专利名称：一种磷霉素生物转化菌株的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物转化/生物催化技术领域，具体为一种磷霉素生物转化菌株的新筛选方法。
背景技术：
磷霉素[(-)-顺-(1R，2S)-1，2-环氧丙基磷酸，FOM]是一种抑制细菌生长的广谱抗生素。FOM可以由顺丙烯磷酸(cis-propenylphosphonic acid，cPA)经过微生物转化作用获得。传统的方法是采用振荡培养方法筛选转化菌株。该方法采用在液体培养基中添加前体cPA，经振荡培养后，以发酵液的离心上清液为测定样品。这种方法的缺点是需要较多的劳力、设备和时间。
单菌落琼脂块培养法是一种高效率的抗生素生产菌筛选方法。该方法的要点是用打孔器在营养琼脂平板上打取大小均一的琼脂块，并分别把它们移入灭过菌的空平皿中，于每个琼脂块上接种待测菌株，保持适合的温度和湿度，经过一定时间培养。把每一个长有大菌落的琼脂块转移到含有指示菌种(即拮抗对象)的琼脂平板上，以分别测定它们的抗生素抑菌圈的直径，从而择优取之。该方法的关键是将单菌落琼脂块分别培养，在这种情况下，各单菌落琼脂块的培养条件基本相同，且产生的代谢产物不致扩散，因此测得的数据与振荡培养条件下十分相似，然而工作效率却大为提高。
该方法的局限在于它仅适合本身可生物合成抗生素的放线菌的筛选，因为放线菌具有发达的基内菌丝(生长于琼脂块内部)，在这种情况下，其分泌的抗生素可以均匀地扩散于琼脂块中，便于检测。
发明内容
本发明目的是提供一种快速的、批量筛选FOM生物转化细菌菌株，又可以在生物鉴定盘上初步区分单菌落转化效率的新方法。
本发明的技术方案是一种磷霉素生物转化菌株的筛选方法，在含有顺丙烯磷酸前体的琼脂块上接种待测菌株培养，然后将琼脂块倒置于生物鉴定盘上，检测、筛选出具有转化能力的菌株。
琼脂块的制备与单菌落琼脂块培养包括
1)琼脂块培养基组成按重量百分数计，琼脂块培养基组成为顺丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，琼脂1.8-2.0％，余量为自来水，115℃灭菌30分钟。
2)琼脂块的制备将上述培养基融化，倒入平皿，静置凝固后，用打孔器打出琼脂块，然后在其表面接种待检测菌株，置于30℃，75％-85％相对湿度下培养4-5天。
磷霉素转化菌株的筛选包括1)指示菌培养与悬液的配制按重量百分数计，指示菌培养基成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为自来水，加热溶解后，调pH7.0-7.2，121℃湿热灭菌20分钟后，摆斜面备用。
指示菌培养37℃培养24hr，菌苔呈半透明至白色。
指示菌悬液的制备把灭菌的生理盐水倒入茄型瓶中，用接种环刮洗菌苔，再将刮洗液倒入灭菌的生理盐水中，测定吸光度为0.54-0.57。
2)生物检定培养基及其平板的制备按重量百分数计，培养基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，余量为自来水，pH7.0-7.2；按重量百分数计，培养基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，余量为自来水，pH7.0-7.2；培养基I、培养基II均在121℃灭菌20分钟；将融化的培养基I倒入生物鉴定盘，制成下层平板；再将融化的培养基II冷却至55℃，加入指示菌菌悬液，迅速混匀后倒入生物鉴定盘，制成上层平板。
3)磷霉素转化菌株生物鉴定将培养好的单菌落琼脂块置于紫外灯下灭菌20分钟，再将琼脂块倒置于生物鉴定平板上，37℃培养16hr，观察并测量抑菌圈直径；依据抑菌圈的有无和抑菌圈直径的大小来筛选具有磷霉素生物转化能力的菌株。
生物鉴定盘所用的指示菌为大肠杆菌或其它磷霉素敏感菌。
本发明通过摇床发酵法对初筛的菌株复筛，培养基为顺丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.02％，余量为自来水，30℃，160rpm培养4天，通过抑菌圈直径大小，进一步筛选出转化效率较高的菌株。
本发明利用薄层层析分析磷霉素，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水(体积比3∶1∶1)，将展开后的层析板风干，置于生物鉴定平板上，待浸润后取下，37℃培养16hr，含有磷霉素部分产生抑菌圈。
本发明的有益效果是1、本发明利用圆柱状固体培养基(琼脂块)培养待检测菌株，利用大肠杆菌为生物鉴定的指示菌，筛选磷霉素转化菌株。根据在等体积并含有等量前体物的琼脂块上生长的待选菌株转化能力不同，产生的磷霉素浓度不同，进而由磷霉素在指示菌平板上产生的抑菌圈大小也不同，最终筛选出磷霉素转化优势菌种。
2、本发明方法的设备要求低，操作简单，非常适用于抗生素生物转化细菌的初级批量筛选。
图1为本发明顺丙烯磷酸(cPA)在微生物的催化作用下转化为磷霉素(FOM)示意图。
具体实施例方式
本发明首先将等量的前体cPA均匀的混入琼脂块中并于表面接种待测菌株，生物转化过程首先需要菌体吸收外源性前体，通过菌体内酶催化作用将其转化为磷霉素。而由于接种的细菌只生长于琼脂块表面，只能吸收并转化表层的cPA而产生FOM，所以FOM主要积累于琼脂块表面。因此，要使筛选灵敏度获得大幅度提高，将琼脂块倒置于生物鉴定平板上作抑菌圈实验是一个有效途径，并由抑菌圈大小判断转化效率。
本发明的具体操作步骤如下一、指示菌培养与悬液的配制指示菌为大肠杆菌(E.coli)，中国科学院沈阳应用生态研究所保藏。
