靶物质的制备方法

专利名称：靶物质的制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵工业，更具体的说，是赋予原本不会利用甲醇的微生物能够利用甲醇的能力，或者将甲醇利用能力低的微生物的甲醇利用能力提高的技术，以及用上述技术所获得的微生物利用甲醇生产靶物质的方法。
根据本发明生产的物质包括通常由微生物产生的L氨基酸，核酸，抗生素，维生素，生长因子，生理活性因子等等。
甲醇易溶于水，价廉，能以高纯度获得。而且可以比较简单地从天然气的主要成分甲烷制得。所以甲醇就成为了物质生产中很具吸引力的原料。如果将甲醇作为微生物发酵的原料，不仅主要原料的成本可以降低，而且发酵液中产品的纯化和废液处理过程都可以得到简化。所以，可以降低总生产成本。
作为以甲醇为原料利用微生物生产物质，特别是氨基酸的方法，已知的有利用无色细菌(Achromobacter)属或假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物的方法(Japanese Patent Publication(Kokoku)No.45-25273)，利用精朊杆菌属(Protaminobacer)或甲烷单胞菌属(Methanomonas)微生物的方法(JapanesePatent Laid-open Publication(kokai)No.50-25790)，利用甲基芽孢杆菌属(Methylobacillus)微生物的方法(Japanese Patent Laid-open Publication(Kokai)No.4-91793)，利用属于芽孢杆菌属(Bacillus)的甲基营养菌的方法(JapanesePatent Laid-opean Publication No.3-505284，U.S.Patent No.6,083,728)等等。但是，所有这些细菌菌株都不能作为高产氨基酸的实用菌株。
同时，利用短芽孢杆菌属(Brevibacterium)，棒杆菌属(Corynebacterium)，芽孢杆菌属(Bacillus)或者埃希氏菌属(Escherichia)构成了从葡萄糖生产氨基酸的方法中的主流(“Amino Acid Fermentation”，Ed.by H.Aida et al.GakkaiShuppan Center)。为获得氨基酸的最大产量，这些氨基酸生产菌株是从其被发现开始，在长期的育种实践中通过引入大量的突变而培育出的宝贵菌株。但是，这些工业菌株是不能利用甲醇的微生物。
为达到前述目的，本发明者进行了潜心研究。结果发现通过向微生物中导入甲醇脱氢酶基因并且提高微生物己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖异构酶(phosphohexuloisomerase)的活性，就可以赋予微生物利用甲醇的能力，或提高微生物利用甲醇的能力。这样，就完成了本发明。
即，本发明提供下述(1)一种利用微生物生产靶物质的方法，其包括在培养基中培养具有产生靶物质能力的微生物，以产生并在培养基中或微生物细胞中积累靶物质，再从培养基或微生物细胞中收集靶物质，所述的微生物中引入了甲醇脱氢酶基因并且经修饰使己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖异构酶活性得以提高，进而被赋予或提高了利用甲醇的能力，培养基中含有甲醇作为碳源。
(2)根据(1)的方法，其中靶物质是L-氨基酸。
(3)根据(2)的方法，其中L-氨基酸是L-赖氨酸。
(4)根据(3)的方法，其中微生物是芽孢杆菌(Bacillus)属细菌。
(5)一种导入了甲醇脱氢酶基因的微生物，其中该微生物经修饰使己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖异构酶(phosphohexuloisomerase)得以提高，从而被赋予或提高了利用甲醇的能力。
(6)根据(5)的微生物，其为革兰氏阳性细菌。
(7)根据(6)的微生物，其为芽孢杆菌属细菌。
(8)根据(7)的微生物，其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
根据本发明，可以赋予原本不能利用甲醇的微生物利用甲醇的能力，或者使利用甲醇能力较低的微生物该能力得以提高，这样，就可以提供一种微生物，其可以利用廉价的甲醇作为碳源或微生物可以利用的能源。更进一步，利用所获的微生物，可以在加入了甲醇的培养基中获得从甲醇产生的各种发酵产物。
本发明的微生物是导入了甲醇脱氢酶基因的微生物，并且经过修饰使其中的己酮糖磷酸合成酶口磷酸己酮糖异构酶的活性得以提高，并赋予或提高了利用甲醇的能力。尽管用于构建本发明微生物的亲本菌株可以是原本甲醇利用能力很微弱的微生物，但是优选使用原本利用糖而不能利用甲醇的微生物。
可以利用甲醇的微生物具有甲醇氧化酶(如甲醇脱氢酶)，并且其通过精确的代谢调节而异化或同化由甲醇氧化而产生的甲醛。这是因为甲醛对于有机体的毒性更大，所以细胞必须快速地将其作为碳源或能源而利用掉，或通过解毒而处理掉。所以，如果要赋予不能利用甲醇的微生物利用甲醇的能力，当然必需导入甲醇氧化酶。但是，适当处理由于甲醇氧化酶活性表达而产生的甲醛的特异性方法很少，所以人们认为不可能赋予任意微生物利用甲醇的能力。
但是，本发明的发明者发现如果使一种具有甲醇氧化能力的酶存在于微生物的细胞中，并且使该微生物的己酮糖磷酸合成酶活性以及磷酸己酮糖异构酶活性提高，则可以赋予原本不能利用甲醇的微生物利用甲醇的能力。
本发明所用的微生物没有特别限制，只要能够赋予本发明的微生物前述的属性特征，可以特别提及的有芽孢杆菌属(Bacillus)细菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，埃希氏菌属细菌(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)，棒状细菌如乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacteriumglutamicum))，沙雷氏菌属(Serratia)细菌如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)等等。其中，优选革兰氏阳性细菌，特别是芽孢杆菌属细菌。
