专利名称：：一种黑平菇提取物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种黑平菇提取物及其制备方法与应用，特别涉及一种黑平菇抗植物病毒的蛋白提取物及其制备方法与其在防治植物病毒病中的应用。
背景技术：
：TMV)属于烟草花叶病毒属(7b6amoWrwsC^o叩)，病毒为单链RNA，呈螺旋状。寄主范围广泛，可侵染番茄、辣椒、烟草等多种植物，田间最显著的症状是花叶、叶片畸形和植株矮縮，田间发病率一般在5%-20%，造成损失可达30%~50%，严重者绝收，是农业生产上的重要病害之一。生产中，已有多类化学源抗植物病毒农药在应用，但其效果并不十分理想，且随着植物抗药性的增加和人们对生态环境的重视，化学源农药的发展受到了限制。近几年，人们把抗植物病毒的研究重点聚焦在寻找环境友好型且抗病毒活性更高的天然产物上。椐报道一些微生物中含有抑制植物病毒的活性物质，缺点是这些微生物一般较为昂贵，大规模生产存在困难，且获得其活性物质的操作步骤较为繁琐，不利于实际生产中的应用。平薛(/^/e"rotusostrea加)，属担子菌亚门(5asWo/n7co"朋)，侧耳属(尸Je"rofus)。其具有该属的主要形态特征，担子果单生或丛生，菌盖直径4-15cm，扇形，边缘内巻；菌褶延生，可达10ram宽，中等密度，具小菌褶；菌柄侧生或稍偏生；菌丝系统为单系菌丝型，所有菌丝具锁状联合。该菌分布广泛，易于大规模培养，且生长迅速、产量高。黑平菇是平菇的一个菌株，其子实体颜色为深黑色，色泽的深浅随温度的变化而有变化，栽培简易，深层发酵生物量高，品质好。到目前为止，国内外尚未有关于黑平菇菌株提取物抗植物病毒的任何报道。本发明首次以黑平菇为材料，对其菌丝粗提液进行了生物活性分析，并对其抗病毒活性物质进行了提纯和性质研究，为抗TMV的生物源农药开发提供了材料和技术支持。
发明内容本发明的目的是提供一种黑平菇提取物及其制备方法与应用。本发明所提供的黑平菇提取物的制备方法，是将黑平菇菌丝粉与pH值为7.0-9.0的磷酸缓冲液(PBS)混合，在2-6"C浸提，离心后的上清液即为黑平菇的菌丝粗提液。所述方法中，黑平菇菌丝干粉的重量与磷酸缓冲液的混合比例为lg:10-20ml。所述方法中，磷酸缓冲液的pH值为8.0;所述浸提的时间为l-3小时。所述方法中，黑平菇菌丝干粉为黑平菇菌丝接种于液体培养基上，于2rc-36t:间培养3-8天后的菌丝干燥粉碎所得；所述液体培养基成分为18g/L马铃薯淀粉、25g/L葡萄糖、30g/L玉米粉、25g/L豆浆粉、8g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、3g/L牛肉膏、3g/LKH2P04、lg/LK2HP04、1.5g/LMgS04、30mg/LVB!。所述方法中，菌丝培养的时间为3-8天，优选为5天。所述方法中，黑平燕菌丝粉的粒径为60目以下。所述方法中，黑平菇提取物溶液还经过下述步骤的提取1)将所述黑平菇的菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，于2~6"放置6~12小时后，离心，收集上清液；2)在通过步骤l)得到的上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于26"C放置6~12小时后，离心，收集沉淀得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。本发明所提供的黑平菇提取物为上述方法制备的黑平燕提取物。本发明黑平菇提取物可用于防治烟草花叶病毒。具体方法为将上述黑平菇提取物用水稀释至总蛋白浓度为100-200ug/ml的黑平菇提取物溶液，喷施于长势一致的3-4叶期烟草上。本发明的黑平菇提取物对烟草花叶病毒具有很好的抑制效果，在提取物调至蛋白浓度为200ug/ml喷施烟草72小时后，接种烟草花叶病毒，对烟草花叶病毒的抑制率达到77.49%。本发明的黑平菇提取物属于天然提取物，对人类和环境均无害。本发明黑平菇提取物的制备方法，简单容易操作，并且利用黑平菇菌丝为原材料，通过液体培养可获得大量菌丝，成本较为低廉。图1为本发明的黑平燕提取方法的流程示意图图2为黑平菇菌丝粉粗提液级黑平菇蛋白粗提物物抗烟草花叶病毒实验照片具体实施例方式下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所示的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例l、黑平菇提取物的提取方法及其TMV抑制实验一、黑平菇的摇瓶培养条件的优化1、菌种活化将-2(TC冷冻保存的黑平菇菌丝体，接种于PDA平板培养基上，25"C培养3天得到生长活力旺盛的黑平燕菌丝。