专利名称：微生物催化法生产烟酰胺的制作方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域。具体涉及一种微生物催化法生产烟酰胺。
目前主要的生产方法是1.3-甲基吡啶氨氧化成烟酰胺和2-甲基-5-乙基吡啶用硝酸氧化成烟酰胺。氨氧化法(特别是2-甲基-5-乙基吡啶的硝酸氧化)是一种选择性很高的方法，但他是有危险的，为了降低这种危险，高素质的人员、最好的基础设施和较高的技术水准是必不可少，因而给产业化及技术转让设置了较大障碍。目前，还未获得可工业化应用的氨氧催化剂。
本发明提供了一种微生物催化法生产烟酰胺的方法，该方法是通过发酵生产含有腈水合酶的丙酸棒杆菌或其诱变菌株细胞，在一定条件下用游离细胞法或者游离细胞连续法催化3-腈基吡啶水合成烟酰胺，而后通过较为简单的后处理获得高纯度的烟酰胺产品。
本发明的具体实施方式
如下(1)产酶细胞的制备先进行发酵种子的培养，在三角瓶或种子罐中装入适量的种子培养基(10-70％)，灭菌后接入一定量的菌种(1-10％)，在20-40℃下，旋转式摇床中(100-400rpm)振荡培养30-120小时，然后在50L-20m3的发酵罐其发酵培养基装入量为40％-70％，实罐消毒后接入2-7％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1(V.V.M)；搅拌转速50-400rpm；罐压0.03-0.06MP；温度20-40℃。发酵30-200小时；种子培养基组成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；发酵培养基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppmCoCl2，PH6.5-7.5；(2)催化水合生产过程将发酵液在分离因素≥3000kg，离心分离，去上清液，获得产腈水合酶细胞；将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，加入到反应釜中，发酵液与反应液体积的比例维持在≥1％。在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应。当产物浓度≥5％时，开始通过ultra-flow膜过滤系统出产物，同时开始补加3-腈基吡啶和水，该膜过滤系统让产物通过，并达到去除蛋白质及其它杂质，而能使游离细胞重新返回反应釜参与反应。通过调节3-腈基吡啶和水的流加速度和产物烟酰胺溶液的流出速度，从而使流出的产物烟酰胺溶液浓度保持在设定的范围，初始底物浓度≤20％(w/v)，最终转化率为≥99％；(3)纯化处理将水合反应获得的一定浓度的烟酰胺液置于1-20℃的环境下，保持2小时以上。烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，保温一段时间后，出现大量结晶体，将晶体和水的混合溶液通过冷冻离心进行分离获得晶体，将晶体在35-50℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。
或者采用批式反应，批式反应的流程将发酵液在分离因素≥3000kg，离心分离，去上清液，将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，发酵液与反应液的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，反应过程中，通过补加3-腈基吡啶的固体或者溶液使底物浓度控制在0.001％-20％，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的烟酰胺溶液，它的产物溶液累积到一定浓度后(≥10％)一次性出罐最终转化率为≥99％；将达到一定浓度的反应液通过离心去掉细胞及细胞碎片，温度维持在28-32℃，将获得的清液再通过膜过滤系统去除蛋白质，把去除蛋白质的液体置于1-20℃的环境下，保持2小时以上。烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，保温一段时间后，出现大量结晶体，将晶体和水的混合溶液通过膜过滤或者冷冻离心进行分离获得晶体，将晶体在35-50℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。与连续法的区别在于，通过补加加入3-腈基吡啶的固体或者溶液，使底物浓度控制在10ppm以上，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的烟酰胺溶液，它的产物溶液累积到一定浓度后(≥10％)一次性出罐，转化率≥99％。在分离提纯步骤还要加上，将达到一定浓度的反应液通过离心去掉细胞及细胞碎片，再通过膜过滤系统去除蛋白质，温度维持在28-32℃。其余方法均与连续法相同。
本发明使用丙酸棒杆菌及其诱变菌种产生的腈水合酶将3-腈基吡啶转化成烟酰胺，其操作过程简单、反应条件温和、减少环境污染，且分离提纯简单，产品纯度高。
本发明与现有技术相比具有下列特点1)现有技术用于催化腈成酰胺的菌株主要是红球菌属的细菌，本发明采用的是丙酸棒杆菌及其经诱变的菌种。该菌种由本所含腈的土壤中分离获得，经初步鉴定为丙酸棒杆菌。该菌株产酶能力强，在本发明的发酵条件下能获得较高的生物量，最高可达40毫克/毫升发酵液，因而其单位体积发酵液的总酶活也较高，最高可达1000万单位/毫升发酵液。(注酶活定义，在一小时里将1微克的3-腈基吡啶转化为烟酰胺的酶量，单位微克/小时)。
