专利名称：氯化筒箭毒碱调节区、核苷酸序列测定及其使用的方法
本申请要求保护US临时申请60/146,540(1999.7.30提交)的利益，该申请的全部内容均引入这里作为参考。
本发明涉及控制基因表达的调节区。具体说，本发明涉及5’调节区的核苷酸序列及其片段，该片段可启动氯化筒箭毒碱基因的转录，这里称为氯化筒箭毒碱基因启动子。具体说，本发明涉及5’调节区及其片段，该片段可启动鼠的氯化筒箭毒碱基因的转录。本发明还涉及使用这种区来调节异源基因在细胞或动物中表达、改造宿主细胞、筛选出激活或抑制其转录和表达的化合物的方法，以及抑制其在细胞中表达以便促进家畜、家禽、鱼和陪伴动物肌肉生长、以及治疗肌肉萎缩和神经肌肉疾病的方法。
生长和分化因子-8(GDF-8或氯化筒箭毒碱)，这里称为氯化筒箭毒碱，属于分泌型生长和分化因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一个成员(McPherron等，Nature 387:83(1997))。TGF-β家族成员以大的前体蛋白而合成，其中所说的前体蛋白在C-末端的大约110-140氨基酸的碱性残基簇处被蛋白酶切割。C-末端区因二硫键合的二聚物而具活性，具有一些程度的氨基酸序列和结构相似性。TGF-β家族的特征在于具有一个共有氨基酸序列和在链内二硫键中的保守半胱氨酸残基，该链内二硫键造成胱氨酸结蛋白折叠。该家族的成员包括米勒抑制物质(MIS)(Behringer等，1990,Nature,345:167)；骨形态发生蛋白(BMPs)(Sampath等，1990,J.Biol.Chem.265:13198)；生长和分化因子(GDFs)；抑制素类；以及果蝇decapentaplegic蛋白(DPP-C)(Padgett等，1987,Nature 325:81)。
氯化筒箭毒碱在所有经检查的脊椎动物中得到鉴定，包括在小鼠、大鼠、人、狒狒、牛、猪、绵羊、鸡、火鸡、猫、狗和鱼中。小鼠中氯化筒箭毒碱基因的破坏会导致骨骼肌肉群大大增加，从而肌肉增生肥大，并且是引起小鼠纯合Cmpt(致密)突变的肌过大表型的至少部分原因(Mcpherron等，(1997)；Szabo,G等，哺乳类基因组(Mammalian Genome)9:671(1998))。在牛的双倍肌物种如Belgian Blue或Piedmontese中，据示牛氯化筒箭毒碱基因部分缺失或含有错义突变。(Grobet,L等，Nat.Genet.17:71(1997)；Kambadur等，Genome Res.7:910(1997)；McPherron和Lee,Proc.Natl.Acad.Sci USA 94:12457(1997))。因此，看得出氯化筒箭毒碱可起骨骼肌生长的负调节剂作用，然而没有描述调节其表达的机理(McPherron等，(1997))。
已测定了各个物种的用于氯化筒箭毒碱的cDNA序列，并且推断的氨基酸序列极其保守，特别是C-末端的109个氨基酸的氨基酸序列。WO94/21681(Lee和McPherron(1994))中公开了人和鼠氯化筒箭毒碱基因的全长氨基酸编码区的核苷酸序列。WO98/33887(Lee和McPherron(1998))中公开了大鼠和鸡氯化筒箭毒碱基因的全长氨基酸编码区的核苷酸序列。尽管人和鼠氯化筒箭毒碱基因的编码序列已被测定，但控制这些基因表达的调节序列仍未被表征。
本发明涉及氯化筒箭毒碱基因的转录调节区。具体说，本发明涉及紧靠鼠氯化筒箭毒碱编码序列5’的2.5kb多核苷酸序列，其核苷酸序列和使用该调节区的方法，以及其片段。本发明涉及本发明氯化筒箭毒碱启动子的用途，用于指导靶基因以细胞或组织特异性方式如在肌肉细胞或组织中表达。本发明涉及本发明氯化筒箭毒碱启动子在高产量筛选中用于鉴定抑制氯化筒箭毒碱启动子活性或氯化筒箭毒碱表达的试验化合物。本发明涉及增加家畜、家禽或鱼类肌肉量和饲料转化率的方法，具体说是改造瘦肉增加的动物，以便减少动物可以去被屠宰所需要的时间。根据本发明，由于治疗疾病的方法涉及氯化筒箭毒碱基因的表达，例如人和陪伴动物中与变老或生病有关的肌肉萎缩，因此可以使用氯化筒箭毒碱启动子的抑制剂来抑制氯化筒箭毒碱的表达。
本发明以2.5kb鼠氯化筒箭毒碱基因启动子的完整核苷酸序列的测定为基础。虽然先前已报道过氯化筒箭毒碱基因的核苷酸序列，但没有报道过氯化筒箭毒碱启动子区。通过组合使用各种操作，本发明对鼠氯化筒箭毒碱基因的启动子区进行了鉴定、测序和报道。当2.5kb区及其某些片段被放在表达载体中的荧光素酶报道基因的上游，并且被引入肌肉细胞系中时，这些序列可诱导报道基因的表达。此外，鼠氯化筒箭毒碱基因的鉴定启动子序列和猪氯化筒箭毒碱基因的鉴定启动子序列显出高度的同源性。
本发明的一个目的是将2.5kb调节区、或其转录活性片段插入表达载体中，以便体外和体内调节细胞中下游编码序列的表达。
在本发明的另一个实施方案中，将前述的载体稳定整合到宿主细胞的基因组中。在筛选试验中用测试化合物处理细胞，以便测定化合物激活或抑制调节区转录活性的能力。可以将所选的化合物配制成药物组合物，以促进肌肉生长或治疗与氯化筒箭毒碱异常表达有关的紊乱。
在本发明的又一个实施方案中，将前述的载体引入胚细胞或其它类型的细胞中，以便构建转基因动物来调节转基因以组织特异性方式的表达。
本发明的还一个目的是将互补于2.5kb调节区或其部分的多核苷酸传递到细胞中，以抑制内源2.5kb区的转录活性，由此减量调节氯化筒箭毒碱的表达。这种多核苷酸可用于促进生长，或治疗与氯化筒箭毒碱表达有关的疾病，例如肌肉萎缩和神经肌肉疾病。
本发明还涉及治疗家畜、家禽或鱼以促进肌肉生长的方法。具体说，本发明涉及增加肌肉量和饲料转化率的方法，为的是增加生长以便动物可以很快被屠宰。本发明的治疗方法可应用于人类和非人类。
本发明另涉及诸如肌肉萎缩、神经肌肉性病症、癌症和老化的疾病的治疗方法，其中所说的方法包括施用可调控氯化筒箭毒碱基因表达从而使疾病症状改善的化合物。
此外，本发明涉及使用氯化筒箭毒碱启动子序列进行诊断评价、基因测试和预测与氯化筒箭毒碱表达有关疾病或病症的方法。
本发明还进一步涉及鉴定能够调控氯化筒箭毒碱启动子活性和氯化筒箭毒碱基因表达的化合物的方法，其中该方法包括将化合物施用给在氯化筒箭毒碱启动子或其转录活性片段的控制下表达基因的细胞；测定基因表达或基因产物活性的水平；并且将此水平与在缺少化合物的情况下由细胞产生的基因表达或基因产物活性的水平相比较，以致如果在化合物的存在下所获得的水平不同于缺少其时所获得的水平，便鉴定为能够调控氯化筒箭毒碱基因表达或启动子活性的化合物。
