专利名称：用于扩增人的葡糖激酶基因的多重pcr引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于扩增人的葡糖激酶基因的引物集，更具体地，本发明涉及通过多重PCR扩增人类葡糖激酶基因中的靶DNA序列的引物集。
背景技术：
人类基因组由大约3×109个核苷酸组成，因此很难分离并分析特定的人类基因。PCR技术就是为扩增特定序列而开发的。通过利用一组引物，包括与靶序列的两个末端互补的引物，PCR能以较高的速度、特异性和敏感性扩增靶序列(Saiki等，Science 239487，1988)。
PCR广泛用于分析疾病相关基因。特别是，通过PCR进行的基因扩增可用于分析医学领域中疾病相关基因的遗传变异。特定的疾病相关基因通过PCR扩增，并通过测序、杂交或单链构象多态性进行分析。当本文中提到基因的遗传变异时，是指核苷酸序列中的改变，包括核苷酸序列的缺失、加入或倒位。特别是，基因的遗传变异包括单核苷酸多态性。
在分析基因的遗传变异时，如果靶基因较小，可能单次PCR就足以扩增整个基因。但是，如果靶基因较大，例如，为1kb或更大时，单次PCR可能就不足以扩增完整基因。因此，需要在完整基因的多个部位进行多次独立的PCR，以便扩增出完整基因。在分析疾病相关基因的遗传变异时，更经常使用的是多次PCR(multiple PCR)，而不是单次PCR，因为绝大多数疾病相关基因为1.5kb或更大。
但是，多次PCR需要大量样品，例如，病人的DNA或血液。另外，多重PCR的成本较高，且耗费更多的时间和精力。
目前已经开发出一种多重PCR(multiplex PCR)以解决上述问题。多重PCR在一次反应中就能同时扩增一个基因的多个靶序列。因此，利用能扩增每种靶序列的引物集，就可通过单次PCR扩增多个靶序列。
用于多重PCR的一组引物应该能特异性结合靶序列，并且不应相互干扰，从而扩增足够量的靶序列。
利用这样一组引物通过多重PCR扩增靶序列，比单次PCR节省时间、精力和成本。特别是，利用DNA芯片分析基因的遗传变异时，多重PCR可在一个反应中扩增一种以上的DNA样品。
已知人类葡糖激酶基因的变异(包括点突变)，可以导致青春晚期糖尿病(MODY)2(Matschinsky & Magnuson，在‘Molecular Pathogenesis ofMODYs’中，Karger，1998；美国专利5,541,060；WO9321343)。MODY 2是MODY病(MODY 1，2，3，4和5)的一种，在所有类型的II型糖尿病中，占大约10-30％。因此，通过分析人类葡糖激酶基因的遗传变异，有可能预见患糖尿病的倾向。因此，为了利用诸如DNA芯片等快速分析人的葡糖激酶基因，需要开发一组用于通过多重PCR扩增人类葡糖激酶基因的引物。
发明内容
本发明的一个目的是，提供一组能通过多重PCR扩增人类葡糖激酶基因的靶序列的引物。
本发明另一目的是，提供一种利用引物组对人类葡糖激酶基因能进行测序的方法。
本发明还有一个目的是，提供一种用于扩增靶序列的试剂盒。
本发明提供了一种用于扩增人类葡糖激酶基因的靶序列的引物集(primer pool)，它包括至少一组由序列3(SEQ ID NO.3)至序列24(SEQ IDNO.24)鉴定的、用于扩增人类葡糖激酶基因的靶序列的引物，以及它们的变体，这些引物选自(a)一组选自可被序列3(SEQ ID NO.3)和4(SEQ ID NO.4)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(b)一组选自可被序列5(SEQ ID NO.5)和6(SEQ ID NO.6)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；
(c)一组选自可被序列7(SEQ ID NO.7)和8(SEQ ID NO.8)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(d)一组选自可被序列9(SEQ ID NO.9)和10(SEQ ID NO.10)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(e)一组选自可被序列11(SEQ ID NO.11)和12(SEQ ID NO.12)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(f)一组选自可被序列13(SEQ ID NO.13)和14(SEQ ID NO.14)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(g)一组选自可被序列15(SEQ ID NO.15)和16(SEQ ID NO.16)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(h)一组选自可被序列17(SEQ ID NO.17)和18(SEQ ID NO.18)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(i)一组选自可被序列19(SEQ ID NO.19)和20(SEQ ID NO.20)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(j)一组选自可被序列21(SEQ ID NO.21)和22(SEQ ID NO.22)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；以及(k)一组选自可被序列23(SEQ ID NO.23)和24(SEQ ID NO.24)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补。