特别地，当L-苏氨酸作为发酵产物时，需要提及大肠杆菌VKPM B-3996(RIA 1867，参见U.S.Patent No.5,175,107)，嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynbacteriumacetoacidophilum)AJ12318(FERM BP-1172，参见U.S.Patent No.5,188,949)等；同样，当L-赖氨酸作为发酵产物时，要提及的是枯草芽孢杆菌AJ11779(FERMP-18453)，枯草芽孢杆菌AJ13291(FERMP-6722，参见Japanese PatentLaid-open Publication No.59-63193)，大肠杆菌AJ11442(NRRL B-12185，FERMBP-1543，参见US.Patent No.4,346,170)，大肠杆菌W3110(tyrA)(该菌株可通过从大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERMBP-3653)中去除质粒pHATerm而获得，参见International Patent Publication WO95/16042)，乳发酵短杆菌AJ12435 (FERM BP-2294，U.S.Patent No.5,304,476)，乳发酵短杆菌AJ3990(ATCC 31269，参见US.Patent No.4,066,501)等；当L-谷氨酸作为发酵产物时要提及的是，大肠杆菌AJ12624 FERM BP-3853，参见French Patent Laid-openPublication No.2,680,178)，乳发酵短杆菌AJ12821(FERM BP-4172，JapanesePatent Laid-open Publication No.5-26811，French Patent Laid-open PublicationNo.2,701,489)，乳发酵短杆菌AJ12475(FERM BP-2922，参见U.S.Patent No.5,272,067)，乳发酵短杆菌AJ13029(FERM BP-5189，参见International PatentPublication JP95/01586)等；当L-亮氨酸作为发酵产物时要提及的是，大肠杆菌AJ11478(FERM P-5274，参见Japanese Patent Publication No.62-34397)，乳发酵短杆菌AJ3718(FERM P-2516，参见U.S.Patent No.3,970,519)等；当L-异亮氨酸时要提及的是，大肠杆菌KX141(VKPM B-4781，参见EuropeanPatent Laid-open Publication No.519,113)，黄色短芽孢杆菌AJ12149(FERMBP-749，参见U.S.Patent No.4,656,135)等；当L-缬氨酸时要提及的是，大肠杆菌VL1970(VKPM B-4411，参见European Patent Laid-open Publication No.519,113)，乳发酵短杆菌AJ12341(FERM BP-1763，参见U.S.Patent No.5,188,948)等；当L-苯丙氨酸时要提及的是，枯草芽孢杆菌AJ12000(FERMP-6895，参见Japanese Patent Laid-open Publication No.59-143596)，大肠杆菌AJ12604(FERM BP-3579，参见Japanese Patent Laid-open Publication No.5-236947，European Patent Laid-open Publication No.488,424)，乳发酵短杆菌AJ12637(FERM BP-4160，参见French Patent Laid-open Publication No.2,686,898)等；当L-色氨酸时要提及的是，枯草芽孢杆菌AJ11488(FERM P-5290，参见Japanese Patent No.1426798)，大肠杆菌KB862(DSM7196，参见European Patent No.662,143)等等。
仔细研究的结果，本发明的发明者设想在细胞中使甲醇脱氢酶活性的充分发挥，并提高同化由酶反应而产生的甲醛的能力，作为基本条件赋予利用甲醇的能力。本发明的发明者还进一步设想提高核酮糖单磷酸途径的关键酶己酮糖磷酸合成酶(HPS)和磷酸己酮糖异构酶(PHI)的酶活性，对于有效的同化甲醛很有作用。这样，他们发现通过向原本不能利用甲醇的微生物中导入甲醇脱氢酶基因并且提高HPS和PHI的活性，赋予该微生物利用甲醇的能力。
本发明所用的甲醇脱氢酶(MDH)是具有可氧化甲醇使之转化为甲醛的酶活性的酶。例如，PQQ(pyrroloquinolinequinone)依赖型MDH，其主要见于革兰氏阴性微生物，可作为用于本发明的MDH。特别要提及的是，扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)AMl菌株的MDH(Biochim.Biophys.Acta，111997-106(1992))等。进一步的，见于革兰氏阳性微生物的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)依赖型MDH，特别要提及的是甲醇芽孢杆菌(Bacillusmethanoliocus)的MDH(J.Bacteriol.，1745346-5353(1992))，来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DSM 2334菌株的醇脱氢酶(ADH)(Biochem.J.，252661-666)等。此外可提到的是，牛肝脏(Biochem.J.，10034-46(1996))和人肝脏(Arch.Toxico1.，72604-607(1998))的ADH。进一步的，可通过向原本不对甲醇起作用的醇脱氢酶基因中引入突变来修饰其底物特异性，从而新创造出明显对甲醇也起作用的突变型醇脱氢酶，并进行了使用。但是，作为本发明适用的MDH，可以特别提及的是来自例如，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)NCIMB No.12524，该菌株是属于芽孢杆菌属的甲醇同化细菌。