图1A-B鼠氯化筒箭毒碱基因编码区的2482bp上游的DNA序列。该DNA序列包括控制氯化筒箭毒碱基因表达的鼠氯化筒箭毒碱启动子区部分。
图2使用荧光素酶试验系统(promega)测定四个鼠氯化筒箭毒碱启动子DNA片段指导荧光素酶表达的效率。
图3鼠和猪(登记号AF093798)最接近这些基因转录起始位点的氯化筒箭毒碱启动子区域之间的DNA序列同源性比较。
本发明涉及多核苷酸序列，该序列编码启动转录的氯化筒箭毒碱基因元件。具体说，本发明涉及2482个核苷酸(或2.5kb片段)的多核苷酸，该多核苷酸位于紧靠鼠氯化筒箭毒碱基因的转录起始位点的5’端。该启动转录的调节区的各种片段也包括在本发明的范围内。在本发明的一个实施方案中，调节区是一个1.8kb片段，其中在启动子序列5’末端处含有最多0.7kb的缺失。在本发明的另一个实施方案中，调节区包含用于各种转录因子的DNA结合位点，包括(但不限于此)GATA和ATF-CREB。
本发明的氯化筒箭毒碱启动子区域优选得自哺乳动物有机体，并且首选人、小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊或陪伴动物，特别是猫和狗。氯化筒箭毒碱启动区也可以得自鸡、火鸡、鱼和其它这里所述的物种。
本发明的氯化筒箭毒碱启动子区域及其活性片段可以用来指导异源编码序列的表达。具体说，本发明包括人、鼠、牛、鸟、犬、猫、猪物种的氯化筒箭毒碱启动区。根据本发明，氯化筒箭毒碱启动子区域的活性片段包括启动子的片段，所说的启动子片段具有足够的长度，以便启动与该片段可操作连接的编码序列的转录。具体说，本发明氯化筒箭毒碱启动子的活性片段包括具有足够长度以便当与荧光素酶编码序列可操作连接并转染至肌肉细胞系中时启动荧光素酶启动子基因转录的片段。典型地，编码序列被放在紧靠启动区3’端并且与启动子区域可操作连接。该区的核苷酸序列见
图1A-B(SEQ ID NO:1)。所示的序列仅代表双链功能性启动子的一个链。该核苷酸序列的基本上不影响其转录活性的修饰也属于本发明的范围。这种修饰包括添加、缺失和取代。此外，在严格条件下与SEQ IDNO:1序列选择性杂交、并且能够激活编码序列表达的任何核苷酸序列，包括在本发明中。当位于异源基因编码区的上游时(如下较详细讨论的)，2482bp片段(来自核苷酸1-2482)当转染至鼠C2C12细胞系中时足以指导荧光素酶报道基因，或猪生长激素释放激素的表达。示例性的严格杂交条件如下在65℃下将含DNA的滤膜于缓冲液中预杂交8小时至过夜，所说的缓冲液由6X SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll和0.02％ BSA组成。在65℃下将滤膜在含放射性或化学标记探针的预杂交混合物中杂交48小时。在37℃下将滤膜在数次更换的溶液中洗涤，所说的溶液含有2X SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％ BSA，然后放射自显影。可以使用的其它高严格条件是本领域公知的。例如，参见Sambrook等(Eds.)1989，分子克隆实验室手册，Cold SpringHarbor Laboratory of Press Inc,Plainview,N.Y.；Ausubel等(Eds.)1998，分子生物学中的流行方案，John Wiley and Sons,Inc,New York；均整体引入这里作为参考。
本发明还涉及测定得自不同物种的氯化筒箭毒碱启动区之间的高同源性或相同性区。具体说，将鼠氯化筒箭毒碱启动区的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)与猪启动子序列(SEQ ID NO:2)比较，参见图3。最大同源性的区域是在鼠启动子序列的2178-2482处(SEQ ID NO:3)鼠和猪氯化筒箭毒碱启动子之间有90％的序列同源性。因此，一个方面，本发明涉及鉴定其它物种中的氯化筒箭毒碱启动区，基于对鼠氯化筒箭毒碱启动子在2178-2482位置(SEQ ID NO:3)的区的互补性。此可以通过这里所述的杂交试验来测定。本发明还涉及分离的核苷酸序列，该分离的核苷酸序列可在严格条件下与SEQ ID NO:3杂交、并且具有足够长度以启动编码序列转录，其中所说的编码序列在产生核苷酸序列的相同物种的肌肉细胞中与核苷酸序列可操作连接，条件是所说的核苷酸序列不得自猪的基因组。
氯化筒箭毒碱启动区、或其转录活性片段，优选得自哺乳动物有机体，并且首选人、小鼠、大鼠、牛、猪、绵羊或陪伴动物，特别是猫和狗。本发明的氯化筒箭毒碱启动区也可以得自鸡、火鸡、鱼和其它这里所述的物种。如果要鉴定物种间氯化筒箭毒碱调节区的高同源性区，使用寡核苷酸探针从任何物种中获得启动区对本领域技术人员来说是常规的，其中所说的寡核苷酸探针相当于编码所述氯化筒箭毒碱启动区的序列的一部分。也可以使用本领域技术人员已知的其它方法，来获得氯化筒箭毒碱启动区或其转录活性片段。另外，通过进行PCR，哺乳动物氯化筒箭毒碱启动子同源染色体可能可以分离自例如人的核酸，使用两种基于这里所述的鼠或猪氯化筒箭毒碱启动子的核苷酸序列所设计的引物库。用于反应的模板是染色体DNA。出于指导，有关的条件为例如Innis等(Eds.)1995,PCR策略，Academic Press Inc.,San Diego；和Erlich(ed)1992,PCR技术，OxfordUniversity Press,New York，均整体引入这里作为参考。
启动转录的氯化筒箭毒碱启动区及其片段，以及这里所述的起鉴定氯化筒箭毒碱启动区及其片段作用的片段和探针，可以通过重组DNA技术使用本领域公知的技术来生产。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建这些序列，或者以分离的形式或者包含在表达载体中。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。例如参见Sambrook等1989(同上)和Ausabel等1998(同上)所述的技术；还可参见“寡核苷酸合成”1984,Gait M.J.ed.,IRL Press,Oxford,所述的技术，其整体引入这里作为参考。