本发明提供了一种扩增人的葡糖激酶基因的靶序列的方法，包括利用本发明所述的引物集对人的葡糖激酶基因的靶序列进行PCR。
本发明还提供了一种用于扩增人类葡糖激酶基因的靶序列的试剂盒，其包含本发明所述的引物集。
图1的照片显示，人类葡糖激酶基因的外显子1-10，经过单次PCR和多重PCR所得产物的电泳结果。
图2显示，利用能扩增外显子9的一组引物，经过单次PCR获得的产物的核苷酸序列比较，其中所述外显子9具有人类葡糖激酶基因的已知核苷酸序列。
图3a和3b的照片显示，用一组引物变体经过多重PCR获得的产物的电泳结果。
图4的照片显示，利用用于扩增每种外显子的每组引物作为探针，经过单次PCR和多重PCR获得的产物的Southern印迹结果。
图5a和5b显示多重PCR产物的核苷酸序列的比较，所述多重PCR产物具有相应区域的已知核苷酸序列。
具体实施例方式
在开发用于经多重PCR扩增人类葡糖激酶基因的引物集时，考虑以下因素引物集的引物应当能结合人类葡糖激酶基因的靶序列，并且应当不相互干扰，以便扩增足够量的靶序列。引物集的每种引物应当具有相似的解链温度，并且不应形成引物对二聚体。此外，引物集的每种引物不应形成发卡或引物的自身二聚体。引物序列应当不包括微卫星区和重复区(repetitive region)。
用于扩增人类葡糖激酶基因的靶序列的引物集，包括至少一组由序列3-24所鉴定的用于扩增人类葡糖激酶基因靶序列的引物及其变体，它们选自
(a)一组选自可被序列3(SEQ ID NO.3)和4(SEQ ID NO.4)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(b)一组选自可被序列5(SEQ ID NO.5)和6(SEQ ID NO.6)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(c)一组选自可被序列7(SEQ ID NO.7)和8(SEQ ID NO.8)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(d)一组选自可被序列9(SEQ ID NO.9)和10(SEQ ID NO.10)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(e)一组选自可被序列11(SEQ ID NO.11)和12(SEQ ID NO.12)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(f)一组选自可被序列13(SEQ ID NO.13)和14(SEQ ID NO.14)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(g)一组选自可被序列15(SEQ ID NO.15)和16(SEQ ID NO.16)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(h)一组选自可被序列17(SEQ ID NO.17)和18(SEQ ID NO.18)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(i)一组选自可被序列19(SEQ ID NO.19)和20(SEQ ID NO.20)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(j)一组选自可被序列21(SEQ ID NO.21)和22(SEQ ID NO.22)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；以及(k)一组选自可被序列23(SEQ ID NO.23)和24(SEQ ID NO.24)鉴定的引物组的引物，或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补。
通过在引物的至少一个末端加入或缺失1-3个与模板上1-3个末端核苷酸互补的核苷酸，可获得该引物的变体。因此，该引物变体除了至少一个末端部分以外，具有与其相应引物相同的核苷酸序列。
本发明用于扩增人类葡糖激酶基因的靶序列的试剂盒包含一个引物集。所述试剂盒可包含常规PCR试剂，如dNTP溶液，DNA聚合酶以及缓冲液等。
本发明将参照以下实施例进行更详细说明。以下实施例旨在举例，并非限定本发明的范围。
实施例1制备用于扩增人类葡糖激酶基因的11种靶序列的引物将引物设计为能使每种PCR产物的大小相差至少5-10bp。在设计多重PCR的引物组时，考虑上述因素。此外，将每种引物设计为不包括连续4个或更多个相同的核苷酸。
使用HYBsimulatorTM(Advanced Gene Computing Technologies，Inc)分析所述引物。