2、黑平菇的液体培养1)一级菌种制备将步骤1得到的平板活化的菌丝切成小块儿，转入装有100ml下述培养基的500ml摇瓶中，接种量为可为0.5-1.5g菌丝/L，本实施例采用lg/L,于27°C、220rpm摇培3天得到活化的菌丝，即一级菌种(浓度为30-40g/L)。上述一级菌种制备的培养基配方18g/L马铃薯淀粉、25g/L葡萄糖、30g/L玉米粉、25g/L豆桨粉、8g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、3g/L牛肉膏、3g/LKH2P04、lg/LK2HP04、1.5g/LMgS04、30mg/LVBj。2)黑平燕菌丝体的液体培养将步骤1)得到的一级菌种培养液按照体积百分比浓度为8%的接种量接种到装有100ml步骤l)所述的培养基的500ml摇瓶中，于27。C、220rpm摇瓶培养。3、不同液体培养天数黑平菇菌丝粗提液的获得接种摇瓶三天后开始取样，每隔24小时取I次，连续取六次，每次取2瓶，抽滤收集菌丝，然后按照下述方法获得黑平菇菌丝粗提液1)将上述获得的黑平菇菌丝于4(TC烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到黑平菇菌丝粉末。2)分别将2g通过步骤1)得到的黑平菇菌丝干粉与0.025mol/Lp朋.0的PBS按照lg/10ml的比例混合，于4°C，浸提2小时，10000rpm离心25min，收集上清液，用0.025mol/LpH8.0的磷酸缓冲液定容至20ml，即为黑平菇菌丝粗提液。4、不同培养天数对黑平菇菌丝粗提液总蛋白浓度的影响用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测步骤3得到的不同培养天数的黑平菇提取物粗提液的蛋白浓度，测定方法按照试剂盒的说明书进行。结果如表l所示，结果显示随着培养天数的增加，菌丝干粉粗提液总蛋白的浓度先增加后下降，在培养的八天中，第五天的总蛋白浓度较高，说明该时期蛋白表达处于一个较高水平。在后续试验中，我们选择第五天的菌丝作为提取物的材料。表1.不同培养天数的黑平菇菌丝缓冲液提取物总蛋白浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>5、液体培养天数对黑平菇菌丝粗提液的抗烟草花叶病毒效果的影响1)植株处理将步骤3得到的发酵培养天数不同的黑平燕菌丝粗提液分别用水稀释得到总蛋白浓度为200ug/ml的溶液，分别对三至四叶期的枯斑三生烟OV!.co"朋ata6a，5"a脂/棚进行整株喷雾，每个处理三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK)，设置三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。2)病毒接种液的制备病毒来源为本研究室保存的烟草花叶病毒普通株系(以普通烟为繁殖寄主，温室内活体保存)，其获取方法是将感染烟草花叶病毒普通株系的普通烟(7VcWi朋a"力ac柳jfe附"aJ劝)烟叶去除主脉，与pH8.0的0.01mol/L的PBS按lg/20ml混合，每20mlPBS加0.015g金刚砂，将叶片充分研磨，得到接种液。3)接种将按步骤1)的方法喷雾72小时后得到的枯斑三生烟植株，用步骤2)得到的接种液进行摩擦接种(植病研究方法(第三版)，方中达，中国农业出版社)接种后立即用清水冲洗，于温室中培养，培养条件为2『C光照12小时，18t:无光照12小时，交替进行。4)抑制率计算接种72小时后观察枯斑三生烟叶片产生枯斑数量，按下式计算出枯斑抑制率。X=(CK-Y)/CKX100(式I)式I中，X为枯斑抑制率，单位％;CK为清水对照叶片的平均枯斑个数，单位个；Y为经黑平菇菌丝粗提液诱导处理后叶片的平均枯斑个数，单位个。结果如表2所示，结果显示，液体培养3-7天后的菌丝进行提取得到的黑平菇菌丝提取物粗提液对烟草花叶病毒的平均抑制率均在40%以上，其中发酵培养5天后的菌丝进行提取得到的黑平燕菌丝提取物粗提液对烟草花叶病毒的平均抑制率达到68.38%，效果最好(抑制率实验照片如图2中A所示)，方差显著性分析也同样显示了如上结果。表2.