编码MDH(mdh)的基因可以通过常规的基因克隆方法由产生MDH的微生物获得。例如，MDH基因可通过使用短芽孢杆菌S1菌株(NCIMB 12524)染色体DNA作为模板，以具有SEQ ID NO1和2所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行的PCR(聚合酶链式反应)而制得。用于基因克隆，杂交，PCR，质粒DNA的制备，DNA的消化和连接，转化等所用的染色体DNA文库的制备方法在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1.21(1989)中描述。另外，导入了MDH基因的微生物中该基因是否具有功能可以通过测定微生物的溶菌产物中MDH活性而确定。可通过例如，通过测定340nm波长下光吸收测定伴随甲醇氧化成甲醛过程中NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的还原来测定MDH的活性。
作为本发明所用的mdh基因的一个特别实施例可提到的是，短芽孢杆菌S1菌株的mdh基因。甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanoliocus)C1菌株的mdh基因(NCIMB13114，Em.J.Biochem.，244426-433(1997))已经登记在GenBank，其登记号为M65004(BACMDH的登录号)。
另外，还有报道，存在激活甲醇脱氢酶活性的因子(Amd甲醇脱氢酶激活剂)。例如，存在甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanoliocus)C1菌株的甲醇脱氢酶(Eur.J.Biochem.，244426-433(1997))和枯草芽孢杆菌168菌株的YqkG基因产物的激活剂(Japanese Patent Laid-open Publication No.2000-69976)。使用这些都是提高MDH活性的有效方法。通过向含有MDH基因的微生物中导入编码这些MDH激活剂中任一种的DNA，可以提高这些微生物细胞中MDH活性。编码Amd(amd)的基因，如YqkG基因可以利用枯草芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌168菌株的染色体DNA作为模板，具有序列表中SEQ ID NO10和11所示核苷酸序列作为引物，通过PCR获得。
作为本发明所用yqkG的特别实施例，应该提及枯草芽孢杆菌168菌株的YqkG基因。该基因的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO14和15所示。
提高微生物HPS和PHI活性的方法将在下述说明。
为在靶微生物中增强HPS或PHI的活性，可以将编码HPS(hps)或PHI(phi)的基因与在靶微生物中具有功能的载体，优选多拷贝型载体相连接，而制备得到重组DNA，并将其导入靶微生物进行转化。从而，增加该转化菌株的细胞中hps或phi基因的拷贝数，结果，这两个酶中之一的酶活性得以增强。
象MDH基因一样，所述的hps或phi基因可采用常规的基因克隆方法从生产HPS或PHI的微生物中得到。
作为生产HPS的微生物，已知荚膜甲基球菌(Methylomonas capsulatus)(J.R.Quayle，Methods in Enzemology，188，p.314，1990)，甲基单胞菌M15菌株(Methods in Enzymology，188，p.319，1990)，Methylomonas aminofaciens77a菌株(Biochim.Biophys.Acta.，523，p.236，1978)，胃分枝杆菌(Mycobacteriumgastri)MB19(Methods in Enzymology，188，p.393，1990)，甲醇醋杆菌(Acetobacter methanolicus)MB58(Methods in Enzymology，188，p.401，1990)等等。进一步的，作为生产PHI的微生物，已知Methylomonas aminofaciens 77a菌株(Agric.Biol.Chem.，41(7)，p1133，1977)，革兰氏阳性兼性甲醇同化细菌的胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)(Japanese Patent Laid-open PublicationNo.11-127869)等。进一步，已报道了枯草芽孢杆菌的hps和phi基因(J.Bacteriol.，1817145-7160(1999))。而且，还有报道说在短芽孢杆菌S1菌株中，该菌株是属于芽孢杆菌属的甲醇同化细菌，hps基因和phi基因是串联在DNA染色体上(Annual Meeting of the Society for Fermentation andBioengineering Japan，Lecture Abstracts，p.113(2000))。含有hps和phi基因的DNA片段可利用该菌株的染色体DNA作为模板，具有SEQ ID NO12和13所示核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR制备。
作为本发明所用hps基因和phi基因的一个特别实施例，应该提及枯草芽孢杆菌168菌株的hps基因和phi基因。含有短芽孢杆菌S1菌株的hps基因和phi基因的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO16所示。该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NOS17和18所示。
甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanoliocus)C1菌株(NCIMB 13114)和短芽孢杆菌S1菌株(NCIMB 12524)可以从国立工业和海洋微生物保藏有限公司(National Collections of Industrial and Marine Bacteria)，地址NCIMB Lts.，TorryResearch Station135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)获得。
HPS的活性可以通过Methods in Enzymology，188，397401(1990)中所描述的方法进行测定。进一步的，PHI活性可通过Journal of Bacteriology，181，p.7154-7160(1999)中所描述的方法测定。
