专利名称：一种白及多倍体植株的培育方法
技术领域：
本发明涉及一种白及多倍体植株的培育方法。
背景技术：
白及为兰科植物白及(Bletilla sfriata(Thunb.)Reiehb.f.)的干燥块茎，具有收敛止血，消肿生肌等功效，用于治疗咯血，吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂等症。白及不仅药用价值高，而且极具观赏价值，是我国现代医药工业和化妆品工业的重要原材料。近年来，随着我国中医药事业的发展，白及在临床上的应用范围不断扩大，白及的用药需求急剧增加。但白及种子非常细小且无胚乳，因此在自然条件下很难萌发和生长，实生苗的栽培较为困难，仅靠分株繁殖，而白及分株繁殖周期长，繁殖效率低，而且耗种量大，很难满足大量栽培的需要。白及正面临着资源难以满足市场的严峻现实。白及种质的好坏是影响白及产量重要的因素。因此，加强白及优良品种的选育至关重要。多倍体植物在自然界中是普遍存在的，由于它们在生理上较普通植物有更强的适应性和遗传上有较大的可塑性，使得育种学家自20世纪30年代开始就热衷于多倍体诱导育种的研究。目前多倍体诱导育种工作在农作物、果树、蔬菜、花卉等领域广泛开展，取得了很好的成绩，如目前多倍体马铃薯、西瓜等都已经投入到生产应用中，已经带来了巨大的经济效益和社会效益。药用植物多倍体育种工作开展得也比较早，自从1937年布莱克斯里用秋水仙素处理曼佗罗获得多倍体，半个多世纪以来，育种学家对多种药用植物进行了多倍体育种的研究，培育了许多高产优质新品种，现今，已在卷叶贝母、青蒿、金银花、罗勒、丹参、紫锥菊、黄芪等药用植物上诱导成功。药用植物多倍体具有以下的优点:1.生物广量提闻药用植物大多以收获根、茎、叶等营养器官为主，具有巨大性的特点，药用植物可以利用其优势来提高药材产量。川黄柏同源四倍体较原植物叶子宽大而厚实，茎杆粗壮；四倍体决明种子比二倍体决明种子增重70% ；S.Amiri等研就表明多倍体曼陀罗叶片宽大，植株干重、叶绿素含量较原植物闻。2.抗逆性提高多数的多倍体对外界环境条件具有较强的适应性，多倍体植株茎杆粗壮故能较好的抗倒伏有的还有抗旱、抗病、抗寒等特性。例如张笑艺对不同倍性的盾叶薯蓣进行高温抗性研究，测定叶片内与高温胁迫相关的各项生理指标，表明四倍体盾叶薯蓣对高温胁迫具有更好的耐受性。3.药用活性成分含量高药用植物的多倍体育种一方面要提高产量，另一方面应使药用植物内的化学药效成分含量明显增加，并且可增添新的药效成分。例如，有研究表现盾叶薯蓣的同源四倍体中有效成分薯蓣皂苷的含量比原植物高1.2倍左右；随着生物技术的发展，药用植物的多倍体育种工作也取得了较大的进展，获得了一些多倍体新品种，以其速 生、优质、高抗逆性等特性在生产上取得了较好效果。药用植物多倍体育种拓宽了种质资源，防止了由于长期的栽培而导致的药用植物品种退化。可以预见，生物技术在中药材品种改良方面具有很好的应用前景，将随着人类对其应用价值认识的提高，以及有关新技术方法的应用，从而带动未来药用植物的可持续、高效发展。
发明内容
