专利名称：一种基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法
技术领域：
本发明涉及单细胞内涵物的分析方法，特别提供了一种基于微流控芯片的分析方法。
背景技术：
传统的分析细胞内涵物方法以大量细胞为前提，获取某一内涵物(比如蛋白质，核酸等)含量的总值，该值与细胞数量的比值外推至单细胞内该物质的含量。对于性质相对均一的细胞群来说，此方法可以接受，但在另外一些场合下，比如某些重大疾病的早期阶段，仅有个别细胞的组分发生变化，这时，传统方法将会平均掉该特异变化。因此，单个细胞层面的分析有助于疾病的早期诊断。此外，与传统方法相比，单细胞分析在信息的获取上相对准确；有可能检测活性周期较短的不稳定中间产物。
从技术角度来看，单个细胞的分析可以分为完整的单细胞分析和破碎的单细胞分析。本发明仅涉及到后一种技术。在该技术类别中目前已有的技术包括单细胞凝胶电泳和毛细管电泳。前者的对象更多的局限于DNA损伤的分析。毛细管电泳技术分析单细胞内涵物的方法相对比较成熟，但它存在着操作困难，通量低，不易完全自动化等缺点。
微流控芯片作为一种新型分析平台(又名芯片实验室，微全分析系统等)具有易自动化，集成化程度高等优势，其在单细胞内涵物分析检测方面的工作，世界范围内尚未展开。仅有文献报道[Anal.Chem.1997，69，1564-1568，Paul C.H.Liand D.Jed.Harrison]细胞在玻璃通道内的TBE缓冲液中迁移和在SDS中的裂解，但没有完成分离和检测的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以微流控芯片为操作平台的单细胞内涵物的分析方法，该方法既可以单独分析单个细胞内的核酸、蛋白质、氨基酸、糖及其它物质，也可以并行分析上述物质，同时该方法具有相当的通量，克服了毛细管电泳技术耗时长的问题。
本发明提供了一种基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于；整个过程在一芯片平台上进行芯片平台上设置有细胞池、细胞废液池、细胞裂解液池、运行缓冲液池、废液池，细胞池、细胞废液池、细胞裂解液池、筛分剂池、缓冲液池分别与检测通道的入口相通，检测通道的出口接废液池，通道中预先靠压力充满筛分剂和染料；首先将细胞池和细胞废液池分别加电压和接地，在电动力的驱动下，细胞由细胞池流向细胞废液池，在显微镜观察下，当单个细胞到达检测通道的出口时，将细胞池和细胞废液池电极悬浮；与此同时将运行缓冲液池、细胞裂解液池加高电压，废液池接地；在该种电压模式下，保障细胞、细胞裂解液、筛分剂、运行缓冲液并行进入分离通道，完成单细胞的裂解，分离；在通道的两端对内涵物进行检测。
本发明中细胞最好选用各种没有细胞壁的细胞。细胞裂解液可以选用任何已知的裂解液，如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠、十二烷基三甲基氯化铵、十二甲基三甲基溴化铵、聚氧化乙烯-23-十二烷基醚(Brij35)、辛基葡萄糖苷、Triton X-100等)，筛分剂包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟乙基纤维素(HEC)，聚丙烯酰胺(PA)，聚吡咯烷酮(PVP)，聚环氧乙烷(PEO)，聚乙烯醇(PVA)，甲基纤维素(MC)，聚糖等。
本发明中所用细胞浓度应在103个/mL-106个/mL之间，细胞浓度低于这个范围，耗时长。高于这个范围，由于细胞相互接触的机会大，难以做到单细胞分析。单细胞细胞裂解液浓度应在0.0 1％-0.5％之间，裂解液浓度低于该范围，细胞在流过通道时仍保持完整。高于此范围，细胞裂解过快。筛分剂浓度应在0.15％-10％之间，低浓度的筛分介质达不到筛分效果，高浓度的筛分介质粘度大，难以灌入通道中。
本发明可以用于单细胞内核酸，蛋白质、氨基酸，糖等物质的分离分析。
本发明用微流控芯片材料可以是石英、玻璃、硅或者PMMA、PDMS聚合物。
具体实施例方式
图1为一种单细胞内涵物分析用微流控芯片，当然该结构并不限制本发明，其中1为细胞池、2为细胞废液池、3为细胞裂解液池、4为运行缓冲液池、5为废液池、6为检测点1、7为检测点II。
以激光诱导荧光的方法进行检测首先向各缓冲池中分别加入缓冲液，细胞裂解液，筛分剂(其中包含染料)，细胞液。随后，在各缓冲池中插入铂电极，电高压(该电压在通道内产生的场强在50V/cm-250V/cm之间)通过该电极施加到各缓冲池，驱动细胞、细胞裂解液、筛分剂流向同一个通道。在该通道内完成单个细胞的裂解及释放的内涵物与染料的标记。当标记了染料的内涵物通过激光焦斑时，被激光激发出的荧光由光电倍增管采集。