使用本领域技术人员公知的各种化学和酶的方法可以产生调节序列的改变。例如，可以删除由限制位点确定的序列的区。可以使用寡核苷酸定向诱变来以一定的方式改变序列和/或在序列内的特定区中引入限制位点。另外，使用DNA核酸酶如Bal31或ExoⅢ和S1核酸酶可以产生缺失突变体。通过长时间用核酸酶培养DNA，在调节序列中产生渐进较大的缺失(参见Ausubel等，1998分子生物学的流行方案，有关诱变技术的综述)。
评价变化的序列其在适宜宿主细胞中指导异源编码序列表达的能力。保留了其指导编码序列的表达能力的任何变化的调节序列都在本发明的范围内。此外，可以将这种变化的调节序列掺入到重组表达载体中作进一步的使用。
在本发明调节序列的控制下，可以表达各种各样的异源基因，例如编码疫苗、抗原、毒性基因产物、潜在毒性基因产物、和抗增生或抑制细胞的基因产物的基因。报道基因也可以表达，包括酶(如CAT、β半乳糖苷酶、荧光素酶)、荧光蛋白如绿荧光蛋白，或抗原标记。
鼠氯化筒箭毒碱基因启动区显示出选择组织特异性。它主要诱发骨骼肌细胞、脂肪细胞、和哺乳期乳腺的细胞中(例如，但不仅限于，肺组织中)的基因表达。因此，可以使用本发明的调节区及其转录活性片段来诱导骨骼肌细胞中异源基因的表达。本发明涉及氯化筒箭毒碱基因启动子的使用，来实现靶基因的组织特异性表达，以便促进生长或治疗疾病。具体说，在基因治疗方案中可以使用氯化筒箭毒碱基因启动区来实现组织特异性表达。在这种细胞是肿瘤细胞的情况中，可以以癌症基因治疗的形式使用通过鼠氯化筒箭毒碱基因启动区诱发的细胞毒性产物。此外，可以使用本发明描述的表达构建体将反义、antigene或aptameric寡核苷酸传递给细胞。还可以在细胞中表达核酶或单链RNA，来抑制所期望的具体基因的表达。用于这种反义或核酶分子的靶基因应当是那些对细胞维持来说是必要的编码基因产物的基因。
不考虑靶序列的选择，优选首先进行体外研究以定量测定寡核苷酸抑制基因表达的能力。这些研究应当利用对照，来区别特异性抑制和寡核苷酸的非特异性生物学效果。还优选这些研究进行靶RNA或蛋白的水平与内控RNA或蛋白的水平比较。
这里所述的氯化筒箭毒碱基因启动区可以被插入到各种表达载体中，以引入宿主细胞中。在一个优选的实施方案中，表达载体被稳定整合至细胞基因组中。
在哺乳动物宿主细胞中，可以将很多可商购获得的载体改造成插入本发明的调节区(如Clontech,Palo A1to,CA)。
此外，可以选择可调控所插入序列的表达、或以所需特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞种类。这种蛋白质产物的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对蛋白质的功能可能是重要的。可以选择适宜的细胞系或宿主体系来确保前述所表达的蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用拥有适合初级转录物加工、基因产物糖基化和磷酸化的细胞机的真核生物宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括(但不限于此)CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK293、WI38等等。
含鼠氯化筒箭毒碱基因启动区的表达载体可以含有编码选择标记的基因。可以使用许多选择体系，包括(但不限于此)单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(Wigler等，1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(Szybalska&Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:2026)、或腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy等，1980,Cell 22:817)基因，它们可以分别用在tk-、hgprt-或aprt-细胞中。而且，可以使用抗代谢物抗性作为dhfr基因选择的基础，其产生对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3567；O’Hare等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt基因选择的基础，其产生对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072)；neo基因选择的基础，其产生对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981,J.Mol.Biol.150:1)；或hygro基因选择的基础，其产生对潮霉素的抗性(Santerre等，1984,Gene 30:147)。其它可选择的基因包括trpB，其允许细胞使用吲哚代替色氨酸；HisD，其允许细胞使用组氨醇(histinol)代替组氨酸(Hartman&Mulligan,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8047)；ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其产生对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸、DFMO的抗性(McConlogue L.,1987，分子生物学中的交流，Cold Spring HarborLaboratory ed.)以及谷氨酰胺合成酶(Bebbington等，1992,Biotech 10:169)。
本发明还包括筛选试验，该试验为鉴定可调控氯化筒箭毒碱启动子活性或氯化筒箭毒碱表达的化合物而设计。本发明包括体外细胞基础的试验。待检测的化合物包括(但不限于此)寡核苷酸、肽、蛋白质、小的有机或无机化合物、天然产物、抗体等。也可以筛选组合化学文库。
在本发明的一个具体实施方案中，可以使用本发明的基因工程细胞系来筛选小的有机分子、肽、天然或合成的化合物或其它引起鼠氯化筒箭毒碱启动子转录活性刺激或抑制的联胞或可溶分子。这种化合物可以用来控制骨骼肌肉群，由此提高家畜、家禽和鱼类的性能和生长。本发明还涉及与骨骼肌肉群减少有关的疾病的治疗方法，由此治疗与疾病如肌萎缩性侧索硬化有关或因变老引起的肌肉萎缩。