也可以通过向靶微生物的染色体DNA中导入多拷贝的hps基因或phi基因实现HPS或PHI活性的增强。为向靶微生物的染色体DNA中导入多拷贝hps基因或phi基因，可用染色体DNA中以多拷贝存在的序列作为靶位进行同源重组。对于在染色体DNA中以多拷贝存在的序列，可以使用重复DNA或存在于转座元件末端的倒转重复。进一步的，如在Japanese Patent Laid-openPublication No.2-109985中所公开的，还可以将hps基因或phi基因整合到转座子中，并允许其转移，将所述的多拷贝基因导入到染色体DNA中。根据这些方法中的任一种，都可以使转化株中hps基因或phi基因的拷贝数增多，从而使HPS或PHI活性增强。
除基于前述的基因扩增方法之外，还可通过替换表达调节序列使HPS或PHI活性的增强，如用更强的启动子替代hps基因或phi基因的启动子(参见Japanese Patent Laid-open Publication No.1-215280)。例如，lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体的PR启动子和PL启动子，tet启动子，amyE启动子，veg启动子等等已知的强启动子。这些启动子的替换提高了hps基因或phi基因的表达，从而使HPS或PHI活性。表达调节序列的增强可与HPS或PHI的拷贝数量的增加相结合。
本发明所用mdh，hps，phi和amd基因并不限于野生型基因，可以是突变体或编码基因产物的人工修饰基因，这些修饰包括一个或几个氨基酸在一个或几个位点的替换，缺失，插入，添加或倒转，只要被编码的MDH，HPS，PHI或Amd蛋白功能不退化即可。尽管“几个”所表示的氨基酸的数目在此根据氨基酸在蛋白的三维结构中位置或类型的不同而不同，但可以是2-20个，优选2-10个，更优选2-5个。
编码实质上与前述Amd蛋白相同的蛋白的DNA，可提及的是能与包含SEQ ID NO16的1-555位的核苷酸的序列，或由该核苷酸制备的探针在严紧条件下杂交，并且编码具有Amd类似活性的蛋白的DNA。
进一步，作为编码实质上与HPS蛋白相同的蛋白的DNA，可提及的是可以与包含SEQ ID NO16 508-1140位核苷酸的序列或由该核苷酸序列产生的探针在严紧条件下杂交的，且编码具有HPS类似活性的蛋白的DNA。
进一步，作为编码实质上与PHI蛋白相同的蛋白的DNA，可提及的是可以与包含SEQ ID NO16 1149-1700位核苷酸的序列，或由该核苷酸产生的探针在严紧条件下杂交的，且编码具有HPI类似活性的蛋白的DNA。
进一步，作为编码实质上与MDH蛋白相同的蛋白的DNA，可提及的是可以与GenBank中登记的号码为M65004(BACMDH的登录号)的核苷酸序列或由该核苷酸产生的探针在严紧条件下杂交的，编码具有MDH类似活性的蛋白的DNA。
前述“严紧条件下”是指一种条件，在该条件下，所谓的特异性杂交进行而非特异性杂交不能进行。使用任何数值很难清楚的表达这个条件。但是，严紧条件可通过举例说明，例如某条件，在该条件下，具有高同源性如50％或更高的DNA相互之间杂交，但是同源性低于上述的DNA则不能互相杂交。可选择的，严紧条件还可以通过举例说明，在某条件下，DNA可以在盐浓度相应于通常的Southern杂交洗涤条件下相互杂交，该条件即60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS。
为向微生物中导入上述制备的各种基因，可利用已知的方法，例如对于大肠杆菌K-12(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，可用氯化钙处理受体细胞以提高DNA的渗透率的方法，对于枯草芽孢杆菌，可从生长期的细胞制备感受态细胞，再将DNA导入其中的方法(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F. E.Gene，1，153(1997))。除此之外，还可以先将DNA-受体细胞制成易于吸收DNA的原生质体或原生质球，然后再将重组DNA导入细胞，已知其可用于枯草芽孢杆菌，放线菌或酵母(Chang，S.andChoen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。另外还可以使用电穿孔方法(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。可以根据所用受体的细胞从这些方法中选择出合适的方法。
本发明所用微生物，根据靶物质的不同类型，可以提高靶物质的生物合成中相关的酶活性。另外还可以减少或消除不利于靶物质生产的酶活性。
当所需的mdh，hps，phi基因和amd基因导入微生物时，这些基因的导入顺序并没有特别限制。进一步的，本发明的微生物可以通过导入这些基因到能够产生靶物质的微生物中而得到，或者通过赋予导入了这些基因的微生物产生靶物质的能力而得到。
使用甲醇产生靶物质可以通过下述方式进行，在培养基中培养如上所述得到的本发明微生物，使其生产并在培养基或微生物的细胞中累积靶物质，再从培养基中或微生物中收集靶物质。
本发明的方法适用的靶物质包括，例如，甲醇代谢产生的物质，和使用甲醇代谢产生的能量而产生的物质。特别该提及的是例如，氨基酸如谷氨酸，赖氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和色氨酸，维生素如维生素C，大分子物质如各种酶等。
本发明所用术语“产生靶物质的能力”指本发明的微生物在在合适的条件下在培养基中培养时，能够产生并在培养基或微生物细胞中积累靶物质至可从中收集该靶物质的量。
尽管本发明的培养方法中所用的培养基和培养条件可跟据所用微生物的类型而进行合适的选择，通常可使用含有氮源，无机离子和其它所需的痕量有机营养素的常规培养基。
使用甲醇作为碳源。与甲醇一起，可以使用的糖如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖和淀粉水解物，醇如甘油和山梨醇，或有机酸如延胡索酸，柠檬酸和琥珀酸。
作为氮源，可以使用无机铵盐如硫酸铵，氯化铵和磷酸铵，有机氮如大豆蛋白水解物，氨气，液体氨等。
作为无机离子或其来源，加入少量的磷酸钾，硫酸镁，铁离子，锰离子等等。作为痕量的有机营养素，需要加入合适数量的所需物质如L-高丝氨酸和维生素B1，酵母提取物等等。