实施例1见附图1芯片结构图。运行缓冲液为100mM TBE，细胞为PC12(大鼠肾上腺嗜咯细胞瘤)，浓度约105个/mL。细胞裂解液为1％SDS。所用染料是YOYO-I(0.3uM)。激光波长488nm。细胞在裂解池和废液池之间的通(9)道内裂解，释放出的RNA带负电，所以在检测点I处检测。当检测带正电的物质时，可以在检测点II处检测。检测的RNA如附图2所示。
实施例2见附图1所示芯片结构图。运行缓冲液为100mM TBE，细胞为PC12(大鼠肾上腺嗜略细胞瘤)，浓度约105个/mL。细胞裂解液为1％SDS。筛分剂为1％HPMC(50cp)。激光波长488nm。在细胞液池，运行缓冲液池，细胞裂解液池施加500V电压，废液池接地。在检测点I处检测。检测的RNA如附图3所示。
权利要求
1.一种基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于；整个过程在一芯片平台上进行芯片平台上设置有细胞池、细胞废液池、细胞裂解液池、运行缓冲液池、废液池，细胞池、细胞废液池、细胞裂解液池、筛分剂池、缓冲液池分别与检测通道的入口相通，检测通道的出口接废液池，通道中预先靠压力充满筛分剂和染料；首先将细胞池和细胞废液池分别加电压和接地，在电动力的驱动下，细胞由细胞池流向细胞废液池，在显微镜观察下，当单个细胞到达检测通道的出口时，将细胞池和细胞废液池电极悬浮；与此同时将运行缓冲液池、细胞裂解液池加高电压，废液池接地；在该种电压模式下，保障细胞、细胞裂解液、筛分剂、运行缓冲液并行进入分离通道，完成单细胞的裂解及内涵物的分离；在通道的两端对内涵物进行检测。
2.按照权利要求1所述基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于细胞选用各种没有细胞壁的细胞。
3.按照权利要求2所述基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于细胞浓度应在103个/mL-106个/mL之间。
4.按照权利要求1所述基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于细胞裂解液为十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十四烷基硫酸钠、十二烷基三甲基氯化铵、十二甲基三甲基溴化铵、聚氧化乙烯-23-十二烷基醚(Brij35)、辛基葡萄糖苷、Triton X-100之一种。
5.按照权利要求4所述基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于单细胞细胞裂解液浓度应在0.01％-1％之间。
6.按照权利要求1所述基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于筛分剂选自羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基纤维素(HEC)、聚丙烯酰胺(PA)、聚吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、甲基纤维素(MC)、聚糖之一种。
7.照权利要求6所述基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于筛分剂浓度应在0.15％-10％之间。
8.按照权利要求1所述基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于释放出的内涵物检测方式是激光诱导荧光法或者是电化学法。
9.按照权利要求1所述基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于所用微流控芯片材料是石英、玻璃、硅或者PMMA、PDMS聚合物。
10.权利要求1～9所述基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，用于单细胞内核酸，蛋白质，氨基酸，糖等物质的分离分析。
全文摘要
一种基于微流控芯片的单细胞内涵物的分析方法，其特征在于整个过程在一芯片平台上进行首先将细胞池和细胞废液池分别加电压和接地，在电动力的驱动下，细胞由细胞池流向细胞废液池，在显微镜观察下，当单个细胞到达检测通道的出口时，将细胞池和细胞废液池电极悬浮；与此同时将运行缓冲液池、细胞裂解液池加高电压，废液池接地在该种电压模式下，保障细胞、细胞裂解液、筛分剂、运行缓冲液并行进入分离通道，完成单细胞的裂解，分离；在通道的两端对内涵物进行检测。本发明既可以单独分析单个细胞内的核酸、蛋白质、氨基酸、糖及其它物质，也可以并行分析上述物质，同时该方法具有相当的通量，克服了毛细管电泳技术耗时长的问题。
文档编号C12Q1/68GK1508261SQ0214477
公开日2004年6月30日 申请日期2002年12月13日 优先权日2002年12月13日
发明者盖宏伟, 刘晓君, 戴忠鹏, 马银法, 林炳承 申请人:中国科学院大连化学物理研究所