不同培养天数的黑平菇菌丝提取物粗提液对烟草花叶病毒的抑制率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、黑平菇菌丝粗提液中抗烟草花叶病毒蛋白组分的筛选利用不同饱和度的硫酸铵对步骤一的步骤3获得的培养5天的黑平燕菌丝粗提液中的蛋白组分进行分离，并分别对不同饱和度硫酸铵沉淀的蛋白组分进行抗烟草花叶病毒活性测定。硫酸铵分级沉淀条件如下1、选取硫酸铵饱和度范围0~30%、30%60%、60%~85%，进行硫酸铵分级沉淀具体方法为1)在步骤一的步骤3获得的发酵5天的黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为30%，于4。C放置8小时后，10000rpm离心收集沉淀即为030。/。饱和硫酸铵沉淀组分；2)将步骤l)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60%，于4X:放置8小时后，10000rpm离心收集沉淀即为30%~60%饱和硫酸铵沉淀组分；3)将步骤2)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为85%，于4'C放置8小时后，10000rpm离心收集沉淀即为60%~85%饱和硫酸铵沉淀组分。上述步骤l)、2)和3)得到0~30%、30%~60°/。和60%~85%沉淀组分于7000d透析袋中4'C透析过夜，期间换水34次。经充分透析后(请提供透析的具体步骤或者将该透析步骤删除)用水稀释得到总蛋白浓度在200"g/ml的溶液，分别对三至四叶期的枯斑三生烟进行整株喷雾，每个处理三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK)，设置三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。病毒的制备、接种、抑制率计算同步骤一的步骤5。结果如表3所示，结果表明硫酸铵饱和度在30%~60%和60%~85%时沉淀的蛋白对烟草花叶病毒的抑制率较高，可达66.3%和62.11%，故选取30%85%硫酸铵饱和度进行进一步分级。表3.30~30%、30%60%、60%~85%饱和硫酸铵沉淀组分对烟草花叶病毒的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、选取硫酸铵饱和度范围30%~40%、40°/。~50%、50%~60%、60%70%、70%85%;进行硫酸铵分级沉淀，具体方法为1)在步骤一的步骤3获得的培养5天的黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为30%，于4t:放置8小时后，10000rpm离心收集上清液；上清液继续加入硫酸铵至饱和度为40%，于4。C放置8小时后，10000rpm离心收集上清液和沉淀，沉淀即为30%~40%饱和硫酸铵沉淀组分；2)将步骤l)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为50%，于4i:放置8小时后，10000rpm离心收集沉淀即为40%~50%饱和硫酸铵沉淀组分；3)将步骤2)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60%，于4i:放置8小时后，10000rpm离心收集沉淀即为50%60%饱和硫酸铵沉淀组分。4)将步骤3)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60%，于4"C放置8小时后，10000rpm离心收集沉淀即为60%~70%饱和硫酸铵沉淀组分。5)将步骤4)离心得到的上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60%，于4'C放置8小时后，10000rpm离心收集沉淀即为70%~85%饱和硫酸铵沉淀组分。将上述步骤l)一5)得到的各级饱和硫酸铵沉淀组分于7000d透析袋中4X:透析过夜，期间换水34次。经充分透析后(请提供透析的具体步骤或者将该透析步骤删除)用水稀释得到总蛋白浓度在200"g/ml的溶液，分别对三至四叶期的枯斑三生烟进行整株喷雾，每个处理做三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK)，设置三个重复，每个重复三株，每株三片叶子。病毒的制备、接种、抑制率计算同步骤一的步骤5。