专利名称:具有增强的蛋白酶活性的曲霉非继承性遗传变异体及使用该变异体的制备天然味道增强 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有增强的蛋白酶活性的酱油曲霉突变株及一种使用该突变株制备天然味道增强剂的方法。
背景技术：
在制备酱油、大豆酱(传统的发酵豆瓣酱)等时，使用是曲霉属的米曲霉和酱油曲霉，来产生诸如蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等的酶。蛋白酶使蛋白质降解成肽和氨基酸，并且，当降解蛋白质时，谷氨酰胺酶通过将游离谷氨酰胺转化成可口的谷氨酸而在对酱油、大豆酱等调味中起重要作用。
因此，进行了许多研究以改进在调味中起重要作用的蛋白酶或谷氨酰胺酶的酶活性。微生物突变的方法有如下几种通过紫外线照射、诱变剂处理以及分离出具有高活性的突变株的辐射(H. Sekine 等，Agric. Biol. Chem.，33，1477 (1969)，S. Nasuno 等，J. Ferment. Technol.，55，273 (1977)，S. Yamamoto 等，J. Ferment. Technol.，52，564 (1974))或通过细胞融合技术制造高活性菌株，在该菌株中两个酶的活性都很高(Shingeomi Ushijima 等，Agric. Biol. Chem.，51 (4) ,1051-1057 (1987)，Shingeomi Ushijima 等.Agric. Biol. Chem. 51 ；2781-2786(1987), Shingeomi Ushijima 等.Agric. Biol. Chem. 54 ； 1667-1676, (1990)，Shigeomi Ushijima 等· Agric. Biol. Chem.，55(1)，129-136，(1991))。
酱油和大豆酱很难广泛应用于食品中，因为在固态发酵过程中，不可避免各种细菌污染，所以需要添加高浓度的食盐。因此，通过在液态培养菌株而消除各种细菌污染，然后将培养基应用到蛋白质，而不添加食盐(日本专利公开号8-173085A和8-M^10A)，来进行使用它们作为调味料的研究。
随着研究的进行，也开展了对在米曲霉和酱油曲霉的液体培养过程中制备蛋白酶或谷氨酰胺酶的研究(S. Ueno 等，Appl, Microbiol. Biotechnol.，26，273 (1987)，日本专利公开号 3-277289A, T. Yano 等，Agric. Biol. Chem.，55 (2)，379 (1991)，日本专利公开号 10-210967A)。
然而，它们中的大多数具有低活性等级。即使谷氨酰胺酶具有很高的活性，谷氨酰胺也应当首先被蛋白酶切割以期待将谷氨酰胺转化成谷氨酸，从而赋予食物可口味道的谷氨酰胺酶效果。
发明内容
因此，本发明的发明人为了制备具有高含量谷氨酸的蛋白水解物制备了具有增强的蛋白酶活性的酱油曲霉突变株，并能够制备由于使用水解蛋白而具有可口味道的天然味道增强剂。
因此，本发明的目的在于提供一种具有增强的蛋白酶活性的酱油曲霉突变株。
此外，本发明的其他目的在于提供使用上述酱油曲霉的突变株制备天然味道增强剂的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种具有增强的蛋白酶活性的酱油曲霉突变株，其源自酱油曲霉CJCC_011057P(KCCM-11043P)，通过N-甲基-N'-亚硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理并通过辐射诱导突变。