培养优选在适于所用微生物的条件下进行。通常，培养优选在有氧条件下进行16-72小时。培养温度优选控制在20℃到45℃，培养中pH优选控制在5-8.5。无机或有机，酸或碱性物质以及氨气等等可用作调节PH。如果使用嗜热细菌作为宿主，可以在42℃到60℃的培养温度下培养。
培养结束后从培养基中收集代谢产物，本发明不需要任何特别的方法。即是说，可通过结合各种公知的技术来进行，如使用离子交换树脂的方法，沉淀和其它技术。另外，与使用农业产品来源的糖相比当使用甲醇作为碳源时，靶物质的纯化和废液的处理过程可以简化。
所用的DNA引物为MDH-BM-1(SEQ ID NO1)和MDH-BM-2(SEQ IDNO2)。其通过参见已知的甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanoliocus)C1菌株的MDH基因核苷酸序列制备(登记在GenBank中，登记号M65004，BACMDH的登录名)。使用LA-Taq(Takara Shuzo)进行PCR，94℃ 90秒，98℃反应10秒，55℃30秒，70℃4分钟，重复30个循环，然后再在72℃孵育10分钟。通过这些反应得到所期望长度的DNA片段。该DNA片段被纯化后克隆到可商购的载体pCR2.1中，得到pCR-mdh24-1。
为向枯草芽孢杆菌染色体中导入含于前述的pCR-mdh24-1中的mdh基因，将mdh基因掺入到用于将该基因导入到染色体的载体，质粒pDLT3中。pDLT3质粒的制备是通过常规DNA重组技术，将靶基因导入到枯草芽孢杆菌染色体amyE位点，其全部核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
pDLT3按下述制备(

图1)。首先，为去除pMUTIN3中lacZ基因片段(MolecularMicrobiology中描述，29(1)，179-187(1998))，用限制性酶ClaI和Bpu1102I消化质粒。然后消化的末端用Klenow酶处理成平头末端，然后较大的DNA片段使用T4连接酶自连。然后，pDLd(Molecular Microbiology中描述，29(2)，505-513(1998))也类似的由限制性酶消化，分离出较大的DNA片段(Tth11I-BamHI)。含有lacI和spac启动子的质粒Tth11I-BamHI DNA片段与上述较大的DNA片段连接来构建pDLT3。
以常规手段，用限制性酶BamHI和EcoRI处理质粒pDLT3，制备较大DNA片段。分别地，用限制性酶BamHI和EcoRI以同样手段类似地处理PCR-mdh24-1来制备含有mdh基因的DNA片段。使用T4连接酶连接这两个DNA片段来构建质粒Pdlt-MD11，其中mdh基因被并入到pDLT3的amyE基因的第一个半区和第二个半区之间。
所获的环状质粒，pDLT-MD11和pDLT3，通过用限制性酶Bst1107I处理而线性化，然后将这些质粒通过常规方式分别转化枯草芽孢杆菌168菌株。选择具有氯霉素抗性的转化株。由于每种情况都可以得到很多氯霉素抗性株，因此仅从每种情况中选出6个克隆，然后研究是否只有mah基因或载体如所预期导入了染色体的amyE位点。通过菌落PCR来证实是否线性化的mdh基因通过两次重组过程而被导入。所用的DNA引物是N1，N2，N3，C1，C2，和C3(按该顺序分别是SEQ ID NOS4，5，6，7，8和9)。根据PCR扩增的DNA片段的分析结果，选择了AM101菌株，其具有掺入到所期望区域的mdh基因结构。另一方面，选出掺入了载体区域的菌株作为对照菌株，并命名为DT101菌株。
然后，使用DT101菌株作为对照测定AM101菌株中表达的MDH活性。两种菌株都接种到30ml含有5μg/ml氯霉素的LB培养基中并在30℃培养约16小时。离心培养的肉汤(10,000g，10分钟)来收集沉淀的细胞，然后在0.8ml悬浮缓冲液中重悬细胞(组份每10ml中5ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.6)，1mml 50mM硫酸镁，0.1ml 0.2M二硫苏糖醇，3.3ml 60％蔗糖和0.6ml无菌水)，并维持悬液温度在低于4℃的温度下，超声波破碎细胞。然后在4℃离心(17000g，10分钟)去除悬浮液中的固体，制备细胞提取物。
按下述测定MDH酶活性。首先，将0.9ml反应缓冲液(每20ml中10ml0.1M甘油/氢氧化钾(pH9.5)，2ml 50mM硫酸镁，0.1ml 0.2M二硫苏糖醇，0.5ml40mM NAD，7.4ml无菌水)加入到1.5-ml体积的石英比色杯中，将比色杯置于分光光度计中。分光计中，反应混合物的孵育温度控制在47℃ 3分钟。然后，50μl所述方法制备的细胞提取物加入到反应混合物中并充分搅拌。同时，在340nm下，开始测定反应混合物的光吸收，在340nm下NADH具有最大的光吸收，来研究不存在甲醇的条件下光吸收的变化。进一步的，约60秒后，向反应混合物中加入50μl甲醇并充分搅拌，然后观察并记录340nm下光吸收的增加，即产生的NADH。当使用对照菌株DT101的细胞提取物时，未观察到MDH引起的340nm光吸收增加。但是，当使用菌株AM101的细胞提取物时，在340nm下观察到依赖于甲醇加入量的光吸收增加，并且被证实MDH应该存在于该菌株中。这样，发现掺入到枯草芽孢杆菌染色体中的的mdh基因编码可以显示出酶活性的MDH酶。NAD和NADH分别代表氧化型和还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。实施例2mdh掺入到枯草芽孢杆菌L-赖氨酸产生菌株的染色体中被修饰为能够产生L-赖氨酸的枯草芽孢杆菌AJ11779菌株是JapanesePatent Laid-open Pubication No.5 8-149689中描述的一个菌株。通过赋予该生物对由AEC引起的生长抑制的抗性而赋予其L-赖氨酸生产能力，AEC是赖氨酸类似化合物和苏氨酸。该菌株于2001年9月9日保藏在独立管理机构，国立高级工业科学技术研究院，国际专利生物保藏(independent administrativeinstitution，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，Intemational Patent Organism Depoisitory)(地址邮编305-5466，Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，其登记号为FERM P-18453。然后，该保藏根据布达佩斯条约下，在2002年8月19日改为国际保藏，登记号为FERM BP-8155。