可以使用由附着于固相载体的氨基酸的所有可能组合组成的随机肽文库，来鉴定能够激活或抑制氯化筒箭毒碱启动子活性的肽(Lam,K.S.等，1991,Nature354:82-84)。肽文库的筛选，在通过与启动区互作用从而刺激或抑制氯化筒箭毒碱表达的药剂的发现中，可以具有治疗价值。
本发明的试验方法涉及鉴定能够调控氯化筒箭毒碱启动子活性和氯化筒箭毒碱基因表达的化合物，其中该方法包括将化合物施用到细胞系中，所说的细胞系在可启动转录的氯化筒箭毒碱启动子或其片段的控制下表达基因；测定基因表达或基因产物活性的水平；并且将此水平与在缺少化合物的情况下由细胞产生的基因表达或基因产物活性的水平相比较，以致如果在化合物的存在下所获得的水平不同于缺少其时所获得的水平，便鉴定为能够调控氯化筒箭毒碱哺乳动物氯化筒箭毒碱基因表达或启动子活性的化合物。或者，可以通过本领域技术人员已知许多方法的任一种测定基因表达水平的改变，例如，通过测定mRNA转录物的所有溶胞产物(通过RNA印迹分析)，或通过测定由报道基因表达的基因产物。
这种体外筛选试验的一个实例描述如下。使用2.5kb启动子荧光素酶报道基因载体，在鼠C2C12肌肉细胞中建立一个稳定的细胞系。在使用适于细胞系的培养基的96孔平板上涂布C2C12细胞系。向细胞添加氯化筒箭毒碱基因表达的可能抑制剂。通过测定由氯化筒箭毒碱启动子驱动的荧光素酶报道基因的响应，来确定氯化筒箭毒碱基因活化的抑制剂效果。该试验在高产量筛选方式中容易建立起来，用于评价可降低(或增加)荧光素酶活性的96孔格式的化合物文库。例如，将稳定转染有2.5kb启动子-荧光素酶报道基因构建体的C2C12细胞(ATCC#CRL-1772)涂布在96孔组织培养基平板上，并且让其在DMEM、10％胎牛血清中37℃、5％CO2下生长18小时。然后加入测试化合物，让细胞生长另外48小时，并且通过在细胞培养物溶胞试剂(Promega)中冷冻和解冻，将细胞溶胞。通过向溶胞的细胞悬浮液添加荧光素酶试验底物和缓冲剂(Promega)，测定荧光素酶活性，并且使用Wallac 1450 Microbeta计数器测定相对光单位。
当抑制氯化筒箭毒碱启动子活性的化合物得到鉴定后，可以将其在基于动物的试验中进行测试，来确定化合物是否显出促进肌肉群和/或肌肉生长、或改善诸如肌肉萎缩、神经肌肉疾病或变老症状的能力。
哺乳动物氯化筒箭毒碱调节区可以用来通过转基因技术指导动物中编码序列的表达。任何物种的动物，包括(但不限于此)小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猪、微型猪、山羊、绵羊、牛、鸡、鱼和非人类的灵长目动物如狒狒、猴子和黑猩猩可以用来产生转基因动物。这里所说的“转基因”是指表达来自不同物种编码序列(如小鼠表达人的基因序列)的动物，以及被遗传改造成不再表达内源基因序列的动物(即，“敲除”动物)。在表达来自不同物种编码序列的转基因动物、以及被遗传改造的“敲除”转基因动物中，改变的编码序列以被稳定整合的形式存在于其体细胞中，并且也可以稳定整合至其生殖细胞系中，以便改变的编码序列传递给其后代。本发明包括其后代含有这种稳定整合的改变的编码序列的转基因动物，以及其中改变的编码序列仅被稳定整合在其体细胞、因此不传递给其后代的转基因动物。这里所说的“后代”还指单细胞的接下去的世代。
本发明包括适合作为高肌肉和蛋白含量、低脂肪和胆固醇含量的食品来源的非人类转基因动物。该动物的生殖细胞和体细胞中染色体被改变，以便氯化筒箭毒碱基因被以较低量表达或被完全破坏，导致动物具有低含量的氯化筒箭毒碱和比正常含量高的肌肉组织，优选不增加脂肪和/或胆固醇含量。
可以使用本领域已知的任何技术来在氯化筒箭毒碱调节区的控制下将转基因引入动物中，以产生转基因动物的起始系。这些技术包括(但不限于此)原核微量注射(Hoppe & Wagner,1989,US专利4,873,191)；逆转录病毒基因转移至生殖系(Van der Putten等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:6148-6152)；基因靶入胚胎干细胞(Thompson等，1989,Cell 65:313-321)；胚胎电穿孔(Lo,1983,Mol.Cell.Biol.31:1803-1814)；以及精子介导的基因转移(Lavitrano等，1989,Cell 57:717-723)(参见Gordon,1989，转基因动物，Intl.Rev.Cytol.115:171-229)。
可以使用本领域已知的任何技术来生产含转基因的转基因动物克隆，例如，将来自转基因动物或来自培养的胚胎、胎或成熟细胞的核转移至去核卵母细胞中(Campbell等，1996,Nature 380:64-66；Wilmut等，Nature 385:810-813)。
本发明提供可在氯化筒箭毒碱调节区或其片段的控制下携带转基因的转基因动物，所说的转基因例如报道基因，所说的调节区或其片段可以启动所有其细胞的转录，本发明还提供其一些细胞(不是所有的细胞)中携带转基因的动物，即镶嵌动物。转基因可以整合为一个单转基因或呈多联体，如头对头衔接或头对尾衔接。还可以如下将转基因有选择地引入特定类型的细胞中和在其中激活，例如按照Lasko等的教导(1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236)。当期望将转基因整合至内源相应基因的染色体位点时，优选基因寻靶。简单说，当使用这种技术时，设计含有一些与内源基因同源的核苷酸序列的载体，目的是通过所染色体序列的同源重组整合至其中并且破坏内源基因核苷酸序列的功能。
当产生转基因动物后，可以使用标准技术测定氯化筒箭毒碱调节区的转录活性。可以通过DNA印迹分析或PCR技术分析动物组织以测试转基因的整合是否发生来进行初筛选。还可以估价转基因动物组织中转基因的mRNA表达水平，所用的技术包括(但不限于此)动物组织样品的RNA印迹分析、原位杂交分析和RT-PCR。还可以使用特异于转基因产物的抗体，对表达转基因的组织的样品，进行免疫细胞化学评价。这种动物可以用作筛选氯化筒箭毒碱活性激活或抑制剂的体内系统。
本发明的可启动转录的氯化筒箭毒碱启动区及其片段可以用于各种目的，例如，获得组织特异性表达或降低调节基因表达。