此外，本发明提供了一种制备天然味道增强剂的方法，所述方法包括(a)培养酱油曲霉的突变株；(b)通过添加从上述(a)中获得的培养物水解蛋白源；以及(c)将从上述 (b)中获得的水解蛋白溶液浓缩/干燥并形成粉末。
如上所述，根据本发明的酱油曲霉的突变株与它的亲本菌株相比，具有更高的蛋白酶活性。通过水解蛋白源及其培养物获得的蛋白水解物具有高降解度和高含量的谷氨酸，从而当将其应用在食物中时，与传统的蛋白水解物相比，它可以作为具有丰富口感及可口味道的天然味道增强剂。
具体实施方式
下文中，将详细描述本发明。
本发明提供了一种具有增强的蛋白酶活性的酱油曲霉突变株，通过选择具有高蛋白酶活性的菌株并用N-甲基-N'-亚硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理该菌株并通过辐射诱导突变。
从样品中分离生成蛋白酶的微生物，所述样品来自全国各地，例如发酵的大豆块、 大豆酱、酱油等。然后从这些样品中纯培养具有高蛋白酶活性的菌株并在本发明中被用作亲本菌株。优选地，用于本发明的亲本菌株可以是酱油曲霉CJCC_011057P (KCCM-11043P)。
对于本发明，诱导突变的方法可包括用诱变剂诱导化学突变的方法，所述诱变剂例如N-甲基-N'-亚硝基-N-亚硝基胍(NTG)、羟胺、一氧化氮、乙基甲磺酸(EMS)、硫酸二甲酯等；通过照射紫外线、X射线、辐射等诱导突变的方法；没有进行突变处理而获得的自发突变；等等。
对于本发明，用通常并普遍用作诱变剂的N-甲基-N'-亚硝基-N-亚硝基胍 (NTG)来处理上述分离的酱油曲霉，然后照射使得突变株生长良好并能通过选择获得高蛋白酶活性。根据本发明的具有高蛋白酶活性的酱油曲霉突变株的蛋白酶活性，大约比亲本菌株的蛋白酶活性高5至8倍。优选地，根据本发明的酱油曲霉的突变株可以是酱油曲霉 CJCC_080124P(KCCM-11026P)。
此外，本发明提供了一种制备天然味道增强剂的方法，该方法包括(a)培养酱油曲霉的突变株；(b)通过添加从上述(a)中获得的培养物来水解蛋白源；以及(c)将从上述 (b)中获得的水解蛋白溶液浓缩/干燥并形成粉末。
蛋白源包括，例如，大豆、小麦、玉米粉、大米、鱼粉、牛奶蛋白、胶原等。此外，可以使用脱脂大豆、分离的大豆蛋白、小麦蛋白、玉米面筋、脱脂米糠、大米蛋白、鱼蛋白和通过例如脱脂、膨胀或增溶的过程获得的各种蛋白，或从这些各种蛋白中分离的蛋白。
可通过使用培养根据本发明的酱油曲霉突变株而获得的培养物来进行水解。
根据本发明的酱油曲霉的突变株的培养物实际上可优选地用作液体培养物，但是必要时也可以使用从培养物中分离和纯化的酶。也就是说，可以使用这样的酶，即，通过常规的分离方法，通过从细胞裂解物或培养液中离心分离或过滤以及沉淀蛋白质而将细胞与液体培养物分离，并通过使用超滤来浓缩产物而制备的酶，所述常规的分离方法包括盐析法、等电沉淀、溶剂沉淀等。此外，通过一般的提纯方法分离然后收集的炼制品可以单独或组合使用。
根据目的，可以将含有蛋白酶、溶菌酶、谷氨酰胺酶等的市售酶制剂，例如，酶溶液或酶制剂添加到培养物中。
随着水解条件，将酱油曲霉的突变株的培养物加入到脱脂大豆、小麦蛋白等，并优选地，以20 60°C反应6小时到15天。优选地，以30 50°C反应M/小时到10天。
水解结束后，可以通过一般的制备方法去除蛋白水解物中没有完全水解的蛋白质和不溶物，然后在浓缩/干燥后使分离的液相形成粉末，所述一般的制备方法例如离心分离或过滤。
根据对游离氨基酸的含量、谷氨酸的含量以及总氮量的测量结果，根据本发明的方法的蛋白水解物具有高降解度和高含量的谷氨酸，从而表现出了丰富的口感和可口的味道。
<实施例>
实施例1 菌株的分离和诜择