计划将实施例1中描述的mdh基因掺入到AJ11779菌株染色体中amyE位点。首先，环状质粒pDLT-MD11用限制性酶Bst1107I处理而线性化，再通过常规手段转化到AJ11779菌株中。选择具有氯霉素抗性的转化株。
由于可以得到许多氯霉素抗性菌株，从中选择2或更多菌落，按与实施例1中相同的方式选择出在染色体amyE位点掺入了mdh基因的菌株。所获菌株命名为L-217M1菌株。
从该L-217M1菌株制备细胞提取物并按与实施例1相同的方式测定MDH活性。结果可以检测到MDH的活性。实施例3编码来源于枯草芽孢杆菌的MDH激活剂基因的克隆已知存在来源于芽孢杆菌属的甲醇-同化细菌的NAD依赖型甲醇脱氢酶的酶活性激活因子。Japanese Patent Laid-open Publication No.2000-69976(OP884)公开了一种存在于枯草芽孢杆菌中的这类因子。该因子被命名为Amd(甲醇脱氢酶激活剂)。
编码Amd(amd)的基因通过已知方法从枯草芽孢杆菌中克隆出来。特别地，该克隆按下述进行。在LB培养基中培养枯草芽孢杆菌168菌株，从所获的细胞中用常规方法提取染色体DNA(Biochem.Biophys.Acta.，72，619-629(1963))。该染色体DNA在PCR中用作模板，用可使靶DNA片段两端具有EcoRI限制性酶位点(SEQ ID NO10和11)的寡核苷酸来扩增含有靶基因amd的DNA片段。扩增的步骤为在98℃变性10秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，该过程重复30个循环。所用的酶是Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)，依据使用说明进行使用。
通过苯酚/氯仿处理并用乙醇沉淀来纯化扩增的DNA片段，然后再用限制性酶EcoRI消化，来制备在两端都具有EcoRI位点的amd片段。另外，用限制性酶EcoRI对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的穿梭载体pHY300PLK(TakaraShuzo)，进行类似的处理。使用碱性磷酸酶去除末端的磷酸基团后，与前述amd片段相连。用上述连接反应混合物根据操作手册转化大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo)的感受态细胞，选出几个四环素抗性菌落。
从这些菌落中提取质粒DNA并分析其结构。然后，含有，与载体上的四环素抗性基因相同以及相反方向存在的amd基因的质粒分别命名为pHY-A2和pHY-A1，用于下述实验。
提高MDH活性的Amd活性按下述测定。如实施例1中构建的掺入了mdh基因的枯草芽孢杆菌AM101菌株通过常规方法用pHY-A2和pHY-A1以及pHY300PLK转化，后者为载体质粒。然后按下述从每个转化株中制备细胞提取物。
每个转化株在30ml含有5μg/ml氯霉素和10μg/ml四环素的LB培养基中于30℃培养约16小时。离心(在10,000g，10分钟)每个培养液收集沉淀的细胞，然后将细胞悬浮于0.8ml悬浮液(每10ml中含5ml 0.1M磷酸缓冲液(pH7.6)，1ml 50mM硫酸镁，0.1ml 0.2M二硫苏糖醇，3.3ml 60％蔗糖和0.6ml无菌水)，并维持悬浮温度在低于4℃的温度下，超声波破碎细胞来制备细胞提取物。
按下述方法测定Amd提高的MDH酶活性。0.9ml体积的反应缓冲液(每20ml中10ml 0.1M甘油/氢氧化钾(pH9.5)，2ml 50mM硫酸镁，0.1ml 0.2M二硫苏糖醇，0.5ml 40mM NAD，7.4ml无菌水)，在石英比色杯中37℃孵育3分钟。然后，50μl上述制备的细胞提取物加入到反应混合物中并搅拌。同时，在340nm下，开始反应混合物的光吸收的时程测定，在340nm下NADH具有最大的光吸收，记录340m下光吸收的变化，该变化与甲醇的加入无关。约60秒后，向反应混合物中加入50μl甲醇并搅拌，然后研究340nm下光吸收的增加，即产生的NADH。结果显示，与使用导入了pHY300PLK的菌株细胞提取物的情况下所观察到MDH引起的340nm光吸收增加率相比，使用导入了pHY-A1的菌株细胞提取物时，在340nm下光吸收增加率基本没有变化，而使用导入了pHY-A2的菌株时，观察到5倍的NADH产生率。这样，证实pHY-A2编码的Amd基因确实具有提高MDH活性的活性。实施例4来源于芽孢杆菌属的甲醇-同化细菌的hps基因和phi基因的克隆按与前述相同的方法从短芽孢杆菌S1菌株中制备染色体DNA，该菌株为芽孢杆菌属的甲醇同化细菌。该染色体DNA用作PCR扩增靶DNA区域的模板。PCR所用的寡核苷酸序列(SEQ ID NOS12和13)能够在扩增后的DNA片段的两端引入HindIII限制性酶位点。PCR条件与上述所用的相同。然后，所获的DNA片段用常规方法纯化再用限制性酶HindIII处理以制备在两端都具有HindIII消化末端的靶DNA。
另外，用限制性酶HindIII处理pHY300PLK，再用碱性磷酸酶处理并与前述DNA片段用T4连接酶(Takara Shuzo)连接。按与前述相同的方法将其用于转化大肠杆菌JM109菌株，获得了许多四环素抗性菌落。从中选出几个菌落，研究其中含有的质粒，选出一个其中与载体中四环素抗性基因相同方向存在靶基因，hps基因和phi基因的质粒。该质粒被命名为pHY-H4。
然后，实施例1中提及的AM101菌株通过常规方法分别用上述构建的pHY-H4和用于构建pHY-H4的载体pHY300PLK转化，制备转化株，pHY-H4/AM101菌株和pHY300PLK/AM101菌株。选出每个菌株的菌落，在5ml含有10μg/ml四环素和5μg/ml氯霉素的LB培养基中孵育并在30℃培养约16小时。然后将0.1ml培养液转移到5ml新鲜的含有与上述相同抗生素的LB培养基中并进一步在37℃培养8小时。离心该培养液(10,000g，10分钟)收集细胞。