结果如表4所示，结果表明硫酸铵饱和度在40%~50%、50%~60%、60%~70%沉淀的蛋白对烟草花叶病毒的抑制率分别达到60.92%、63.81%和59.13%，故选取硫酸铵饱和度在40%~70%的沉淀蛋白进行后续分离。表4.30%~85%饱和硫酸铵按10%分级所得蛋白对烟草花叶病毒的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根据上述结果，按照下述方法对步骤一的步骤3获得的培养5天的黑平燕提取物粗提液进一步提取1)在步骤一的步骤3获得的培养5天的黑平菇菌丝粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%，于4。C放置8小时后，10000rpm离心收集上清液。2)在步骤l)得到的上清液中，继续加入硫酸铵至饱和度70%，在4"C放置8小时后，10000rpm离心，收集沉淀，即得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。按照步骤一的步骤5的方法检测该黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物的抗烟草花叶病毒效果，结果如图2中B所示，结果表明，上述黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物以20(mg/ml浓度喷施时，对烟草花叶病毒抑制率为62.30%(抑制率实验照片如图2中B所示)。实施例2、黑平薛蛋白提取物的提取方法及TMV抑制实验按照实施例1的步骤一中的步骤1和步骤2的方法发酵培养黑平菇菌丝，发酵培养5天的菌丝为原料，按照下述方法获得黑平菇提取物(提取方法流程图如图l所示)-1)将上述获得的黑平菇菌丝于4(TC烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到黑平菇菌丝粉末。2)分别将步骤1)得到的黑平菇菌丝粉末与0.025mol/LpH7.0的磷酸缓冲液按照lg/10ml的比例混合；在2。C，浸提2小时后，10000rpm离心25min，收集上清液，即为黑平菇菌丝粗提液。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该黑平菇菌丝粗提液的蛋白浓度。3)在步骤2)得到的黑平菇提取物粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%，在2"C放置8小时后，10000rpm离心收集上清液。4)在步骤3)得到的上清液中，继续加入硫酸铵至饱和度70%，在2t:放置8小时后，10000rpm离心，收集沉淀，即得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。按照实施例1的步骤一的步骤5的方法，分别对步骤2)和步骤4)获得的黑平菇提取物进行烟草花叶病毒抑制率检测实验，结果如表5所示。表5.本发明的黑平菇提取物的烟草花叶病毒抑制率检测实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例3、黑平菇提取物的获得及TMV抑制实验按照实施例1的步骤一中的步骤1和步骤2的方法发酵培养黑平范菌丝，发酵培养5天的菌丝为原料，按照下述方法获得黑平菇提取物1)将上述获得的黑平菇菌丝于4(TC烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到黑平菇菌丝粉末。2)分别将步骤l)得到的黑平菇菌丝粉末与0.025mol/LpH7.0的磷酸缓冲液按照lg/20ml的比例混合；在6°C,浸提2小时后，10000rpm离心25min，收集上清液，即为黑平菇菌丝粗提液。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该黑平菇菌丝粗提液的蛋白浓度，测定方法按照试剂盒的说明书进行。3)在步骤2)得到的黑平菇提取物粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%,在6'C放置8小时后，10000rpm离心收集上清液。4)在步骤3)得到的上清液中，继续加入硫酸铵至饱和度70%,在6。C放置8小时后，10000rpm离心，收集沉淀，即得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。按照实施例1的步骤一的步骤5的方法，分别对步骤2)和步骤4)获得的黑平菇提取物进行烟草花叶病毒抑制率检测实验，结果如表6所示。表6.