专利名称：试管荸荠组织培养快速繁殖的方法
技术领域：
本发明属于农业育种领域，具体地指一种试管荸荠组织培养快速繁殖的方法。
背景技术：
荸荠别名马蹄、地栗、乌芋等，为沙草科荸荠属多年生水生草本植物，原产中国南方和印度，在我国栽培历史悠久，以其地下球茎供食用，含有丰富的蛋白质、碳水化合物和矿质元素，既可作蔬菜，也可作水果，生食、熟食均可，还可加工罐藏和提取淀粉。长期以来，荸荠栽培采用无性繁殖，导致各种病菌侵染，种荠的种性退化，种球带病现象严重，致使产量低而不稳定，其主要病害有杆枯病、枯萎病、茎腐病、灰霉病等，目前生产上为害最重的是杆枯病和枯萎病，两种病害都可以通过球茎传播。杆枯病流行时，通常病杆率达30% 40%，最重达100%，造成叶状茎枯死，地下部不结荠，一般减产40% 70%，甚至绝收。
发明内容
本发明的目的是针对无性繁殖的荸荠的种球带病和种性退化问题，提供一种试管荸荠组织培养快速繁殖的方法，提高荸荠的品质。本发明试管荸荠组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤:I)茎尖启动:选取无病荸荠的顶芽或侧芽为外植体，经清洗消毒后，接种于茎尖启动培养基上，所述茎尖启动培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.5 2.6mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1 0.5mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5 0.6%的琼脂，pH值为5.8 6.0，培养温度为24 26°C，光照强度为2000 2500 Ix,每天光照10h，直至生长成单芽或丛芽；`2)继代增殖:将单芽或丛芽转接到继代增殖培养基上继代增殖培养，所述继代增殖培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.5 2.0mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1 1.0mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5 0.6%的琼脂，pH值为5.8 6.0,培养温度为24 26°C，光照强度2000 2500 lx，每天光照10h，至产生新的丛芽；3)生根培养:将丛芽分割成单芽，转接到生根培养基上诱导生根，所述生根培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.5 1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA) 0.1 0.5mg/L、活性炭(AC) 0.5 1.0g/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5 0.6%的琼脂，pH值为5.8 6.0，培养温度为24 26°C，光照强度为2000 2500 Ix,每天光照10h，生根形成试管苗；4)诱导试管荸荠球茎:将试管苗转接到诱导荸荠球茎培养基上培养，所述诱导荸荠球茎培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1 1.0mg/L、萘乙酸(NAA)0.1
0.5mg/L、活性炭(AC)0.5 1.0g/L、质量分数为3.0 12.0%的蔗糖和质量分数为0.5
0.6%琼脂，pH值为5.8 6.0，培养温度为24 26°C、光照强度2000 2500 lx，每天光照8h，诱导形成试管荸荠。
本发明中所用的基本培养基是LS培养基，因为经过试验研究，荸荠试管苗在LS培养基中相对于MS培养基的生长更旺盛。本发明在茎尖启动培养基和继代增殖培养基中均添加了生长素类物质NAA，更利于荸荠茎尖的启动和继代生长。本发明在生根培养和诱导试管荸荠球茎两个阶段的培养基中均添加了 AC，AC可以促进生根、减轻组织培养过程中的褐化现象。本发明中在各培养阶段光照强度选择均为2000 2500LX，茎尖启动、继代增殖和生根阶段，每天光照时间为10h，诱导试管荸荠阶段，每天光照时间为8h。植物在不同的生育阶段对光的需求不同，本发明在各培养阶段对光照强度和光照时间的选择，更符合植物生长发育过程中对光的需求。本发明通过组织培养进行试管荸荠的繁殖，具有以下优点: 1、试管荸荠不带病，质量高。通过荸荠茎尖培养，进行快速繁殖，获得再生植株，并在诱导形成试管荸荠，首先能够获得无病菌种荠，解决荸荠的种球带病和种性退化问题，提高大果率和整齐度，改善品质，从而提高商品性，提高产量。通过组培快繁得到的试管荸荠不带病，同时荸荠种苗的遗传背景一致，从而保证了荸荠种的纯度。2、试管荸荠生长快，周期短，繁殖系数高。常规种荸荠一年繁殖一代；而试管荸荠一年可繁殖8 10代，极大的提高了荸荠的繁殖速度，有利于优新荸荠品种的推广应用，有利于新品种的提供和远途调种。3、试管荸荠培养条件可控，可周年工厂化生产，创造较好的社会效益和经济效益。4、可以进行资源离体室内保存，进行其他的生理、生化方面的研究工作，为这些研究提供一个可操作的简单系统。因而，在理论上和生产实践上有极其重要的意义和广泛的应用前景。总之，通过诱导技术组织培养快速繁殖试管荸荠为荸荠产业的发展提供了一种快速、方便、有效的荸荠种苗繁殖技术，大大满足了荸荠的市场需求。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例1以荸荠品种沙洋荸荠的顶芽为外植体，经过茎尖启动、继代增殖、生根、诱导形成试管荸荠。包括如下步骤:I)茎尖启动:以沙洋荸荠为试验材料，取清洗干净的无病沙洋荸荠顶芽，经75%酒精浸泡30秒后，用0.l%HgCl2溶液浸泡0.5分钟，再用无菌水冲洗3次，每次3分钟，接种于茎尖启动培养基上，所用茎尖启动培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.2mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.6%的琼脂，pH值为5.8，在温度为26°C，光照强度2500 Ix下，每天光照10h，30d后产生丛芽；2)继代增殖:将丛芽转接到继代增殖培养基上继代增殖培养，所用继代增殖培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L、萘乙酸(NAA) 0.2mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.6%的琼脂，pH值为5.8，培养温度为26°C，光照强度2000 Ix,每天光照10h，35d产生新的丛芽；