可以将内源氯化筒箭毒碱启动区定向于特异性降低调节氯化筒箭毒碱基因的表达。例如，可以设计与调节区互补的寡核苷酸，并且传递至过量产生氯化筒箭毒碱的细胞中。这种寡核苷酸与调节序列退火，并且阻止转录的激活。另一种方式是，可以将调节序列或其部分传递至细胞中达到饱和浓度，以便对抗转录因子的结合。作为基因治疗方法的一般性综述，参见Goldspiel等，1993，临床药学12:488-505；Wu和Wu,1991，生物疗法3:87-95；Tolsroshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993，科学260:926-932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May,1993,TIBTECH11(5):155-215。可以使用的重组DNA技术的本领域公知方法描述于Ausubel等(eds.)1998，分子生物学的流行方案，John Wiley & Sons,NY；和Kriegler,1990，基因转移和表达，A Laboratory Manual,Stockton Press,NY。
在一个具体的实施方案中，将核酸直接体内引入靶细胞中。这里所说的“引入”是指施用给、或让其进入靶细胞。此可以通过本领域已知的任何方法来完成，如通过构建作为适宜的核酸表达载体一部分的核酸，并且将其引入以便其变成胞内物质，例如，通过使用缺损或减毒逆转录病毒或其它病毒载体进行感染(参见US专利4,980,286)；通过裸DNA的直接注射，通过使用微粒轰击(如基因枪，Bio1istic,Dupont)；通过用脂类或细胞表面受体或者转染剂包被；通过用脂质体、微粒或微囊封装；通过将其与已知可进入核的肽联合引入；或者通过将其与可受到受体介导的胞吞作用的配体联合引入(参见如Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:442-432)，其可以用于靶向特异表达受体的细胞类型。这里所说的“靶细胞”可以是有机体中的细胞或组织类型，或单细胞类型如生长在组织培养物上的单细胞。在另一个实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包含可破坏核内体的融合病毒肽，其允许核酸免受溶酶体降解。另一个实施方案中，通过靶向特异性受体，可以将核酸体内定向于细胞特异性摄取和表达(参见如PCT公开说明书WO92/06180,1992.4.16；WO92/22635,1992.12.23；WO 92/20316,1992.11.26；WO 93/14188,1993.7.22；WO 93/20221,1993.10.14)。或者，通过同源重组，可以细胞内引入核酸并且掺入在用于表达的宿主细胞DNA中(Koller和Smithies,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935；Zijlstra等，1989,Nature342:435-438)。
寡核苷酸可以含有至少一个修饰碱基部分，所说的修饰碱基部分选自以下组，包括(但不限于此)5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖苷queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、 3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖苷queosine、5N-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿啶、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
内源靶基因表达还可以通过使用定向同源重组使氯化筒箭毒碱调节区失活或“敲除”而降低(例如，参见Smithies等，1985,Nature 317:230-234；Thomas和Capecchi,1987,Cell 51:503-512；Thompson等，1989,Cell 5:313-321；各篇均整体引入这里作为参考)。例如，可以使用含部分、与氯化筒箭毒碱基因启动区同源的片段的DNA，其中含有或不含有选择标记，以转染细胞。通过定向同源重组，DNA构建体的插入可使氯化筒箭毒碱启动子失活。
或者，可以通过定向与靶基因调节区(即，靶基因启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列，形成阻止体内靶细胞中靶基因转录的三螺旋结构，来降低内源靶基因的表达。(参见，Helene,1991，抗癌药物描述，6(6):569-584；Helene等，1992,Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36和Maher,1992，生物测定14(12):807-815)。
用于形成抑制转录的三螺旋中的核酸分子应当是单链并且由脱氧核苷酸组成。该寡核苷酸的碱基组成必须设计成通过Hoogsteen碱基配对法则来促进三螺旋的形成，其通常要求在双螺旋中的一个链上必须存在嘌呤或嘧啶大小合适的链。核苷酸序列可以是以嘧啶为基础的，其将导致所得三螺旋体的三个相关链之间产生TAT和CGC三联体。这种富含嘧啶的分子提供与平行于该链的双螺旋中单链上富含嘌呤区互补的碱基。此外，可以选择富含嘌呤的核酸分子，例如，含有G残基的链。这些分子可与富含GC对的DNA双链形成三螺旋体，其中大部分嘌呤残基位于目标双链体的单链上，导致三联体中的三个链之间形成GGC三联体。
或者，可以通过创建所谓“之字形(switchback)”核酸分子，来增加可以定向于三螺旋结构形成的可能的序列。之字形分子以交替5’-3’、3’-5’的方式合成，以致它们首先与双链体的一个链，然后与另一个链进行碱基配对，取消了双螺旋中一个链上必须存在嘌呤或嘧啶大小合适的链的要求。
三螺旋分子可以通过核酸分子合成领域已知的任何方法来制备。这些方法包括本领域公知的化学合成寡核苷酸技术，例如，使用N-磷酸酯或亚磷酰胺化学方法(Froehler等，1986，核酸研究14:5399-5407；McBride等，1983,TetrahedronLett.,24:246-248)。
另外，可以使用肽核酸嵌合体来抑制特定基因的表达(Uhlmann,1998，生物化学379:1045)。
本发明的反义RNA和DNA分子以及三螺旋分子可以通过核酸分子合成领域的任何已知的方法来制备。这些方法包括本领域公知的化学合成寡脱氧核糖核苷酸技术，例如固相亚磷酰胺化学合成法。或者，可以通过体外或体内转录编码RNA分子的DNA序列，来产生RNA分子。可以将这种DNA分子掺入各种含有适宜RNA聚合酶启动子如T7或SP6聚合酶启动子的载体中。或者，可以将反义cDNA构建体稳定引入细胞系中，其中所说的构建体根据所用的启动子可组成性或诱导性合成反义RNA。