2)本发明的催化水合使用的工艺是批式反应或者游离细胞膜分离连续反应。与传统的批式反应相比，连续反应大大提高了生产效率，减轻了劳动强度，提高了生物酶催化剂及设备的利用率；同时本发明相对固定化细胞生产，减少了工艺流程，减少了三废，降低了生产成本，生产过程中减少了传质阻力提高了生产效率。批式反应对设备要求低，生产的烟酰胺浓度比连续法要高，简便了下游的分离提纯。
3)本发明的分离提纯采用将反应液冷冻结晶，而后过滤或者离心，再将晶体真空干燥或者喷雾干燥。
在10m3的发酵罐中加入60％的发酵培养基，实罐消毒后接入5％的种子液，在通气量1∶0.5(V.V.M)；罐压0.05MP；搅拌转速前期180rpm，后期100rpm；温度28℃。发酵60小时。
种子培养基组成0.6％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.05％K2HPO4，0.05％MgSo4，0.05％KH2PO4，PH7.2发酵培养基2.1％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.9％尿素，0.05％K2HPO4，0.05％KH2PO4，0.1％MgSO4，10ppm CoCl2，PH7.权利要求
1.一种微生物催化法生产烟酰胺的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)产酶细胞的制备先进行发酵种子的培养，在三角瓶或发酵罐中装入适量的种子培养基(10-70％)，灭菌后接入一定量的菌种(1-10％)，在20-40℃下，旋转式摇床中(100-400rpm)振荡培养48-120小时，然后在50L-20m3的发酵罐其发酵培养基装入量为40％-70％，实罐消毒后接入2-7％的种子液，在通气量1∶0.2-1∶1(V.V.M)；罐压0.03-0.06MP；搅拌转速50-400rpm；温度20-40℃，发酵30-200小时；种子培养基组成0.5-2％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.05-0.15％Nacl，0.05-0.3％K2HPO4，0.01-0.03％MgSo4，尿素0.1-1％，PH7.0-7.5；发酵培养基1-2.5％葡萄糖，0.2-1％酵母膏，0.1-2％尿素，0.03-0.1％K2HPO4，0.03-0.1％KH2PO4，0.03-0.1％MgSO4，2-20ppmCoCl2，PH6.5-7.5；(2)催化水合生产过程将发酵液在分离因素≥3000kg，离心分离，去上清液，获得产腈水合酶细胞；将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，加入到连续反应罐中，发酵液与反应液体的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，当产物浓度≥5％时，开始通过ultra flow膜过滤系统出产物，同时开始补加3-腈基吡啶和水，该膜过滤系统让产物通过，而使游离细胞重新返回反应釜参与反应，通过调节3-腈基吡啶和水的流加速度和产物烟酰胺溶液的流出速度，从而使流出的产物烟酰胺溶液浓度保持在设定的范围，初始底物浓度≤20％(w/v)，最终转化率为≥99％；(3)纯化处理将水合反应获得的一定浓度的烟酰胺液置于1-4℃的冷冻环境下，保持2小时以上，烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，保温一段时间后，出现大量结晶体，将晶体和水的混合溶液通过冷冻离心进行分离获得晶体，将晶体在35-50℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。
2.根据权利要求1所述的一种微生物催化法生产烟酰胺的方法，其特征在于其中所述的步骤(2)和(3)采用下列方法将发酵液在分离因素≥3000kg，离心分离，去上清液，将细胞悬浮于去离子水或者纯净水或PH7.0-8.0的缓冲液中，发酵液与反应液的比例维持在≥1％，在5-55℃的温度下，50-300rpm的搅拌速度下进行酶催化反应，反应过程中，通过补加3-腈基吡啶的固体或者溶液使底物浓度控制在0.001％-20％，经过1-24h的反应，获得浓度在10％以上的烟酰胺溶液，它的产物溶液累积到一定浓度后(≥10％)一次性出罐最终转化率为≥99％；将达到一定浓度的反应液通过离心去掉细胞及细胞碎片，温度维持在28-32℃，将获得的清液再通过膜过滤系统去除蛋白质，把去除蛋白质的液体置于1-20℃的环境下，保持2小时以上。烟酰胺的溶解度随温度的降低而大大下降，冷冻保温一段时间后，出现大量结晶体，将晶体和水的混合溶液通过膜过滤或者冷冻离心进行分离获得晶体，将晶体在35-50℃下进行真空干燥，最终获得的烟酰胺纯度在99.8％以上。
全文摘要
本发明属微生物技术领域。本发明公开了一种微生物催化法生产烟酰胺的方法。本发明采用丙酸棒杆菌产生的腈水合酶将3－腈基吡啶转化成烟酰胺。本发明的方法操作简便，反应条件温和，减少环境污染，分离提纯简单，产品纯度高，宜于规模型工业化生产。
文档编号C12P17/10GK1424402SQ02151290
公开日2003年6月18日 申请日期2002年12月12日 优先权日2002年12月12日
发明者沈寅初, 薜建萍, 李还宝, 王胜亮, 李勇, 朱健 申请人:上海市农药研究所, 沈寅初, 薜建萍