3)生根:将丛芽分割成单芽，转接到生根培养基上诱导生根，所用生根培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L、活性炭(AC)0.5g/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.6%的琼脂，pH值为5.8，培养温度为26°C，光照强度为2500 lx，每天光照10h，20d左右生根形成试管苗；4)诱导试管荸荠:将试管苗转接到诱导荸荠球茎培养基上培养，所用诱导荸荠球茎培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.6mg/L、萘乙酸(NAA) 0.3mg/L、活性炭(AC) 0.5g/L、质量分数为5.0%的蔗糖和质量分数为0.6%琼脂，pH值为5.8，培养温度为25°C、光照强度2500 Ix,每天光照8h，30d以后诱导形成试管荸荠。实施例2以荸荠品种沙洋荸荠的侧芽为外植体，经过茎尖启动、继代增殖、生根、诱导形成试管荸荠。包括如下步骤:I)茎尖启动:以沙洋荸荠为试验材料，取清洗干净的无病沙洋荸荠侧芽，经75%酒精浸泡30秒后，用0.1ffigCl2溶液浸泡I分钟，再用无菌水冲洗5次，每次5分钟，接种于茎尖启动培养基上，所述茎尖启动培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L、萘乙酸(NAA)0.3mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.6%的琼脂，pH值为5.8，在温度为24°C，光照强度2200 Ix下，每天光照10h，30d后产生单芽；2)继代增殖:将单芽转接到继代增殖培养基上继代增殖培养，所述继代增殖培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.81^/1、萘乙酸^4八)0.lmg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.6%的琼脂，pH值为5.8，培养温度为24°C，光照强度2300 Ix,每天光照10h，35d产生新的丛芽；3)生根:将丛芽分割成单芽，转接到生根培养基上诱导生根，所述生根培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BAH.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)1.0mg/L、活性炭(AC)0.7g/L、质量分数为3.0%的蔗糖和 质量分数为0.6%的琼脂，pH值为5.8，培养温度为26°C，光照强度为2000 lx，每天光照10h，20d左右生根形成试管苗；4)诱导试管荸荠:将试管苗转接到诱导荸荠球茎培养基上培养，所述诱导荸荠球茎培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.3mg/L、萘乙酸(NAA) 0.lmg/L、活性炭(AC) 0.5g/L、质量分数为8%的蔗糖和质量分数为0.5%琼脂，pH值5.8，培养温度为26°C、光照强度25001x，每天光照8h，30d以后诱导形成试管荸荠。实施例3以荸荠品种沙洋荸荠的顶芽为外植体，经过茎尖启动、继代增殖、生根、诱导形成试管荸荠。包括如下步骤:I)茎尖启动:以沙洋荸荠为试验材料，取清洗干净的无病沙洋荸荠顶芽，经75%酒精浸泡30秒后，用0.l%HgCl2溶液浸泡0.8分钟，再用无菌水冲洗3次，每次3分钟，接种于茎尖启动培养基上，所述茎尖启动培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 2.2mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.6%的琼脂，pH值为5.8，在温度为24°C，光照强度2500 Ix下，每天光照10h，30d后产生丛芽；2)继代增殖:将丛芽转接到继代增殖培养基上继代增殖培养，所述继代增殖培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L、萘乙酸(NAA) 0.3 mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5%的琼脂，pH值为6.0，培养温度为24°C，光照强度2500 Ix,每天光照10h，25d产生新的丛芽；3)生根:将丛芽分割成单芽，转接到生根培养基上诱导生根，所述生根培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BAH.