对5g的每个样品进行连续稀释，所述样品例如从全国各地收集获得的发酵大豆块、大豆酱(传统豆瓣酱)、酱油等；加入0. 1 %吐温80 ；然后将稀释的样品涂布到含有 0. 1% Triton X-100的最小琼脂板(察氏琼脂)上。其以30°C培养3天至4天，然后分离菌落周围具有大透明带(clear zone)的菌株。
将分离的菌株再次接种在最小液体培养基中(察氏肉汤培养基；0. 3% NaN03、 0. 1% K2HPO4^O. 05% MgSO4. 7Η20、0· 05% KCl、0· 001% FeSO4. 7Η20、3%蔗糖)，然后以 30°C培养3天至4天。通过离心分离去除细胞，收集上清，然后通过使用酪蛋白作为底物测定和比较蛋白水解能力。
在菌株中，选择具有优良蛋白水解能力的菌株，并接种在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) 斜面培养基上，然后以30°C培养4天至7天。此后，获得孢子悬液(孢子数约lxl06/ml)， 将0. Iml的孢子悬液涂布到具有蛋白酶活性的筛选培养基上脱脂奶粉、0. 5% KH2PO4,
葡萄糖、0. 1% TritonX-100、2%琼脂)，然后以30°C培养3天至4天以选择具有大的透明带的菌株。将选择的菌株接种在含有脱脂奶粉的最小液体培养基中，并以30°C振荡培养3天至4天，然后除去细胞。选择出具有最高蛋白酶活性的菌株。
选择的菌株被称为“酱油曲霉CJCC_011057P”，于2009年10月8日在隶属于韩国培养物保藏联邦(KFCC)的韩国微生物保藏中心(KCCM)，以保藏号KCCM 11043P保藏，该培养中心是位于韩国首尔市西大门区弘济1洞361-221番地的国际保藏机构。
实施例2 酱油曲霉菌株的改进
(I)NTG 诱变
将上述酱油曲霉CJCC_011057P(KCCM 11043P)在PDA斜面培养基上培养，以获得孢子悬液。将3mg/ml的N-甲基-N'-亚硝基-N-亚硝基胍(NTG)溶液与等量的孢子悬液混合，随后以30°C培养1小时。
将孢子悬液涂布到PDA培养基上以选择存活的菌落，然后在PDA斜面培养基上培养选定的存活菌落，以30°C培养4至7天。选择大约至少1，000个突变株，然后以30°C在液体培养基(3%脱脂大豆、0. 5% KH2PO4U. 5%酵母提取物、1. 5%葡萄糖、0. 05%硫酸镁) 中培养48小时以测定蛋白酶活性。依据蛋白酶活性测定的结果，选择具有高活性的菌株， 然后连续诱导菌株的突变。
(2)辐射诱变NTG诱变后，选择大约至少200个具有高蛋白酶活性的突变株在PDA 斜面培养基上培养以获得孢子悬液，然后用0. 3KGy辐射1小时。将孢子悬液涂布到PDA培养基上以选择存活的菌落，然后在PDA斜面培养基上培养选择的存活菌落，以30°C培养4天至7天。
选择大约至少1，000个突变株，然后以30°C在液体培养基(3%脱脂大豆、0.5% KH2PO4U. 5%酵母提取物、1. 5%葡萄糖、0. 05%硫酸镁)中培养48小时，以测定蛋白酶活性。
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根据Anson-Hagihara的方法，使用酪蛋白作为底物测定蛋白酶活性(B. Hagihara 等，1958，J. Biochem. 45 (1958)，185-94)。
将400 μ 1 的 0. 75% 酪蛋白溶液和 100 μ 1 的 0. 24Μ Nei2HPO4 溶液(pH 7. 5) VX 37 V 预培养5分钟，并加入100 μ 1的每种选择的突变菌株的培养液；然后以37°C培养10分钟。 添加600 μ 1的与等量的(1)0. IM TCA(2)0. 22Μ醋酸钠和(3)0. 33Μ醋酸混合的混合物溶液， 以使反应停止。将200 μ 1的反应溶液的上清加入到500 μ 1的0. 55Μ的碳酸钠溶液中，然后加入稀释两倍的100 500 μ 1的市售酚试剂，然后搅拌。之后，以30°C培养30分钟，并在660nm测量吸光度。将产生相当于1 μ g/min酪氨酸的非蛋白福林的TS着色物质的酶的量定义为IU。