所获的细胞悬浮于0.9ml悬浮液(每10ml组份5ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.6)，0.3ml 0.1M氯化镁，50μl 0.2M二硫苏糖醇，无菌水补足到10ml)，维持温度在4℃超声波破碎细胞并在4℃离心(20000g10分钟)收集上清部分来制备细胞提取物。然后，按下述测定每种提取物中HPS活性和PHI活性。
0.9ml体积的反应液(组份在下述显示)在石英比色杯中47℃孵育3分钟。然后，50μl上述制备的细胞提取物加入到反应混合物中并充分搅拌。同时，在340nm下，开始反应混合物的光吸收的时程测定，在340nm下NADH具有最大的光吸收。加入细胞提取物60秒后，向反应混合物中加入50μl 1M甲醛液体溶液并充分搅拌，然后记录340nm下反应混合物光吸收的增加，即产生的NADH。当使用对照菌株，含有pHY300PLK的AM101的细胞提取物时，基本上没有观察到由于甲醛的加入所引起的340nm下光吸收的增加，而当使用含有pHY-H4的菌株时，观察到光吸收的快速增加。这说明pHY-H4上克隆的hps基因和phi基因都能在大肠杆菌中表达酶活性而最终从甲醛产生果糖6-磷酸和核酮糖5-磷酸。这样，证实了hps基因和phi基因已被克隆。
表1反应缓冲液组成0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.6) 5ml0.1M氯化镁 0.5ml0.1M核糖5-磷酸 0.5ml10mM NADH 2.5ml磷酸核糖异构酶 30μl磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoisomerase) 20μl葡萄糖6-磷酸脱氢酶 20μl无菌水 0.5ml总计9.07ml实施例5含有hps，phi和amd的质粒的构建实施例3和4产生的质粒pHY-A2和pHY-H4都经过两种限制性酶BglII和EcoT22I处理。从pHY-A2中制备得到一个较小的含有amd基因的DNA片段。另一方面，用常规方法从pHY-H4制备得到一个较大的含有hps和phi基因的DNA片段并用T4连接酶将其与amd基因片段连接。
用上述反应混合物转化大肠杆菌JM109菌株的感受态细胞。使用四环素抗性作为标记选出转化株。从琼脂平板上的几十个菌落中，任意选出6个菌落，并分析其中所含质粒的结构。结果证实了所有的质粒都具有期望的结构，即在pHY300PKL载体中含有3种基因amd，hps和phi。该质粒被命名为pHY-A2H4。实施例6赋予了甲醇利用能力的枯草芽孢杆菌菌株的制备以及甲醇利用能力的测定实施例2中构建的L-217M1菌株在30℃在含有5μl/ml氯霉素的LB培养基中振荡培养过夜。将0.1ml体积的培养液加入到5ml含有5μl/ml氯霉素的CI培养基(组份如下所示)中并搅拌，然后在37℃振荡培养。以合适的间隔测定(660nm)培养液的光吸收，当光吸收值超过1之后60分钟，离心培养液(3000g，10分钟)收集细胞。
然后，在10ml CII培养基(含有5μg/ml氯霉素，组份如下所示)中悬浮收集的细胞，并在含有CII培养基的该培养液中继续振荡培养40分钟。然后，提取500μl该培养液并加入1μg pHY-A2H4，然后在37℃振荡培养90分钟。将该培养液适当稀释后接种在含有5μg/ml氯霉素以及10μg/ml四环素的LB琼脂培养基上，细胞在37℃培养过夜作为标准培养物来选择对两种抗生素都显示出抗性的菌落。其中之一为pHY-A2H4/L-217M1菌株。
该pHY-A2H4/L-217M1菌株被命名为AJ13855，并于2001年8月2日保藏在独立管理机构，国立高级工业科学技术研究院，国际专利生物保藏，(independent administrative institution，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，International Patent Organism Depository)(保藏号305-5466，Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，并获登录号FERM P-18447。然后，根据布达佩斯条约，于2002年8月19日改为国际保藏并获得登录号FERMBP-8154。
5ml体积的CI培养基按下述制备。首先，向2.5ml 2×A液(K2HPO42.8％，KH2PO41.2％，(NH4)2SO40.4％)中加入5μl痕量元素溶液(每100mlCaCl20.55g，ZnCl20.17g，CuCl2·2H2O0.043g，CoCl2·6H2O0.06g，NaMoO4·2H2O0.06g)，1μl FeCl3溶液和1μl MnSO4溶液，混合，然后加入2.5ml 2×B液(MgSO4·7H2O10Mm，葡萄糖1％)，50μl 5％(w/v)酵母提取物，10μl 10％(w/v)酪蛋白氨基酸，50μl 5mg/ml L-色氨酸溶液，50μl 5mg/ml L-甲硫氨酸溶液和50μl 2.5mg/ml胸腺嘧啶溶液。K2HPO4和KH2PO4可购自Nakarai Tesque，(NH4)2SO4，MnSO4·7H2O和葡萄糖可购自Junsei Chemical，酵母提取物和酪蛋白氨基酸可购自DIFCO。CaCl2，ZnCl2，CuCl2·2H2O，CoCl2·6H2O，和NaMoO4·2H2O可购自Wako Pure Chemical Industries。
10ml体积的CII培养基按下述制备。首先，向5ml 2×A液中加入10μl痕量元素溶液，2μl FeCl3溶液和2μl MnSO4溶液，混合。然后加入5μl2×B液，10μl5％(w/v)酵母提取物，10μl 10％(w/v)酪蛋白氨基酸，10μl 5mg/ml L-色氨酸溶液，10μl 5mg/ml L-甲硫氨酸溶液和10μl 2.5mg/ml胸腺嘧啶溶液。
然后，使用稳定的同位素13C标记甲醇来检测构建的AJ13855(pHY-A2H4/L-217M1)菌株是否能够利用甲醇。在30℃，含有5μg/ml氯霉素和10μg/ml四环素的LB液体培养基中振荡培养AJ13855菌株过夜。该培养液以1％(v/v)比率接种到含有5μg/ml氯霉素和10μg/ml四环素的LB液体培养基中，然后在37℃振荡培养6小时，培养液以3％(v/v)比率被接种到下述的每种培养基中，即含有13C-标记甲醇的A培养基和含有普通甲醇的A培养基。