为了提高PCR产物的扩增效力，在正向引物的5’端加入T7启动子序列(序列1(SEQ ID NO.1))，在反向引物5’端加入T3启动子序列(序列2(SEQID NO.2))。
每种引物的序列编号以及特征见表1。
表1
F正向R反向实施例2通过单次PCR扩增人类葡糖激酶基因使用实施例1的每组引物，通过单次PCR扩增人类葡糖激酶基因的每种靶序列。PCR如下实现首先变性(95℃5分钟)，然后以变性(95℃30秒)、退火(64℃15秒)和聚合(72℃30秒)为一个循环，共进行30个循环，最后延伸(72℃3分钟)。PCR反应溶液的组成如下无菌且不含DNA酶和RNA酶的水12.8μldNTP混合物(每种核苷酸2.5mM) 2μl10x Taq聚合酶缓冲液 2μl一组引物(每种引物10pmol) 2μl基因组DNA(200-1.0μg) 1μlTaq聚合酶(5单位/μl) 0.2μlPCR产物通过在1.8％琼脂糖凝胶上进行电泳来分析(图1)。在图1中，泳道1-11代表对应于外显子1a，1b，1c，2，3，4，5和6，7，8，9和10的PCR产物。泳道12代表以下实施例3中的多重PCR产物，泳道13代表分子量标志，是一个50bp的DNA序列梯。
如图1所示，人类葡糖激酶基因的靶序列通过使用实施例1的一组引物经单次PCR来扩增。
分离用序列21和22这组引物通过单次PCR获得的产物，应用自动测序方法进行测序。将所得核苷酸序列(称为“query”)与人类葡糖激酶基因外显子9的已知序列(称为“Sbjct”)用DNAstar软件(DNAstar Inc.)进行比较(图2)。如图2所示，所述PCR产物与人类葡糖激酶外显子9的已知序列显示98.3％的序列同源性。该序列对比中使用的缺口(gap)频率0％。
除了外显子9，还以如上所述的同样方式对其它外显子的单次PCR产物进行测序，并进行分析，每种PCR产物与相应的已知外显子序列显示95％或更高的同源性。
实施例3通过多重PCR扩增人的葡糖激酶基因使用实施例1的一组引物进行多重PCR。该反应如下进行首先变性(95℃5分钟)，然后以变性(95℃30秒)、退火(64℃15秒)和聚合(72℃30秒)为一个循环，共进行30个循环，最后延伸(72℃3分钟)。所有引物都加入一个反应管中。该反应溶液的组成如下无菌且不含DNA酶和RNA酶的水 16.4μldNTP混合物(每种核苷酸2.5mM) 5μl10x Taq聚合酶缓冲液 5μl一组引物(每种引物10pmol) 22μl基因组DNA(200-1.0μg)1μlTaq聚合酶(5单位/μl) 0.6μlPCR引物通过在1.8％的琼脂糖凝胶上电泳来分析(图1，泳道11)。如图1所示，使用实施例1的上述一组引物进行多重PCR的结果是，人类葡糖激酶基因的所有11种靶序列(507，312，249，365，355，264，446，370，336，410和551bp)都得到扩增。
实施例4用一组引物变体通过多重PCR扩增人类葡糖激酶基因引物变体如下合成在4组引物(用于扩增外显子1a，3，4和9的引物组)中每一种引物的一个末端增加3个与所述模板互补的核苷酸，在另一末端缺失3个核苷酸。按照与实施例1所述同样的方法进行多重PCR，但其中使用上述4组引物中的一组，另3组使用表1所示的相应引物组(图3a和3b)。
表2 F正向 R反向 从表1所示相应引物中删除的核苷酸xxx向表1所示相应引物中加入的核苷酸图3a的照片显示，应用一组针对外显子4的引物变体、表1中针对外显子1a，3和9的引物组进行多重PCR，所得产物的电泳结果。图3b的照片显示，应用一组针对外显子9的引物变体、表1中针对外显子1a，3和4的引物组进行多重PCR，所得产物的电泳结果(应用针对外显子1a和3的一组引物变体所得多重PCR产物的电泳结果未显示)。在图3a和3b中，左侧第一泳道是分子量标志，一个50bp的DNA序列梯，泳道1是用表1所示的一组引物获得的多重PCR结果，泳道2是用表2所示一组针对外显子4和9的引物变体获得的多重PCR结果，泳道3是应用除了针对外显子4或9的一组引物以外的上述另3组引物进行多重PCR的结果。
如图3a和3b中所示，应用一组引物变体经过多重PCR扩增得到了基因的相应靶序列。
实施例5通过southern印迹分析鉴定多重PCR产物将实施例2和3中扩增的PCR产物在1.8％的琼脂糖凝胶上电泳(图1)。将所述凝胶加入变性溶液(0.5N NaOH+1.5M NaCl)中，搅拌15分钟，使双链DNA变性。经过两次变性处理后，重复两次，用蒸馏水洗凝胶，然后将凝胶加入中性溶液(3M NaCl，含0.5M Tris-HCl，pH7.5)中，温和搅拌15分钟，中和凝胶。经过两次中和处理后，通过使凝胶与尼龙膜在20XSSC溶液中反应12.5小时，而将凝胶内的DNA转移至尼龙膜上。DNA通过在120℃反应30分钟而与尼龙膜交联，然后洗膜1-2分钟，干燥。
将所得的结合了DNA的膜置于20ml杂交溶液中，于62℃预杂交约2小时，然后弃去所述溶液。将结合了DNA的膜以及5pmol/ml DIG(地高辛配基)标记的探针加入10ml新鲜杂交溶液袋中，于62℃反应约12小时。反应期间，DIG标记的探针与基因的互补区杂交。反应后，将膜在室温下用2X洗涤溶液(2XSSC+0.1％SDS)洗2次，每次5分钟，在62℃用0.5X洗涤溶液(0.5XSSC+0.1％SDS)洗两次，每次15分钟。