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)1.0mg/L、活性炭(AC)L Og/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5%的琼脂，pH值为6.0，培养温度为26°C，光照强度为2000 lx，每天光照10h，20d左右生根形成试管苗；4)诱导试管荸荠:将试管苗转接到诱导荸荠球茎培养基上培养，所述诱导荸荠球茎培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L、萘乙酸(NAA) 0.5mg/L、活性炭(AC)1.0g/L、质量分数为10.0%的蔗糖和质量分数为0.5%琼脂，pH值为6.0，培养温度为24°C、光照强度2000 lx，每天光照8h，30d以后诱导形成试管荸荠。实施例4以荸荠品种沙洋荸荠的侧芽为外植体，经过茎尖启动、继代增殖、生根、诱导形成试管荸荠。包括如下步骤:1)茎尖启动:以沙洋荸荠为试验材料，取清洗干净的无病沙洋荸荠侧芽，经75%酒精浸泡30秒后，用0.1ffigCl2溶液浸泡I分钟，再用无菌水冲洗4次，每次4分钟，接种于茎尖启动培养基上，所述茎尖启动培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.3mg/L、萘乙酸(NAA)0.2mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5%的琼脂，pH值为5.8，在温度为26°C，光照强度2400 Ix下，每天光照10h，30d后产生单芽；2)继代增殖:将单芽转接到继代增殖培养基上继代增殖培养，所述继代增殖培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L、萘乙酸(NAA) 0.2mg/L、质量分数为
3.0%的蔗糖和质量分数为0.5%的琼脂，pH值为5.8，培养温度为25°C，光照强度2000 Ix,每天光照10h，30d产生新的丛芽。3)生根:将丛芽分割成单芽，转接到生根培养基上诱导生根，所用生根培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.8mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L、活性炭(AC)0.7g/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5%的琼脂，pH值为6.0，培养温度为26°C，光照强度为25001x，每天光照10h，20d左右生根形成试管苗；4)诱导试管荸荠:将试管苗转接到诱导荸荠球茎培养基上培养，所用诱导荸荠球茎培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.3mg/L、萘乙酸(NAA) 0.lmg/L、活性炭(AC) 0.7g/L、质量分数为4%的蔗糖和质量分数为0.5%琼脂，pH值为5.8，培养温度为25°C、光照强度25001x，每天光照8h，30d以后诱导形成试管荸荠。
权利要求
1.一种试管荸荠组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)茎尖启动:选取无病荸荠的顶芽或侧芽为外植体，经清洗消毒后，接种于茎尖启动培养基上，所述茎尖启动培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤0.5 2.6mg/L、萘乙酸·0.1 0.5mg/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5 0.6%的琼脂，pH值为5.8 ·6.0，培养温度为24 26°C，光照强度为2000 2500 Ix,每天光照10h，直至生长成单芽或丛芽； 2)继代增殖:将单芽或丛芽转接到继代增殖培养基上继代增殖培养，所述继代增殖培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤0.5 2.0mg/L、萘乙酸0.1 0.5mg/L、质量分数为·3.0%的蔗糖和质量分数为0.5 0.6%的琼脂，pH值为5.8 6.0，培养温度为24 26°C，光照强度2000 25001x，每天光照10h，至产生新的丛芽； 3)生根培养:将丛芽分割成单芽，转接到生根培养基上诱导生根，所述生根培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤0.5 1.0mg/L、吲哚丁酸0.1 1.0mg/L、活性炭0.5 ·1.0g/L、质量分数为3.0%的蔗糖和质量分数为0.5 0.6%的琼脂，pH值为5.8 6.0，培养温度为24 26°C，光照强度为2000 25001x，每天光照10h，生根形成试管苗； 4)诱导试管荸荠球茎:将试管苗转接到诱导荸荠球茎培养基上培养，所述诱导荸荠球茎培养基为LS培养基、添加6-苄氨基嘌呤0.1 1.0mg/L、萘乙酸0.1 0.5mg/L、活性炭·0.5 1.0g/L、质量分数为3.0 12.0%的蔗糖和质量分数为0.5 0.6%琼脂，pH值为·5.8 6.0,培养温度为 24 26°C、光照强度2000 25001x,每天光照8h,诱导形成试管荸荠。
全文摘要
本发明公开了一种试管荸荠组织培养快速繁殖的方法，以无病荸荠的顶芽或侧芽为外植体，经过茎尖启动、继代增殖、生根、诱导形成试管荸荠。本发明通过组织培养进行试管荸荠的繁殖，试管荸荠不带病，质量高；试管荸荠生长快，周期短，繁殖系数高；试管荸荠培养条件可控，可周年工厂化生产，创造较好的社会效益和经济效益。本发明通过诱导技术组织培养快速繁殖试管荸荠为荸荠产业的发展提供了一种快速、方便、有效的荸荠种苗繁殖技术，大大满足了荸荠的市场需求。
文档编号A01H4/00GK103070072SQ20131002422
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者彭静, 柯卫东, 刘玉平, 朱红莲, 李峰, 黄新芳, 刘义满, 叶元英, 李双梅, 黄来春 申请人:武汉市蔬菜科学研究所