅拌器(DF-1I，江苏金坛市医疗仪器厂)、真空干燥箱(DZF-6020，上海一恒科技有限公司)。
[0024]实施例1:固定化脂肪酶<