可以给DNA分子引入各种修饰，作为增加胞内稳定性和半衰期的一种方式。可能的修饰包括(但不限于此)给分子的5’和/或3’末端添加核糖核苷酸或脱氧核苷酸的侧翼序列，或者在寡脱氧核糖核苷酸主链内使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶键。
本发明促进转录的氯化筒箭毒碱启动区及其片段还可以用于获得靶基因的组织特异性表达。因此，可以设计针对这种调节序列的适宜治疗技术，以便调控靶基因的表达。本发明中，术语“调控”包括靶基因表达的抑制或增强，并且还包括靶基因的组织特异性抑制或增强。当细胞增生疾病与氯化筒箭毒碱基因产物的不足表达或过量表达有关时，可以使用诸如这里所述的小的有机分子或寡核苷酸基的化合物，包括反义寡核苷酸，来调控氯化筒箭毒碱基因的表达。这种与肌肉有关的病症可能包括癌症、肌营养不良、脊髓损伤、神经变性病症、创伤性损伤、充血阻塞性肺病(COPD)、艾滋病、恶病质(cachecia)或变老。根据本发明，本发明的氯化筒箭毒碱调节元件可以用于获得靶基因的肌肉特异性表达以促进肌肉生长和增加肌肉群来治疗肌肉相关性疾病。例如，当与肌肉有关的疾病是癌症时，可以使用在氯化筒箭毒碱基因启动子调节下的细胞毒性基因产物表达作为癌症的治疗。本领域技术人员可以通过本领域技术人员已知的许多方法来确定治疗中特定的疗程是否成功，包括肌肉纤维的分析或活组织检查。
本发明还包括使用氯化筒箭毒碱启动区来调控氯化筒箭毒碱基因的表达，作为动物食品的生产方法，其中所说的动物食品具有增加的肌肉或蛋白含量，和降低的脂肪和胆固醇含量。可以使用这里所述的有机分子或基于寡核苷酸的化合物来降低氯化筒箭毒碱基因产物的表达，其中所述的化合物可直接或间接调节氯化筒箭毒碱区的表达。可以给家畜动物或陪伴动物(具体说是猫和狗)施用这种有机分子，来达到动物中氯化筒箭毒碱表达的减少，由此达到比正常含量高的肌肉组织，优选不增加脂肪和/或胆固醇含量，其中所说的有机分子包括(但不限于此)可直接或间接调节氯化筒箭毒碱启动子表达的小的有机分子、或基于寡核苷酸的化合物，所说的家畜动物包括牛、绵羊、猪、火鸡、鸡和鱼。
通过PCR使用市售的鼠基因组文库试剂盒(GenomeWalker试剂盒，Clontech)克隆鼠的氯化筒箭毒碱启动子。用限制酶消化鼠基因组DNA，产生大的DNA片段并且将PCR衔接子连接到DNA片段的两个末端。使用正向引物作为原始引物和识别Clontech PCR衔接子的反向引物进行嵌套式PCR反应，其中所说的正向引物与接近所公开的氯化筒箭毒碱编码区5’末端的序列同源。接下来使用正向引物和第二个Clontech衔接子进行第二次PCR反应，其中所说的正向引物包括23个氯化筒箭毒碱未翻译前导序列的碱基。这些反应产生了包括5’未翻译氯化筒箭毒碱mRNA的23个碱基和启动子序列(1.8kb)的1792个碱基的产物。
随后，根据接近1.8kb启动序列5’末端的序列设计新的引物，并且使用GenomeWalker试剂盒进行第二次PCR反应。其产生了930bp PCR产物，该产物重叠了原1.8kb启动子的5’末端。当通过克隆入单片段将两个PCR产物合并时，获得了2482bp启动子片段(2.5kb)。
将1.8kb和2.5kb氯化筒箭毒碱启动子片段以及近氯化筒箭毒碱蛋白编码区的320bp和901bp附加亚克隆(subclones)放入pGL3基本载体(Promega)的多克隆位点中，所说的位点位于荧光素酶编码序列的5’端。在此载体中，荧光素酶基因缺乏启动子，由此受其上游克隆的任何启动子的控制。使用这些质粒载体来瞬时转染C2C12细胞，通过使用Fugene(Boehringer Mannheim)作为载体将质粒引入细胞中。细胞培养物在37℃、5％CO2下于LMEM中生长，并且使用市售的试剂盒(Promega荧光素酶测定系统，E150)测定荧光素酶活性。
对启动子的1.8kb、930bp和2482bp克隆进行测序。鼠氯化筒箭毒碱启动子的2482bp片段的核苷酸序列描绘于
图1A-B(SEQ ID NO.1)，其中核苷酸标记的2482是所公开的鼠氯化筒箭毒碱基因序列5’端的第一个碱基。
用于产生启动子1.8kb克隆的两个特异于所公开的氯化筒箭毒碱序列的引物是5’ACTGGGCCAGCAGCAATCAG 3’(SEQ ID NO.4)和5’GAGTAATGCCAAGTGAAATA 3’(SEQ ID NO.5)(嵌套引物)。
用于克隆930bp片段的两个特异于1.8kb启动子序列的引物是5’GCAGACACCCTGAGGTGATCTGGCCCTCT3’(SEQ ID NO.6)和5’TTTTCTGCATAGAATTCTTTTCGATGTC3’(SEQ ID NO.7)(嵌套引物)。
两种情况中，特异于连接的衔接子并且由Clontech提供的的两个引物是5’GTAATACGACTCACTATAGGGC 3’(SEQ ID NO.8)和5’ACTATAGGGCACGCGTGGT 3’(SEQ ID NO.9)。结果图2显示了瞬时转染测定中鼠氯化筒箭毒碱启动区的各种片段控制荧光素酶报道基因表达的能力。在各个实验中，C2C12细胞与第二载体共转染，所说的第二载体使用CMV启动子来组成型表达Renilla荧光素酶基因(pRL-CMV,Promega)。氯化筒箭毒碱启动子构建体所显出的值全部针对Renilla荧光素酶活性规一化。0.4kb启动子片段显出很小的转录活性，0.9kb片段具有35％2.5kb片段的活性，并且1.8kb片段具有39％2.5kb片段的活性。这些结果证明2.5kb是测试中最强的启动子。
GenBank的最初DNA同源性检索没有揭示与2.5kb氯化筒箭毒碱启动子序列同源的任何序列，证明了就申请人所知这是第一次鉴定鼠启动子序列。GenBank报导了猪氯化筒箭毒碱启动子的1673碱基序列(登记号AF093798,1998.10.4报导)。鼠和猪的启动子显出明显的同源性。当用鼠启动子序列对比猪的序列时，据鉴定高同源区为所公开的猪氯化筒箭毒碱启动子序列的第1537个碱基的5’端。具体说，在鼠启动子的2179-2482区中两个序列具有89％的同源性，相当于所公开的猪序列的第1232-1537碱基(图3)，并且在剩余的启动子序列中仍具有同源的区。然而，所保藏的猪氯化筒箭毒碱启动子序列仅有1673个碱基并且包括氯化筒箭毒碱基因的mRNA序列。其比鼠启动子的2482个碱基少，据证实该2482个碱基对体外基因表达的有效性是决定性的。这说明在体外表达实验中，鼠氯化筒箭毒碱启动子比猪氯化筒箭毒碱启动子使用起来是更有效的启动子。