本发明目的提供一种白及多倍体植株的制备方法，利用该方法可以获得具有四倍体特征的白及植株，且操作简单，适合规模化生产。本发明采用的技术方案是:一种白及多倍体植株的培育方法，所述方法包括:(I)将消毒后的白及种子抖入秋水仙素溶液中，黑暗条件下培养6 8d后，离心、洗漆去除秋水仙素；所述秋水仙素溶液中秋水仙素浓度为0.1 0.4%(w/w),pH5.8 6.2,溶剂为1/2MS或MS培养液，其中还可添加0.lmg/L-1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤；白及种子可直接对蒴果进行消毒，也可将蒴果中的种子取出后进行消毒；(2)将秋水仙素处理过的白及种子转接到白及种子萌发培养基中，先于培养箱中黑暗条件下培养5 6d，再移至培养室， 培养温度23 27°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培养三个月得到多倍体白及幼苗；所述白及种子萌发培养基组成如下:1-萘乙酸0.2 0.5mg/L, pH5.8 6.2，溶剂为 1/2MS 或 MS 培养液；(3)将上述培养得到的白及幼苗，挑选出茎变粗、叶片加厚、叶色加深的植株，转接到白及增殖培养基中进行稳定扩繁，选取2 3代性状稳定的植株进行多倍体的鉴定；所述白及增殖培养基组成如下:6_节氨基嘌呤1.0 2.0mg/L, 1-萘乙酸0.1 0.5mg/L,pH5.8 6.2，溶剂为1/2MS或MS培养液；(4)鉴定为多倍体的植株转接到生根壮苗培养基中进行培养，即获得白及多倍体植株的幼苗；所述生根壮苗培养基组成如下:1-萘乙酸0.5 0.6mg/L，香蕉汁(香蕉去皮切片加水煮，按照重量最后定容后过滤即为香蕉汁，约300g香蕉定容至1L)5 10%(v/v)，PH5.8 6.2，溶剂为1/2MS或MS培养液。幼苗在生根壮苗培养基中待根长到2cm以上时，打开瓶盖，至于室温下培养2 4天后，取出小苗，洗去根部培养基，栽入营养土中，浇透水，并用塑料薄膜覆盖一周后去除地膜，定期进行浇水施肥等管理，直至长成白及四倍体植株，块茎巨大，故称为巨茎白及(参见图5)。步骤(I)所述消毒方法可如下:取白及蒴果，用洗衣粉浸泡8 lOmin，自来水冲洗5 5min,然后用75%乙醇消毒2 3min,无菌水冲洗,0.1%升萊消毒15 20min,无菌水冲洗，无菌吸水纸将蒴果表面残留的水吸干，消毒后的白及蒴果切开即获得消毒后的白及种子。步骤(I)所述消毒方法如下:白及蒴果切开，取白及种子，加入75%乙醇，IOs后立即加入无菌水，离心或过滤，取白及种子加入0.1%升汞溶液，5min后加入无菌水，离心或过滤，取白及种子用无菌吸水纸上吸干，即得消毒后的白及种子。具体可如下:直接取白及种子，每100 200mg的种子中加入0.5 Iml的75%乙醇，IOs后立即加入30 50ml的无菌水，1000 1500rpm离心2 5min使种子沉淀,去除液体,或者用无菌滤膜过滤出白及种子，之后加入0.5 Iml的0.1%升萊溶液,5min后加入,30 50ml的无菌水，1000 1500rpm离心2 5min使种子沉淀，去除液体，或者用无菌滤膜过滤出白及种子，无菌吸水纸上将残留的水吸净，可得无菌白及种子。多倍体的鉴定方法如下:于上午8 9时取组培苗植株的根尖，立即将材料放进
0.002mol/L8-0H喹啉溶液，在4°C下预处理4 6h，蒸馏水清洗3遍，在4°C下，卡诺氏液(冰醋酸:无水乙醇体积比=1:3，混匀，现用现配)在4°C下固定24h，蒸馏水漂洗3次，每次lOmin，用l.0mol/L的盐酸常温解离15 20min，至除根尖外根段透明呈黄色时为宜，将根尖置于蒸馏水中低渗处理约30min或更长时间，用改良苯酚品红溶液和醋酸洋红溶液进行染色，30min后压片，压至根尖分开成云雾状，镜检观察2n=4X=64 (图1)，作为普通白及2n=2X=32，故可确定获得的植株为四倍体植株。多倍体的鉴定染色体中流式分析的具体内容如下:(a)细胞核提取液的配制组成为15mM Tris ；80mM KCl ；20mM NaCl ；20mMEDTA-Na2巯基乙醇；4mMMgCl2.6H20 ；0.l%TritonX-100 ；PH7.5。(b)制备RNA酶及染色液将RNA 酶 A 溶于 lOmmol/L Tris-HCl (pH7.5)、15mmol/L NaCl 中，配成 lOmg/mL的溶液，于100°c水浴中加热15min，缓慢冷却至室温后分装成小份，保存于-20°c中。碘化丙锭(propidium iodide, PI)及RNase (DNase-free)加入到细胞核提取液中，使其终浓度为lOOiig/ml，现配现用。(C)处理材料及结果分析取白及多倍体叶片以及普通白及叶片各Ig左右，加入1.8ml冰浴预冷的细胞核提取液，在培养皿里用锐利的眼 科剪快速将其剪碎，以二倍体白及叶片作对照。然后经350目尼龙网过滤至1.5ml离心管中，4°C条件下，IOOOrpm离心5min,吸取上清液200 300 U I,加入等体积上述染色液，悬起，暗处染色5-15min,进行流式细胞仪检测及软件分析,发现对照组即普通白及含2C DNA，多倍体白及含4C DNA (图2)，进一步表明本发明所得到的白及多倍体植株为四倍体植株。按照本发明方法得到的白及四倍体幼苗，其特征如下:与二倍体白及相比，叶片明显变厚，颜色变深，整个植株形态上明显比二倍体白及粗大(图3)，4X 100倍镜下单个视野气孔数目为5±0.907 (二倍体14±4.90)，保卫细胞长和宽分别为2.111±0.231、1.867±0.239 (二倍体白及保卫细胞长和宽分别为1.414±0.408、1.083±0.427)(图4)。在本发明中，MS培养液配方举例如下:大量元素母液:NH4N0316.5g ；MgS04 7H203.7g ；KH2PO41.7g ；KN0319g,加水溶解，定容至500ml ；钙盐母液:CaCl23.32g，加水溶解，定容至500ml ；微量元素母液:K10.0415g ;Na2Mo04 2H200.0125g ;H3B030.31g ;CuSO4 5H200.00125g ；MnS04 H2O0.845g ；CoCl2 6H200.00125g ；ZnSO4 7H200.43g，加水溶解，定容至500ml ；铁盐母液:EDTA二钠 3.725g，加 100ml 水加热溶解，FeSO4 7H202.785g，加 100ml水溶解后两者混匀，加水配成500ml ；维生素母液:盐酸吡哆醇(VB6) 0.025g ;盐酸硫胺素(VBl) 0.025g ;烟酸0.025g,甘氨酸0.lg，加水溶解，定容至500ml ；
配ILMS培养液:取大量元素母液50ml，钙盐母液50ml，微量元素母液10ml，维生素母液IOml,铁盐母液5ml,加肌醇0.1g,鹿糖或白砂糖20 30g,蒸懼水定容至1L。1/2MS指溶液中所含的大量元素和钙盐为MS的一半，其他不变。本发明所获得的多倍体白及植株具有能显著提高单个块茎的重量，植株形态特征为:株高40 70cm，花葶长35 50cm，叶5片，叶距3 7cm，顶叶长40 _55cm，宽7 IOcm,最宽叶宽8 12cm, 45 55cm。花序着花数13 17枚,蒴果长3 5cm,直径0.7
1.5cm。蒴果平均重1200 1800mg,最大蒴果重2300mg,单个块莖重50 120g,直径5 15cm0本发明的有益效果主要体现在:本发明利用白及种子为材料获得的白及多倍体植株，具有显著的多倍体特征，且制备方法简单，对白及新品种的培育工作具有重要的指导意义，本发明获得的白及多倍体具有较高的应用价值。
图1为实施例1步骤4)染色体计数结果，a为二倍体白及，b为四倍体白及(即本发明制备的多倍体植株)，4X 100倍镜下观察并拍照；图2为实施例1步骤4)流式分析结果，a为二倍体白及，b为本发明所制备的四倍体植株；图3为实施例1步骤5)生 根壮苗后得到的植株，a为本发明所制备的植株，b为二倍体白及植株；图4为实施例1步骤5)得到的白及多倍体幼苗的气孔大小结果，左边为二倍体白及，右边为本发明得到的多倍体白及植株，4X40倍镜下单个视野中的气孔数目和大小。图5为实施例1步骤6 )中的白及块茎。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:I)取白及蒴果一个,用洗衣粉浸泡IOmin,用自来水冲洗5min。然后用75%乙醇消毒2min，无菌水冲洗，0.1%升汞消毒15min，无菌水将残留的升汞冲洗干净，无菌吸水纸将蒴果表面残留的水吸干；2)将白及蒴果切开，取蒴果中的种子接入0.1%秋水仙素溶液中(以1/2MS为溶剂)，黑暗条件下培养7d。处理完毕后，IOOOrpm离心Imin使种子沉淀，取种子，用无菌蒸馏水洗涤三次，得到初步萌发的白及种子；3)将上述秋水仙素处理过的白及种子转接到MS+0.2mg/Ll-萘乙酸的培养基中，放在培养箱进行暗培养5d，再移至培养室，培养温度(25±2)°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培养三个月得到多倍体白及幼苗；4)将上述培养得到的白及幼苗，挑选出茎变粗、叶片加厚、叶色加深等外观形态特征的植株，转接到MS+1.0mg/L6-节氨基嘌呤+0.lmg/Ll-萘乙酸的培养基中进行稳定扩繁，相同培养基中续代培养2 4代，2 3代后若性状仍稳定，则进行多倍体的鉴定；
具体步骤为:于上午8 9时取多倍体以及普通白及组培苗植株的根尖，立即将材料放进0.002mol/L8-0H喹啉溶液，在4°C下预处理4 6h，蒸馏水清洗3遍，在4°C下，卡诺氏液(冰醋酸:无水乙醇=1:3，混匀，现用现配)在4°C下固定24h，蒸馏水漂洗3次，每次lOmin，用1.0mol/L的盐酸常温解离15 20min，至除根尖外根段透明呈黄色时为宜，将根尖置于蒸馏水中低渗处理约30min或更长时间，用改良苯酚品红溶液和醋酸洋红溶液进行染色，30min后压片，压至根尖分开成云雾状，镜检观察多倍体植株2n=4X=64，普通白及植株2n=2X=32，确定所得到的为四倍体植株。进一步进行流式分析，主要方法步骤为:取白及多倍体叶片以及普通白及叶片各Ig左右，加入1.8ml冰浴预冷的细胞核提取液，在培养皿里用锐利的眼科剪快速将其剪碎，以二倍体白及叶片作对照。然后经350目尼龙网过滤至1.5ml离心管中，4°C条件下，IOOOrpm离心5min,吸取上清液200 300 U I,加入等体积上述染色液，悬起，暗处染色5 15min,进行流式细胞仪检测及软件分析,发现对照组即普通白及含2C DNA，多倍体白及含4C DNA (图2)，进一步表明本发明所得到的白及多倍体植株为四倍体植株。5)将四倍体白及转接到MS+0.5mg/Ll-萘乙酸+10%香蕉汁的培养基中，待根长到2cm以上时，打开瓶盖，至于室温下2 4天，取出小苗，洗去根部培养基，栽入营养土中，浇透水，并用塑料薄膜覆盖一周；6)上述白及苗在地膜覆盖一周后去除地膜，定期进行浇水施肥等管理，三年后长成白及四倍体植株，取其中一棵植株，测得株高:66cm，块茎直径分别为:10X9X4cm (长X宽X厚);13X9X5cm。叶片5片，叶距3 7cm，顶叶长41cm，宽3.5 5cm，中间叶片长33cm,宽5 8cm,块莖重93.0lg,整个植株重138g,蒴果长2.5cm,直径0.7cm。实施例2:`
具体步骤如实施例1所述，不同的是步骤2中的秋水仙素浓度为0.20%,处理时间为9d，变异率为41.07 ± 1.34%。最后，还需注意的是，以上实施例子仅是本发明的若干个具体实施例子，本发明不限于上述的实施例，还有许多变形，本领域相关的人员能从本发明内容中直接导出或者联想出的所有变形，均认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种白及多倍体植株的培育方法，所述方法包括: (1)将消毒后的白及种子抖入秋水仙素溶液中，黑暗条件下培养6 8d后，离心、洗涤去除秋水仙素；所述秋水仙素溶液浓度为0.1 0.4%，pH5.8 6.2，溶剂为1/2MS或MS培养液； (2)将秋水仙素处理过的白及种子转接到白及种子萌发培养基中，先于培养箱中黑暗条件下培养5 6d，再移至培养室，培养温度23 27°C，光照度2000 25001x，光照12h/d，培养三个月得到多倍体白及幼苗；所述白及种子萌发培养基组成如下:1-萘乙酸0.2 0.5mg/L，pH5.8 6.2，溶剂为 1/2MS 或 MS 培养液； (3)将上述培养得到的白及幼苗，挑选出茎变粗、叶片加厚、叶色加深的植株，转接到白及增殖培养基中进行稳定扩繁，选取2 3代性状稳定的植株进行多倍体的鉴定；所述白及增殖培养基组成如下:6_节氨基嘌呤1.0 2.0mg/L, 1-萘乙酸0.1 0.5mg/L, pH5.8 6.2，溶剂为1/2MS或MS培养液； (4)鉴定为多倍体的植株转接到生根壮苗培养基中进行培养，即获得白及多倍体植株的幼苗；所述生根壮苗培养基组成如下:1-萘乙酸0.5 1.0mg/L,香蕉汁5 10%，PH5.8 6.2，溶剂为1/2MS或MS培养液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)所述消毒方法如下:取白及蒴果，用洗衣粉浸泡8 IOmin,自来水冲洗5 5min,然后用75%乙醇消毒2 3min,无菌水冲洗，0.1%升汞消毒15 20min，无菌水冲洗，无菌吸水纸将蒴果表面残留的水吸干，消毒后的白及蒴果切开即获得消毒后的白及种子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)所述消毒方法如下:白及蒴果切开，取白及种子，加入75%乙醇，IOs后立即加入无菌水，离心或过滤，取白及种子加入0.1%升汞溶液，5min后加入无菌水 ，离心或过滤，取白及种子用无菌吸水纸上吸干，即得消毒后的白及种子。
全文摘要
本发明提供了一种白及多倍体植株的培育方法，所述方法包括秋水仙素处理白及种子、白及种子萌发培养、白及幼苗增殖培养等步骤，鉴定为多倍体的植株再转接到生根壮苗培养基中进行培养，即获得白及多倍体植株的幼苗；本发明利用白及种子为材料获得的白及多倍体植株，具有显著的多倍体特征，且制备方法简单，对白及新品种的培育工作具有重要的指导意义，本发明获得的白及多倍体具有较高的应用价值。
文档编号A01H4/00GK103168685SQ20131008525
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者蒋福升, 丁志山, 吕迪, 李伟平, 金波, 丁滨, 高承贤 申请人:浙江中医药大学