将上述膜置于20ml封闭溶液中约30-60分钟，然后使膜与抗-DIG抗体在含1μl碱性磷酸酶偶联型绵羊抗-DIG抗体(Roche)的20ml封闭溶液中反应30分钟。将膜用洗涤溶液(100mM顺丁烯二酸，150mM NaCl，pH7.5室温，0.3％Tween20)洗两次，每次约15分钟。为了证实DNA与探针在膜上杂交，将碱性磷酸酶底物，CDP-Star与检测缓冲液以1∶100混合，将膜用该溶液处理约5分钟，然后将此膜曝光于X-线胶片。使胶片显影，从而确定探针的位置(图4)。如图4中所示，外显子1a，外显子1b，外显子3，外显子4，外显子8，外显子9和外显子10分别代表相应外显子的单次PCR产物，m代表多重PCR产物。
如图4中所示，所述探针与单次PCR产物和多重PCR产物在相同位置杂交，这说明所扩增的产物是相同的。
实施例6通过测序分析来鉴定多重PCR产物测序PCR通过用实施例3制备的多重PCR产物作为模板，用它们各自对应的扩增引物作为测序引物来进行。在PCR结果中，图5代表用针对外显子1c、外显子5和6以及外显子7的扩增引物作为测序引物进行测序PCR的结果。图5显示测序结果与人类葡糖激酶基因的相应已知外显子序列的比较。如图5中所示，通过本次多重PCR获得的人类葡糖激酶基因外显子1c、外显子5和6以及外显子7的序列有95％或更高的同源性。
用于扩增人的葡糖激酶基因的本发明引物集可有效用于通过多重PCR扩增相应基因。特别是，用于通过多重PCR扩增基因的引物集可用于利用DNA芯片分析疾病相关基因，因为多重PCR需要的样品量相对较少。
用于扩增人的葡糖激酶基因的本发明引物集可应用在扩增或测序人类葡糖激酶基因的试剂盒中。
序列表<110>三星电子株式会社(Samsung Electronics Co.Ltd.)<120>用于扩增人的葡糖激酶基因的多重PCR引物<160>24<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>噬菌体T7启动子序列<400>1taatacgact cactataggg 20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>噬菌体T3启动子序列<400>2gtaaccctca ctaaaggga19<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子1a的正向引物<400>3caggtcacag aagggagagg ac 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子1a的反向引物<400>4tggggacagg caagcaaaca ct 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子1b的正向引物<400>5agcagccgcc agctgagccc 20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子1b的反向引物<400>6ctcccagtgc aaagtcccta act 23<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子1c的正向引物<400>7ccaggccagt ggcct taagg a 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子1c的反向引物<400>8gcctgggaag aagaggttcc a 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子2的正向引物<400>9gccctcggtg tgcagatgcc t 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子2的反向引物<400>10ggtgcttctc ccagctaggc t 21<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子3的正向引物<400>11tatccggctc agtcacctgg g 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子3的反向引物<400>12cctcccgtca ggactagctg g 21<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子4的正向引物<400>13catgccagat ggtcaccatg gc 22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子4的反向引物<400>14ttgaaggcag agttcctctg gg 22<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子5和6的正向引物<400>15gccctagcac cctgcctcca 20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子5和6的反向引物<400>16agcctcggca gtctggaagg g 21<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子7的正向引物<400>17ggaagcggca