将获得自ATCC的C2C12细胞，与氯化筒箭毒碱启动子-荧光素酶报道基因质粒和表达氨基葡萄糖磷酸转移酶的第二种质粒(pcDNA3,Invitrogen)共转染，其中所说的第二种质粒提供抗生素遗传霉素(G418)抗性。在800μg/ml的G418中选择C2C12细胞，挑取各个集落并且以低稀释度再涂布，并且通过在GH18中选择再分离各个集落。由这些集落建立的细胞系表达荧光素酶，并且选择具有最低数量氯化筒箭毒碱启动子荧光素酶报道基因引入拷贝的集落，用于高产量筛选。
为鉴定可调控氯化筒箭毒碱启动子活性的化合物，可以进行如下试验。将稳定转染的细胞涂布在96孔平板上，平板上使用适合细胞系的培养基。向细胞添加氯化筒箭毒碱基因表达的可能的抑制剂。通过测定由氯化筒箭毒碱启动子驱动的荧光素酶报道基因的反应，来确定氯化筒箭毒碱基因活化的抑制效果。该试验在高产量筛选方式中容易建立起来，用于评价可降低(或增加)荧光素酶活性的化合物文库。例如，将稳定转染有2.5kb启动子-荧光素酶报道基因构建体的C2C12细胞(ATCC#CRL-1772)以每孔3,000个细胞涂布在96孔组织培养基平板上，并且让其在DMEM、10％胎牛血清中37℃、5％CO2下生长18小时。然后加入测试化合物，让细胞生长另外48小时，并且通过在细胞培养物溶胞试剂(Promega)中冷冻和解冻，将细胞溶胞。通过向溶胞的细胞悬浮液添加荧光素酶试验底物和缓冲剂(Promega)，测定荧光素酶活性，并且使用Wallac 1450Microbeta计数器测定相对光单位。在测定细胞生存力的比色测定中使用四氮唑盐WST-1，测定测试化合物的细胞毒性。优选的化合物为可抑制氯化筒箭毒碱启动子荧光素酶报道基因构建体的表达，并且是非毒性的。使用裸DNA表达来表达肌特异性基因将具有肌特异性或组成性启动子的DNA质粒直接注射至肌肉中，导致基因在所说启动子的控制下表达。构建使用鼠2.5kb氯化筒箭毒碱启动子的载体，以便驱动猪生长激素释放激素(GHRH)的表达。当将该载体瞬时转染至C2C12肌肉细胞中时，可以在培养物上清液中测定到GHRH的表达，表达水平类似于使用CMV启动子时所发现的程度。根据本发明，可以通过直接注射裸DNA将构建体直接引入宿主中。
本发明不受示例性实施方案的限制，这些实施方案旨在举例说明本发明的某个方面，并且任何功能性等同的克隆、或核苷酸序列均属于本发明的范围。事实上，根据前面的描述和附图，除这里所描述以外的各种改进对本领域技术人员来说是显而易见的。这种改进将落入权利要求书的范围内。还应当了解所有对核苷酸而言的碱基对大小均是近似的，并且是用于描述的目的。
这里所提及的所有出版物均整体引入作为参考。
序列表<110>辉瑞产品公司<120>氯化筒箭毒碱调节区，核苷酸序列测定及其使用方法<130>PC10448A<140><141><160>9<170>PatentIn 2.1版<210>1<211>2482<212>DNA<213>小家鼠<400>1aaccttttta agtcctaagt cacacggagt tctatgtcct caaaatgttg ctcagcctct 60accctgtcta cccggatgat tttctctccc aaactgagag tctgtaaact attaagcatt 120aagtacacac acaccctgac cccagcgggc tccattctcc attctcccct gtgcttaaaa 180gaagctgccc tggagtttca gtgctattat cagaaagcag cagacagcac gggcagttaa 240aagcacaaga aagtaaataa catggtaata aataggcaaa ataaaagaaa ataaacaaac 300aaggaaataa ataaagggca tttgttcata aagtcagagc tgagtgaatg gctcaggctt 360tgccctgccc tgcccaagct cagtgggaaa tctgggtagc tggcaaacgc ctctgtcgtc 420gttattatta ttttgctggc aatctgaaac atgtaggtga gctcaattcc taggcctaat 480gagatgtcct tgcaggttgc ggaatccctt gccttcatct gaagcacttg aggataattt 540gaaagtaaaa ggcttgaaac aaagagcaag cccttctgct tcaagtatta attacctatg 600aaagggacta catttagcta cttatattgc taaattatat gcctcaaacc cctttagttg 660agaaactaaa gataagagaa gctaagtact gtgccgtctt tgtcatcgac ttagaagagg 720caaaattgag atttgaactc aggtttattt gactcttcag 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1620ccctggaagt ctgagtcaaa ctgaaataat gctccagcgc tacttacaaa aatccattat 1680ctactcggcc taagtacaga gcctggcctc ctcgctgaca ggattctgtt ggcaatcaaa 1740aaaaaaaaaa aaaaaaagca acactcagtc tttagtctgt atctctgtaa tagaaaatag 1800caatacttat aagctgaaat caagcacagg ttttatgtta gtcaaagcca ttaagctatc 1860aaaagtaaac ccatgtacac agaaacgtcc caggactggt ttgtaatatg tcctgacaaa 1920taagccatga aaacaagctc ctcaaattac tgatgcaact ttttagcagg gtcacaaact 1980cagctttctt taaattaagt cagctcttcc tagtttttac ttctctaatt acccagcact 