A培养基的组份在表2中说明。应用通过向50ml A培养基中加入13℃-标记甲醇使终浓度达到终浓度的0.4％(v/v)获得的培养基，以及通过向50ml A培养基中加入非13C-标记的普通甲醇使终浓度达到0.4％(v/v)获得的培养基。接种后，将所述细胞在47℃振荡培养30小时。培养后，两种培养液在660nm的光吸收达到约2.3，这个光吸收指示生长的程度，这样，在两种培养基之间细菌的生长没有明显的差别。然后，两种培养液都被离心(8000rpm，15分钟)来得到上清，并冷冻干燥。
将62mg获自每种培养液的冻干粉溶解于500μl重水中。当测定每种溶液中L-赖氨酸的数量时，在两种溶液均约为0.55mg，这就发现两种溶液中L-赖氨酸的数量几乎相同。然后，通过13C-NMR(核磁共振分析仪)分析溶液来研究产生的L-赖氨酸分子中13C的比率。结果显示，与使用加入了非标记甲醇的培养物产生的L-赖氨酸中碳原子信号相比，在加入了13C标记甲醇的培养物产生的L-赖氨酸中检测到的信号约强了3.8-13倍。这说明构建的AJ13855(pHY-A2H4/L-217M1)菌株新获得了吸收培养基中加入的13C-标记甲醇的能力，甚至利用其产生L-赖氨酸。
表2A培养基的组份(每130ml)5×MM培养基(组份如下所示) 26ml50mM MgSO42.6ml痕量元素溶液 1.3ml2mg/ml FeSO4260μl0.1mg/ml MnSO4260μl5mg/ml L-色氨酸1.3ml5mg/ml L-甲硫氨酸 1.3ml2.5mg/ml胸腺嘧啶 1.3ml50％(w/v)葡萄糖1.3ml50％(w/v)核糖 1.3ml10mg/ml(w/v)四环素 65μl无菌水 93ml
5×MM培养基(每200ml)(NH4)2SO42gK2HPO414gKH2PO46g二水合柠檬酸钠 1gMgSO4·7H2O0.2g用无菌水补足到总体积为200ml
序列表<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>生产靶物质的方法<130>OP1386<140><141>2002-09-06<140>JP 2001-270902<151>2001-09-06<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物MDH-BM-1<400>1taaaaaggat ccccgatgat acaacaccaa acgg 34<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明引物MDH-BM-2<400>2gaccgaattc catgtagttt ttcctcattc acc33<210>3<211>10186<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明重组载体<400>3aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 60ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 120tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 180atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 240attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 300gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 360agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 420aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt 480cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 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权利要求
1.一种利用微生物生产靶物质的方法，其包括在培养基中培养具有产生并能在培养基中或微生物细胞中积累该靶物质能力的微生物，并从所述培养基或所述微生物细胞中收集靶物质，其中，所述的微生物是导入了甲醇脱氢酶基因，并且该微生物经修饰后使己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖异构酶的活性得以提高，从而赋予或提高了其利用甲醇的能力，该培养基中含有甲醇作为碳源。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的微生物是进一步导入了编码甲醇脱氢酶激活剂基因的微生物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中靶物质是L-氨基酸。
4.根据权利要求3的方法，其中L-氨基酸是L-赖氨酸。
5.根据权利要求3的方法，其中微生物属于芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。
6.一种导入了甲醇脱氢酶基因的微生物，其中，该微生物经修饰后使己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖异构酶得以增强，从而赋予或提高了该微生物利用甲醇的能力。
7.根据权利要求6的微生物，其中进一步引入了编码甲醇脱氢酶每激活剂的基因。
8.根据权利要求6或7的微生物，其为革兰氏阳性细菌。
9.根据权利要求8的微生物，其为芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌。
10.根据权利要求9的微生物，其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
全文摘要
一种利用微生物生产靶物质的方法，其包括在培养基中培养具有产生并能在培养基中或微生物细胞中积累靶物质能力的微生物，并从该培养基或该微生物细胞中收集靶物质，所使用的微生物是导入了甲醇脱氢酶基因，并且提高了己酮糖磷酸合成酶和磷酸己酮糖异构酶的活性，该微生物经修饰后被赋予甲醇利用能力或提高了甲醇利用能力，所用的培养基中含有甲醇作为碳源。
文档编号C12P13/08GK1408877SQ0214372
公开日2003年4月9日 申请日期2002年9月6日 优先权日2001年9月6日
发明者安枝寿, 竹下亮 申请人:味之素株式会社