本发明的黑平燕提取物的烟草花叶病毒抑制率检测实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例4、黑平菇提取物的获得及TMV抑制实验按照实施例1的步骤一中的步骤1和步骤2的方法液体培养黑平恭菌丝，培养5天的菌丝为原料，按照下述方法获得黑平菇提取物1)将上述获得的黑平菇菌丝于4(TC烘箱中烘干，粉碎，过60目筛得到黑平菇菌丝粉末。2)分别将步骤1)得到的黑平菇菌丝粉末与0.025mol/LpH9.0的磷酸缓冲液按照lg/10ml的比例混合；在2°C，浸提2小时后，10000rpm离心25min，收集上清液，即为黑平菇菌丝粗提液。用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测该黑平燕菌丝粗提液的蛋白浓度，测定方法按照试剂盒的说明书进行。3)在步骤2)得到的黑平菇提取物粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%，在2。C放置8小时后，10000rpm离心收集上清液。4)在步骤3)得到的上清液中，继续加入硫酸铵至饱和度70%，在2。C放置8小时后，10000rpm离心，收集沉淀，即得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。按照实施例1的步骤一的步骤5的方法，分别对步骤2)和步骤4)获得的黑平菇提取物进行烟草花叶病毒抑制率检测实验，结果如表7所示。表7.本发明的黑平燕提取物的烟草花叶病毒抑制率检测实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种黑平菇提取物的制备方法，是将黑平菇菌丝粉与pH值为7—9的磷酸缓冲液混合，在2—6℃浸提，离心取上清液得到黑平菇提取物溶液。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述黑平菇菌丝粉与所述磷酸缓冲液的混合比例为lg黑平菇菌丝粉干重10—20ml磷酸缓冲液。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述磷酸缓冲液的pH值为8.0;所述浸提的时间为l一3小时。4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述黑平燕菌丝粉为黑平燕菌丝接种于发酵培养基在21—36。C发酵培养3—10天得到的菌丝，干燥粉碎得到的；所述发酵培养基为含18g/L马铃薯淀粉、25g/L葡萄糖、25g/L豆浆粉、8g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、3g/L牛肉膏、3g/LKH2P04、lg/LK2HP04、1.5g/LMgS04、30mg/LVBj的培养基。5、根据权利要求4项所述的方法，其特征在于所述液体培养的时间为3-7天，优选为5天。6、根据权利要求5项所述的方法，其特征在于所述黑平燕菌丝粉的粒径为60目。7、根据权利要求1一6中任意一项所述的方法，其特征在于所述黑平燕提取物溶液还经过下述步骤的提取1)将所述黑平菇提取物溶液中加入硫酸铵至饱和度为40%，在26t放置6~12小时后，离心，收集上清液；2)将步骤l)得到的上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，在26。C放置612小时后，离心，收集沉淀得到黑平菇抗烟草花叶病毒蛋白提取物。8、权利要求1-7中任意一项所述的方法获得的黑平菇蛋白提取物。9、权利要求8所述的黑平菇蛋白提取物在防治烟草花叶病毒中的应用。全文摘要本发明公开了一种黑平菇提取物及其制备方法与应用。该方法(1)是将黑平菇菌丝粉与pH值为6-9的磷酸缓冲液混合，在2-6℃浸提，离心取上清液得到黑平菇提取物溶液；(2)上清液加入硫酸铵至饱和度为40％，在2-6℃放置8-16小时后离心；(3)上清液加入硫酸铵至饱和度为70％，在0-4℃放置8-16小时后离心。(4)用蒸馏水溶解沉淀得到黑平菇抗TMV的蛋白。本发明的黑平菇提纯物属于天然提取物，对人类和环境均无害。本发明黑平菇提纯物的制备方法，简单容易操作，并且利用黑平菇菌丝为原材料，通过液体培养可获得大量菌丝，使成本大大降低。文档编号A01P3/00GK101375689SQ200810223438公开日2009年3月4日申请日期2008年9月27日优先权日2008年9月27日发明者红严,刘建华,娜卢,莹周,琳朱,李兴红,林秀敏,黄金宝申请人:北京市农林科学院