2040taacgcatat tttttccctc aaatattagt tttagtaaca aaacagcact ccaagtctca 2100aaggattaac attttctatt ttaaacacaa aatctaaatt aaaaattact aacttaaatg 2160atagcaagag ttttacagag attaataagc tttaagtaca gtttatatta gtacacagac 2220ttcaatttat caaatgtcac atatatcttt catgatttgg ggatttattt catttatgaa 2280gtagtcaaat gaatcagctt gccctcgact gtaacaaaat gctgcttggt gacttgtgac 2340agacagggtt ttaacctctg acagcgagat tcattgtgga gcaggagcca atcatagatc 2400ctgacgacac ttgtctcctc taagttggaa tataaaaagc cacttggaat acagtataca 2460ggactccctg 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权利要求
1.一种分离的多核苷酸，含有SEQ ID NO.1从1至2482(2.5kb片段)的核苷酸序列或其启动转录的片段。
2.一种分离的多核苷酸，其在严格条件下与SEQ ID NO.1杂交并且当可操作地连接到编码序列中时能够启动所说编码序列的转录。
3.一种分离的多核苷酸，其在严格条件下与SEQ ID NO.3杂交并且当可操作地连接到肌肉细胞中的编码序列中时能够启动所说编码序列的转录，条件是所说的多核苷酸不是得自猪的基因组。
4.一种含有权利要求1、2或3所述多核苷酸的重细载体。
5.一种含有权利要求1、2或3所述多核苷酸的重组表达载体，其中多核苷酸的核苷酸序列被可操作地连接到编码序列上。
6.一种含有权利要求4或5所述载体的遗传改造的宿主细胞，或其后代。
7.权利要求6的宿主细胞，其中编码序列是报道基因。
8.权利要求7的宿主细胞，其中报道基因是荧光素酶。
9.一种氯化筒箭毒碱启动区表达抑制剂的筛选方法，包括(a)用测试化合物处理权利要求7的宿主细胞；并且(b)检测报道基因在氯化筒箭毒碱启动子区域控制下表达的降低。
10.一种氯化筒箭毒碱启动子区域表达激活剂的筛选方法，包括(a)用测试化合物处理权利要求7的宿主细胞；并且(b)检测报道基因在氯化筒箭毒碱启动子区域控制下表达的增加。
11.权利要求9或10的方法，其中报道基因是荧光素酶。
12.权利要求9或10的方法，其中氯化筒箭毒碱启动子是鼠氯化筒箭毒碱启动子。
13.一种调节氯化筒箭毒碱基因表达的方法，包括给靶细胞施用治疗有效量的根据权利要求9方法的氯化筒箭毒碱启动区抑制剂或根据权利要求10方法的氯化筒箭毒碱启动区激活剂。
14.一种抑制氯化筒箭毒碱基因表达的方法，包括将治疗有效量的可直接或间接抑制权利要求1所述多核苷酸转录活性的抑制剂引入靶细胞中。
15.一种抑制氯化筒箭毒碱基因表达的方法，包括将与权利要求1所述多核苷酸同源的多核苷酸片段通过同源重组引入靶细胞中，其中该片段抑制权利要求1所述多核苷酸的转录活性。
16.一种治疗生物体神经肌肉性疾病的方法，包括将治疗有效量的可抑制权利要求1所述多核苷酸转录活性或表达的抑制剂引入靶细胞中。
17.一种治疗生物体癌症的方法，包括将治疗有效量的可抑制权利要求1所述多核苷酸转录活性或表达的抑制剂引入靶细胞中。
18.一种治疗生物体变老的方法，包括将治疗有效量的可抑制权利要求1所述多核苷酸转录活性或表达的抑制剂引入靶细胞中。
19.一种促进生物体肌肉生长的方法，包括将治疗有效量的可抑制权利要求1所述多核苷酸转录活性或表达的抑制剂引入靶细胞中。
20.一种促进生物体体重增加的方法，包括将治疗有效量的可抑制权利要求1所述多核苷酸转录活性或表达的抑制剂引入靶细胞中。
21.权利要求15、16、17、18、19或20的方法，其中生物体选自人、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、鸡、鱼、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、小型猪、山羊、和非人类的灵长目动物，包括狒狒、猴子和黑猩猩。
22.一种增加食用动物瘦肉量的方法，包括给所说的食用动物施用有效量的可抑制权利要求1所述多核苷酸转录活性的抑制剂。
23.权利要求22的方法，其中食用动物选自牛、绵羊、猪、鸡、鱼和山羊。
24.一种构建转基因动物的方法，包括将权利要求4或5所述的表达载体引入胚胎细胞或其它宿主细胞中。
25.权利要求24的转基因动物，其中转基因的表达被以组织特异性的方式调节。
26.一种以组织特异性方式在动物中表达异源基因的方法，包括将权利要求5所述的表达载体引入所说的动物中。
27.一种鉴定可调控氯化筒箭毒碱启动子活性和氯化筒箭毒碱基因表达的化合物的方法，其中该方法包括将化合物施用给在氯化筒箭毒碱启动子或其转录活性片段的控制下表达基因的细胞；测定基因表达或基因产物活性的水平；并且将此水平与在缺少化合物的情况下由细胞产生的基因表达或基因产物活性的水平相比较，其中如果在化合物的存在下所获得的水平不同于缺少其时所获得的水平，则能够调控氯化筒箭毒碱基因表达或启动子活性的化合物被鉴定。
28.权利要求27的方法，其中细胞是权利要求6所述的宿主细胞。
全文摘要
本发明涉及氯化筒箭毒碱基因的转录调节区。具体说,本发明涉及紧靠氯化筒箭毒碱编码序列5’端的2.5kb多核苷酸、其核苷酸序列以及使用该调节区的方法、以及其片段。本发明涉及使用本发明的氯化筒箭毒碱启动子,指导以组织特异性的方式即肌肉组织表达靶基因。本发明涉及本发明氯化筒箭毒碱启动子在高产量筛选中的用途,以便鉴定抑制氯化筒箭毒碱启动子活性或氯化筒箭毒碱表达的试验化合物。根据本发明,氯化筒箭毒碱启动子的抑制剂可以用来抑制氯化筒箭毒碱的表达,作为改造出瘦肉增加动物的方法,以便减少动物可以去被屠宰所需要的时间;和促进肌肉生长以便治疗与氯化筒箭毒碱基因表达有关的疾病,例如人和陪伴动物特别是猫和狗中与变老或生病有关的肌肉萎缩。
文档编号C12N5/02GK1312372SQ00126399
公开日2001年9月12日 申请日期2000年7月28日 优先权日1999年7月30日
发明者R·C·芬德利 申请人:辉瑞产品公司