ggaaccaggc 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子7的反向引物<400>18atggcccggc tcccatctgc 20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子8的正向引物<400>19cccggcttcc acctgcatga g 21<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子8的反向引物<400>20ctgagaccaa gtctgcagtg cc 22<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子9的正向引物<400>21ggactgtcgg agcgacactc a21<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子9的反向引物<400>22atcttggagc ttgggaaccg ca 22<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子10的正向引物<400>23agggcgcccg gtaatgaatg tg 22<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>外显子10的反向引物<400>24aagtcctgag tgagcaactc cc 2权利要求
1.一种用于扩增人类葡糖激酶基因的靶序列的引物集，其包括至少一组选自下组的引物(a)一组选自可被序列3和4鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(b)一组选自可被序列5和6鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(c)一组选自可被序列7和8鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(d)一组选自可被序列9和10鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(e)一组选自可被序列11和12鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(f)一组选自可被序列13和14鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(g)一组选自可被序列15和16鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(h)一组选自可被序列17和18鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(i)一组选自可被序列19和20鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；(j)一组选自可被序列21和22鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补；以及(k)一组选自可被序列23和24鉴定的引物组的引物，和/或这组引物的变体，所述变体在所述引物的至少一个末端具有加入部分或缺失部分，其中所述部分有多达3个核苷酸与模板互补。
2.权利要求1的引物集，其中至少一种所述引物在其5’端包括T7启动子序列或T3启动子序列。
3.权利要求1的引物集，其中至少一种由序列3，5，7，11，13，15，17，19，21和23鉴定的引物在其5’端包括T7启动子序列，且至少一种由序列4，6，8，10，12，14，16，18，20，22和24鉴定的引物在其5’端包括T3启动子序列。
4.一种扩增人类葡糖激酶基因的靶序列的方法，包括用权利要求1-3中任一项所述引物集对人类葡糖激酶基因的靶序列进行PCR。
5.权利要求4的方法，还包括将0.1μM-1μM每一种所选引物与100ng-1μg模板DNA混合。
6.权利要求4的方法，其中所述PCR的条件是先在90℃-98℃变性1-5分钟，然后，在90℃-98℃变性10秒-1分钟、在60℃-65℃退火5秒-3分钟、在70℃-75℃聚合5秒-5分钟，最后在70℃-75℃延伸1分钟-10分钟。
7.一种利用权利要求1-3任一项所述引物集对人类葡糖激酶基因的靶核苷酸序列进行测序的方法。
8.一种用于扩增人类葡糖激酶基因的靶序列的试剂盒，包括权利要求1-3任一项所述的引物集。
全文摘要
本发明提供了一种引物集，尤其用于扩增人的葡糖激酶基因靶序列的引物集，它包括至少一组引物或其引物变体，每组引物通过起始于序列3而终止于序列24的两种连续序列来鉴定。使用本发明的引物进行多重PCR，可以以高特异性、高速、高灵敏度和低花费扩增出人的葡糖激酶基因的靶序列，所述基因是与青春晚期糖尿病(MODY)2相关的基因。
文档编号C12N15/09GK1467294SQ0214980
公开日2004年1月14日 申请日期2002年11月1日 优先权日2002年7月10日
发明者金美卿, 李娟受, 李贞男 申请人:三星电子株式会社