作为通过上述方法诱导突变的结果，选择了具有良好长势和高酶活性的突变株。 其被称为“酱油曲霉CJCC_080124P”，于2009年8月14日在隶属于韩国培养物保藏联邦 (KFCC)的韩国微生物保藏中心(KCCM)，以保藏号KCCM 11026P保藏，该培养中心是位于韩国首尔市西大门区弘济1洞的国际保藏机构。
将酱油曲霉CJCC_080124P(KCCM 11(^6P)的突变株的蛋白酶活性与其亲本菌株作比较，结果是突变株的活性大约高于其亲本菌株活性的6倍。获得的结果高于200 450 单位的米曲霉FERM P-14259的蛋白酶活性的3-8倍，米曲霉FERM P-14259是在常规日本专利公开号S-M^lOA和7-274944A中使用的具有高活性的突变株；并且高于1，000U/ ml的米曲霉J117331 (FERM P-15956)的蛋白酶活性，米曲霉J117331是在日本专利公开号 10-210967A中公开的具有高蛋白酶活性的突变株。因此，相比于常规专利或文献中已经公开的具有高活性的突变株的蛋白酶活性，酱油曲霉CJCC-080124P(KCCM 11026P)的突变株具有最高等级的蛋白酶活性。
本发明使用了多种诱变处理和各种诱变方法改良菌株，从而开发具有至少 1, 000U/ml的菌株，认为l，000U/ml几乎是当培养在液体培养基时蛋白酶活性的阈值。然而，使已经高水平改进的菌株具有高于l，000U/ml的活性，是有局限的。因此，进一步执行了若干辐射以重复改进，并最终可以获得具有l，800U/ml活性的突变株。
[表 1]
6
权利要求
1.1.具有增强的蛋白酶活性的酱油曲霉突变株，所述突变株源于酱油曲霉 CJCC_011057P (KCCM-11043P)，通过用N-甲基-N’ -亚硝基-N-亚硝基胍处理并通过辐射诱导突变。
2.根据权利要求
1所述的酱油曲霉突变株，其中，所述酱油曲霉的突变株是酱油曲霉 CJCC_080124P(KCCM11026P)。
3.一种天然味道增强剂的制备方法，所述方法包括(a)培养根据权利要求
1或2所述的酱油曲霉的突变株；(b)通过添加从上述(a)中获得的培养物水解蛋白源；以及(c)将从上述(b)中获得的水解蛋白溶液浓缩/干燥并形成粉末。
4.根据权利要求
3所述的方法，其中，向所述培养物中进一步添加含有蛋白酶、溶菌酶或谷氨酰胺酶的酶溶液或酶制剂。
5.根据权利要求
3所述的方法，其中，所述水解以20°C至60°C反应6小时至15天。
专利摘要
本发明涉及一种具有增强的蛋白酶活性的酱油曲霉突变株及一种使用该突变株的天然味道增强剂的制备方法。更具体地讲，本发明涉及一种具有增强的蛋白酶活性的酱油曲霉的突变株，其通过选择具有高蛋白酶活性的菌株并用N-甲基-N'-亚硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理该菌株，以及通过辐射诱导突变而获得。并且，本发明涉及使用通过水解具有蛋白源培养物的蛋白源而获得的蛋白水解物的天然味道增强剂的制备方法。
文档编号C12N15/01GKCN102575245SQ200980161976
公开日2012年7月11日 申请日期2009年10月29日
发明者池玄, 赵成捘 申请人:Cj第一制糖株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan