本发明属于羊肚菌栽培领域，涉及一种羊肚菌单孢菌株采用“人工授粉”进行栽培的方法。
背景技术：
羊肚菌是子囊菌中的一种美味食用菌。羊肚菌营养丰富，具有养胃、护肝的滋补疗效，广受消费者欢迎，在菌类市场上供不应求。随着羊肚菌的市场需求量快速增长，靠采集野生羊肚菌已无法满足需求。因此，近年来出现了一批人工栽培羊肚菌的技术，例如授权公告号CN103583232B、CN103202177B、CN101628834B的专利和申请公布号CN103782802A、CN103583240A、CN101053302所述的栽培方法。羊肚菌的出菇依靠其有性生殖的过程，而羊肚菌有性生殖的机理长期未研究清楚。
本专利发明人研究发现，大多数自然状态下的羊肚菌菌丝分为X型、Y型、XY型三种菌丝。X型菌丝是由X型单孢子发育而来，只具有MAT1-1-1交配型基因。Y型菌丝是由Y型单孢子发育而来，只具有MAT1-2-1交配型基因。X型、Y型菌丝又被称为单孢菌丝或同核菌丝。XY型菌丝是由X、Y型菌丝在羊肚菌生命周期的某一阶段融合后产生，同时具有MAT1-1-1和MAT1-2-1两个交配型基因，又叫异核菌丝或双核菌丝。
X型、Y型菌丝均可以产生白粉状的“小分生孢子”。只有Y型的小分生孢子与X型菌丝融合后，才能产生可出菇的XY型菌丝。X型小分生孢子与Y型菌丝之间可融合产生XY型菌丝，但该菌丝的出菇能力很弱。X型小分生孢子与X型菌丝之间、Y型小分生孢子与Y型菌丝之间、任何类型的小分生孢子与小分生孢子之间、任何类型的菌丝与菌丝之间，都无法融合产生可出菇的XY型菌丝。因此，在羊肚菌的有性生殖过程中，只有X型的菌丝和Y型的小分生孢子是需要的，而Y型的菌丝和X型的小分生孢子都是不必要的。
进一步的研究发现，羊肚菌在出菇过程中所需的营养主要是由存储在X型菌丝细胞中的油滴提供的，因此在栽培过程中需要给X型菌丝供给充足的营养才能提高子实体的产量。而X、Y型菌丝均在营养缺乏的条件下更容易产生小分生孢子，因此需要让Y型菌丝处于营养缺乏的条件下以促进Y型小分生孢子的形成，同时应避免让X型菌丝产生小分生孢子以免浪费营养。
在所有现有的羊肚菌栽培技术中，所用的菌株都源自组织分离或多孢子分离，是X型、Y型的菌丝的混合物。在栽培过程中，X型、Y型菌丝混在一起栽培，处于同一环境条件下。在放置营养袋前，X型、Y型菌丝均产生小分生孢子，而X型的小分生孢子是一种浪费。在放置营养袋对菌丝进行营养供给后，X型、Y型菌丝均获得了营养供给，不利于Y型菌丝继续高效率地产生小分生孢子，同时被Y型菌丝吸收储藏在细胞内的营养物质对于出菇是没有意义的，却分走了本该被X型菌丝吸收的营养，也是一种浪费。综上所述，现有的羊肚菌栽培方式需要改进。
技术实现要素：
本发明提供了一种新的羊肚菌栽培方法。通过在栽培开始阶段将X型、Y型菌株分别栽培的方式，采用只对X型菌丝提供营养袋中的营养，而通过薄层土层架栽培的方式创造最适合Y型菌丝产生Y型小分生孢子的环境。创造了给羊肚菌单孢菌株采用“人工授粉”的方法，将含有Y型小分生孢子的培养土播撒到X型菌丝的菌床上，促进XY型菌丝的高效形成，利于最终出菇，起到提高栽培效率，提升产量的作用。
本发明羊肚菌单孢菌株采用“人工授粉”进行催菇出菇的栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、备种：取羊肚菌属中同一个种的X型菌株和Y型菌株，在培养基中分别培养，使得X型菌株的菌丝和Y型菌株的菌丝分别蔓延至培养基中，分别得到X型菌种和Y型菌种；
B、X型菌种播种：
1)栽培地预处理：栽培地采用高箱垄作、双沟条播的方法，制成作为母菌床；
2)培养基下地：在栽培地的母菌床中，平均每平方米菌床播种500-1400ml步骤A备种所得X型菌种(优选菌种采用菌种瓶装)；
3)补水：保持土壤表层1-3cm含水量60-80％；
4)补营养袋：在地表形成大量羊肚菌菌丝后3-7天，放置营养袋；
C、Y型孢子育粉：采用室内层架方式培育Y型小分生孢子：
1)将步骤A备种所得Y型菌种与土壤按照5000ml-14000mlY型菌种混合1立方米土壤的比例混合，铺在层架上，形成厚度1-4厘米的土层；
2)补水控温：保持土壤含水量45-60％，温度10-20℃；
3)护理至土壤表明产生大量白色的小分生孢子，该小分生孢子称为粉土；
D、人工授粉：在X型菌丝的母菌床放置营养袋15-25天后，将粉土播撒在母菌床上，其中，优选每平方米母菌床播撒0.005-0.01立方米粉土；
E、管理，采收：按照常规条件管理直至采收。
上述技术方案中：
步骤A的备种中：采用的培养容器为玻璃瓶菌种瓶、聚丙烯塑料菌种瓶或聚丙烯塑料袋等培养容器中的任意一种。
本发明中发明人为了便于操作，采用了最常见的玻璃瓶菌种瓶。
所述菌种瓶是容量800毫升、高与直径比例为1-1～2:1的玻璃瓶，装有3/4-4/5体积的麸皮培养基。
所述麸皮培养基为：麸皮加水至湿度为60-70％，再加入生石灰调节pH值至8.0-8.5。
培养条件为：在15-25℃培养16-20天，使羊肚菌菌丝蔓延到大部分麸皮培养基中。
步骤B的X型菌种播种中：
步骤1)栽培地预处理：母菌床的垄高为20-40cm，垄宽为60-150cm；垄之间的沟宽20-50cm。
步骤4)所述营养袋为常用营养袋。
如可采用的营养袋填料是由下述重量百分比的组分制成：为麦粒70-80％，谷壳20-30％，用生石灰调pH至8.5-9.5，每袋装750g填料，外皮为聚丙烯塑料膜，灭菌即得。
步骤4)放置营养袋前，先在营养袋的一面打3-4排小孔，每排8-10个小孔，每个小孔直径1-3mm。
步骤4)放置营养袋为每亩放置1500-2200个营养袋，每垄横向2袋，纵向间隔20-45cm。小孔朝下摆放。
步骤4)放置营养袋后搭建遮阳棚，控制透光率2-10％，优选透光率5％。具体的，搭建遮阳棚的棚高2-3米，通过覆盖遮阳网实现控制透光率。
步骤C的Y型孢子育粉中：
所述层架又称为育粉床，层架的每层长度2-20米，宽度1-2米，层高30-60厘米。
本发明的关键步骤在于步骤A-D：步骤A、备种；步骤B、X型菌种播种；步骤C、Y型孢子育粉；步骤D、人工授粉，之后的步骤E的管理，采收按照现有已报道的条件管理即可。步骤E的管理，采收的方法参见《四川羊肚菌高效栽培模式与技术》(《食药用菌》2016年第24卷第3期，151～154页的记载，具体的管理条件为保持母菌床土壤表层1-3cm含水量50-70％，温度为2-15℃；40-60天后(优选50天后)，温度达到12-15℃，喷雾补水催菇：喷雾补水控制使空气湿度为60-90％，土壤表层1-3cm的含水量50-70％；出菇后控制温度8-20℃至采收结束。
当羊肚菌子实体成熟，菌盖长度达到3-6cm，颜色由深灰色转为棕色时，即可采收。具体的，采用刀片轻轻横切断菌柄，将子实体轻放入采收容器中即可。
本发明栽培方法的主要创新点和有益点：
(1)相比传统羊肚菌栽培方法使用X型、Y型菌丝的混合物作为栽培菌种，本发明栽培方法是将X型、Y型菌株分别置于不同的环境下培养。
(2)“人工授粉”本是粮食、蔬菜、果树等高等植物栽培领域的概念，本发明栽培方法第一次给食用菌栽培领域引入了“人工授粉”的概念和方法，将Y型的小分生孢子授给X型菌丝。
(3)使X型菌株专注于从营养袋中吸收和储藏营养，使Y型菌株专注于产生小分生孢子，减少了营养浪费，提升了转化效率，从而有利于提高产量。
(4)本发明栽培方法使用X型、Y型两个独立的菌株作为菌种，因此，只要将带有不同优良性状的X型菌株和Y型菌株用本方法栽培出菇，就可从实质上实现菌株杂交，为羊肚菌杂交育种提供了一种新的栽培方法。
名词解释：
羊肚菌：指真菌中属于羊肚菌属(Morchella genus)的所有食用菌，包括但不限于梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、六妹羊肚菌(Morchella sextelata)、七妹羊肚菌(Morchella septimelata)、尖顶羊肚菌(Morchella conica)、黄羊肚菌(Morchella esculenta)、高羊肚菌(Morchella elata)、粗腿羊肚菌(Morchella crassipes)等。最常见的用于人工栽培的羊肚菌包括梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌。
菌种：是指食用菌、工业菌、农用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。
单孢菌丝：由单个子囊孢子萌发形成的菌丝，只含有一种交配型的细胞核，因此又称为单核菌丝。
小分生孢子：一些子囊真菌可以产生两种分生孢子，分别是大分生孢子(macroconidium)和小分生孢子(microconidium)。大分生孢子一般直径较大，有多个细胞核，有较多的细胞器，很容易萌发成菌丝，主要用于真菌的无性繁殖。小分生孢子是出现在有性繁殖过程中的分生孢子，通常只有一个细胞核且细胞器较少，一般不容易独立萌发成菌丝。在有性繁殖开始时，一种交配型的单孢菌丝产生的小分生孢子与另一种交配型的单孢菌丝发生融合，形成异核菌丝，这个过程是细胞质的交配，又称为质配。异核菌丝中，两种不同交配型的细胞核尚未发生融合。在异核菌丝生长一段时间后，两种不同交配型的细胞核发生融合，这个过程是细胞核的交配，又称为核配。核配后形成的融合细胞核随后发生减数分裂，形成4个或8个子囊孢子。每个子囊孢子中仅含有一种交配型的细胞核，由单个子囊孢子萌发成的菌丝再次成为单孢菌丝。
人工授粉：人工授粉原是用于粮食、蔬菜、果树等开花的高等植物的概念，是指将从雄蕊中获得的花粉撒在雌蕊的柱头上，促进花粉中的精细胞与雌蕊子房中的卵细胞结合，使植物结出果实的步骤。本发明中第一次定义了食用菌的“人工授粉”的概念：是指将Y型菌株产生的小分生孢子撒在X型菌株的菌丝上，促进X型、Y型菌株进行质配，开启有性生殖过程，促进食用菌产生子实体(即出菇)的步骤。与高等植物人工授粉的原理和步骤有类似性但又有所不同。
具体实施方式
本发明羊肚菌单孢菌株采用“人工授粉”进行催菇出菇的栽培方法，所需的单孢菌株是由羊肚菌的子囊中挑取的单孢子萌发而成。单孢菌株可经由PCR鉴定法、全基因组测序法、转录组测序法、核酸杂交法或蛋白质免疫印迹杂交法鉴定为X型菌株或Y型菌株。本发明栽培方法的备种、X型菌种播种、Y型孢子育粉、人工授粉、授粉后管理、采用的步具体如下：
备种：取羊肚菌属(genus)中同一个种(species)的X型菌株和Y型菌株，分别接入菌种瓶。菌种瓶是容量800毫升、高与直径比例为1-1～2:1的玻璃瓶，装有3/4-4/5体积的麸皮培养基。麸皮培养基的制备方法是往干麸皮中喷水至60-70％湿度，再逐渐加入生石灰调节pH值到8.0-8.5。菌种瓶在15-25℃培养16-20天，使羊肚菌菌丝蔓延到大部分麸皮培养基中，分别得到X型菌种和Y型菌种。
X型菌种播种：栽培地采用高箱垄作、双沟条播的方法，制成垄高20-40cm、垄宽60-150cm的母菌床，垄之间的沟宽20-50cm。平均每平方米菌床播种1-2个X型的菌种瓶(换算后，按照菌种瓶容量800毫升、装有3/4-4/5体积培养基换算，菌种瓶中X型菌种约为500-700ml，则1-2个菌种为500-1400ml)。播种第3天后开始补水，始终保持土壤表层1-3cm含水量60-80％。在地表形成大量羊肚菌菌丝后3-7天，放置营养袋。营养袋填料配方为麦粒70-80％，谷壳20-30％，用生石灰调pH至8.5-9.5，每袋装750g填料，外皮为聚丙烯塑料膜，经121℃灭菌2小时。放置前用钉板或螺丝刀在营养袋的一面打3-4排小孔，每排8-10个小孔，每个小孔直径1-3mm。每亩放置1500-2200个营养袋，每垄横向2袋，纵向间隔20-45cm。小孔朝下摆放。随后搭建遮阳棚，棚高2-3米，所覆盖遮阳网透光率5％。
Y型孢子育粉：采用室内层架方式培育Y型小分生孢子。层架又称育粉床，层架的每层长度2-20米，宽度1-2米，层高30-60厘米。按照10-20个Y型菌种瓶加入1立方米土壤的比例(换算后，按照菌种瓶容量800毫升、装有3/4-4/5体积培养基换算，菌种瓶中Y型菌种约为500-700ml，则10-20个菌种为5000-14000ml)，将Y型菌种与土壤混合均匀，铺在层架上，形成厚度1-4厘米的土层。播种第2天后开始补水，始终保持土壤含水量45-60％，室内温度10-20℃之间，持续5-15天直至土壤表明产生大量白色的小分生孢子，称为粉土。此过程不能放置任何营养袋。为了配合X型菌株菌丝的生长，一般在X型菌种播种后10-15天，开始进行Y型孢子育粉，
人工授粉：在X型菌丝的母菌床放置营养袋后15-25天，且Y型分生孢子布满育粉床后，从育粉床上铲起含有小分生孢子的粉土，均匀播撒在母菌床上，按照每平方米母菌床播撒0.005-0.01立方米粉土的比例。
授粉后管理：授粉后始终保持母菌床土壤表层1-3cm含水量50-70％，大棚中的温度在2-15℃之间。50天后，待自然升温或人工加温使大棚中的温度达到12-15℃，喷雾补水催菇，使大棚内空气湿度60-90％，土壤表层1-3cm的含水量50-70％，即开始大量出菇。出菇后大棚内气温维持在8-20℃之间，直至采收结束。
采收：当羊肚菌子实体成熟，菌盖长度达到3-6cm，颜色由深灰色转为棕色时，既可采摘。用刀片轻轻横切断菌柄，将子实体轻放入采收容器中。
具体实例和实施效果
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。
实施例1：
时间：2014年9月开始
地点：四川省成都市双流县
备种：取梯棱羊肚菌3号(Morchella importuna M3#)的X型菌株和Y型菌株，分别接入菌种瓶。菌种瓶是容量800毫升、高与直径比例为1.5:1的玻璃瓶，装有3/4体积的麸皮培养基。麸皮培养基的制备是往干麸皮中喷水至60％湿度，再逐渐加入生石灰调节pH值到8.4。菌种瓶在18℃培养17天，使羊肚菌菌丝蔓延到大部分麸皮培养基中，分别得到X型菌种和Y型菌种。
X型菌种播种：栽培地采用高箱垄作、双沟条播的方法，制成垄高30cm、垄宽100cm的母菌床，垄之间的沟宽30cm。每平方米菌床播种一个X型的菌种瓶。播种第3天后开始补水，始终保持土壤表层1-3cm含水量70％左右。在地表形成大量羊肚菌菌丝后5天，放置营养袋。营养袋填料配方为麦粒80％，谷壳20％，用生石灰调pH至9.5，每袋装750g填料，外皮为聚丙烯塑料膜，经121℃灭菌2小时。放置前用钉板或螺丝刀在营养袋的一面打4排小孔，每排10个小孔，每个小孔直径2mm。每亩放置2000个营养袋，每垄横向2袋，纵向间隔35cm。小孔朝下摆放。随后搭建遮阳棚，棚高2.5米，所覆盖遮阳网透光率5％。
Y型孢子育粉：在X型菌种播种后12天，开始采用室内层架方式培育Y型小分生孢子。育粉床层架的每层长度12米，宽度1.5米，层高35厘米。按照15个Y型菌种瓶加入1立方米土壤的比例，将Y型菌种瓶内容物与土壤混合均匀，铺在层架上，形成厚度2厘米的土层。播种第2天后开始补水，始终保持土壤含水量50％，室内温度控制在10-20℃之间，持续12天直至土壤表明产生大量白色的小分生孢子，即为粉土。
人工授粉：在X型菌丝的母菌床放置营养袋后第20天，且Y型分生孢子布满育粉床后，从育粉床上铲起全部粉土，均匀播撒在母菌床上，按照每平方米母菌床播撒0.0075立方米粉土的比例。
授粉后管理：授粉后始终保持母菌床土壤表层1-3cm含水量50-70％，大棚中的温度在2-15℃之间。越过冬季，第二年2月1日大棚内的温度自然升温达到12-15℃，开始喷雾补水催菇，使大棚内空气湿度80-90％，土壤表层1-3cm的含水量60-70％，即开始大量出菇。出菇后大棚内气温维持在8-20℃之间，直至采收结束。
采收：当羊肚菌子实体成熟，菌盖长度达到3-6cm，颜色由深灰色转为棕色时，用刀片轻轻横切断菌柄，将子实体轻放入采收容器中。
实施例2：
时间：2015年10月开始
地点：四川省成都市新都区
备种：取六妹羊肚菌0号(Morchella sextelata M0#)的X型菌株和Y型菌株，分别接入菌种瓶。菌种瓶是容量800毫升、高与直径比例为2:1的玻璃瓶，装有3/4体积的麸皮培养基。麸皮培养基的制备是往干麸皮中喷水至60％湿度，再逐渐加入生石灰调节pH值到8.1。菌种瓶在20℃培养14天，使羊肚菌菌丝蔓延到大部分麸皮培养基中，分别得到X型菌种和Y型菌种。
X型菌种播种：栽培地采用高箱垄作、双沟条播的方法，制成垄高35cm、垄宽120cm的母菌床，垄之间的沟宽25cm。平均每平方米菌床播种1.25个X型的菌种瓶。播种第3天后开始补水，始终保持土壤表层1-3cm含水量65％左右。在地表形成大量羊肚菌菌丝后4天，放置营养袋。营养袋填料配方为麦粒75％，谷壳25％，用生石灰调pH至9.2，每袋装750g填料，外皮为聚丙烯塑料膜，经121℃灭菌2小时。放置前用钉板或螺丝刀在营养袋的一面打3排小孔，每排10个小孔，每个小孔直径3mm。每亩放置1800个营养袋，每垄横向2袋，纵向间隔40cm。小孔朝下摆放。随后搭建遮阳棚，棚高2米，所覆盖遮阳网透光率5％。
Y型孢子育粉：在X型菌种播种后12天，开始采用室内层架方式培育Y型小分生孢子。育粉床层架的每层长度12米，宽度1.5米，层高35厘米。按照18个Y型菌种瓶加入1立方米土壤的比例，将Y型菌种瓶内容物与土壤混合均匀，铺在层架上，形成厚度2.5厘米的土层。播种第2天后开始补水，始终保持土壤含水量55％，室内温度控制在10-20℃之间，持续14天直至土壤表明产生大量白色的小分生孢子，即为粉土。
人工授粉：在X型菌丝的母菌床放置营养袋后第22天，且Y型分生孢子布满育粉床后，从育粉床上铲起全部粉土，均匀播撒在母菌床上，按照每平方米母菌床播撒0.01立方米粉土的比例。
授粉后管理：授粉后始终保持母菌床土壤表层1-3cm含水量50-70％，大棚中的温度在3-13℃之间。越过冬季，第二年2月8日大棚内的温度自然升温达到12-15℃，开始喷雾补水催菇，使大棚内空气湿度85-90％，土壤表层1-3cm的含水量60-70％，即开始大量出菇。出菇后大棚内气温维持在8-20℃之间，直至采收结束。
采收：当羊肚菌子实体成熟，菌盖长度达到3-6cm，颜色由深灰色转为棕色时，用刀片轻轻横切断菌柄，将子实体轻放入采收容器中。
对照例：
在实施例1和实施例2的同样栽培地点，采用授权号或公布号CN103202177B、CN101628834B、CN103583240A的发明提供的羊肚菌栽培方法进行栽培。
方案实施效果
表1不同专利中提供的菌种的每亩成本投入，含地租、原料成本和人力成本(单位：元/亩)
表2采用不同专利中提供的菌种的羊肚菌亩产(单位：kg每亩，重量为干重)
以上结果表明，采用本发明提供的栽培方法，虽然由于将X型、Y型菌株分开培育并引入“人工授粉”过程，略微增加了栽培操作的复杂程度从而导致每亩成本上浮27％-37％不等。但是每亩产量提升320％-660％，使得羊肚菌的栽培产出/投入比更加高效，同时用更少的耕地达成了更高的产量，对于现代化高效农业是一种值得推广的模式。