按重量百分数计，指示菌培养基组成牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为自来水。加热溶解后，调pH7.0-7.2。装入茄型瓶90mL，121℃湿热灭菌20分钟后，摆斜面备用。
指示菌培养37℃培养24hr，菌苔呈半透明至白色。
指示菌悬液的制备把100mL灭菌的生理盐水倒入茄型瓶中，用接种环刮洗菌苔，再将刮洗液倒入灭菌的空锥瓶中，测定吸光度(O.D.值)为0.54-0.57。
二、琼脂块的制备与单菌落琼脂块培养按重量百分数计，琼脂块培养基组成cPA 0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，琼脂1.8％，余量为自来水，115℃灭菌30分钟。
琼脂块的制备将上述培养基融化，于每个Φ90mm平皿倒入25mL，静置凝固。凝固后，用打孔器打出琼脂块(Φ6×6mm)，然后在其表面接种待检测菌株，置于30℃，75％～85％相对湿度下培养4-5天。
三、磷霉素转化菌株的筛选生物检定培养基及其平板的制备按重量百分数计，培养基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为自来水，pH7.0-7.2；培养基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，余量为自来水，pH7.0-7.2；培养基I、培养基II均在121℃灭菌20分钟。将200mL融化的培养基I倒入生物鉴定盘(20×30cm)，制成下层平板；再将100mL融化的培养基II冷却至55℃，加入指示菌菌悬液1mL，迅速混匀后倒入生物鉴定盘，制成上层平板。
磷霉素转化菌株生物鉴定将培养好的单菌落琼脂块置于紫外灯下(30W，40cm)灭菌20分钟，再将琼脂块倒置于生物鉴定平板上，37℃培养16hr。观察并测量抑菌圈直径。依据抑菌圈的有无和抑菌圈直径的大小来筛选具有磷霉素生物转化能力的菌株。
实施例将本实验室保存的210株细菌接种到琼脂块上，于30℃，75％相对湿度培养4天。将经过接种待检测菌株并培养后的琼脂块紫外灭菌后，倒置贴于生物鉴定平板上。37℃培养16hr后观察抑菌圈的有无和直径大小，其中有12株细菌有明显的抑菌圈。
同时作三组平行对照即1)不含有cPA的琼脂块对照，用以排除培养基中其它抑菌成分的干扰；2)含有cPA的琼脂块对照，用以排除cPA底物的非生物的转化干扰；3)不含有cPA只接种菌株的琼脂块对照，用以排除菌株本身产生抑菌物质的干扰。实验结果表明三组对照都没有在鉴定平板上产生抑菌圈。说明筛选出的菌株是通过转化cPA为FOM而呈现抑菌圈的。
通过摇床发酵法对初筛的12个菌株复筛，培养基为cPA 0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.02％，余量为自来水，30℃，160rpm培养4天，通过抑菌圈直径大小，进一步筛选出转化效率较高的菌株。
利用薄层层析分析磷霉素，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水(体积比3∶1∶1)。将展开后的层析板风干，置于生物鉴定平板上，待浸润后取下，37℃培养16hr。含有磷霉素部分产生抑菌圈。比较样品与磷霉素标准品的Rf，样品的Rf值为3.52；标准品的Rf值为3.53，验证产生的抗生素为磷霉素。
权利要求
1.一种磷霉素生物转化菌株的筛选方法，其特征在于在含有顺丙烯磷酸前体的琼脂块上接种待测菌株培养，然后将琼脂块倒置于生物鉴定盘上，检测、筛选出具有转化能力的菌株。
2.按照权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，琼脂块的制备与单菌落琼脂块培养包括1)琼脂块培养基组成按重量百分数计，琼脂块培养基组成为顺丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，琼脂1.8-2.0％，余量为自来水，115℃灭菌30分钟2)琼脂块的制备将上述培养基融化，倒入平皿，静置凝固后，用打孔器打出琼脂块，然后在其表面接种待检测菌株，置于30℃，75％-85％相对湿度下培养4-5天。
3.按照权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，磷霉素转化菌株的筛选包括1)指示菌培养与悬液的配制按重量百分数计，指示菌培养基成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为自来水，加热溶解后，调pH 7.0-7.2，121℃湿热灭菌20分钟后，摆斜面备用；指示菌培养37℃培养24hr，菌苔呈半透明至白色；指示菌悬液的制备把灭菌的生理盐水倒入茄型瓶中，用接种环刮洗菌苔，再将刮洗液倒入灭菌的生理盐水中，测定吸光度为0.54-0.57；2)生物检定培养基及其平板的制备按重量百分数计，培养基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，余量为自来水，pH 7.0-7.2；按重量百分数计，培养基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，余量为自来水，pH7.0-7.2；培养基I、培养基II均在121℃灭菌20分钟；将融化的培养基I倒入生物鉴定盘，制成下层平板；再将融化的培养基II冷却至55℃，加入指示菌菌悬液，迅速混匀后倒入生物鉴定盘，制成上层平板；3)磷霉素转化菌株生物鉴定将培养好的单菌落琼脂块置于紫外灯下灭菌20分钟，再将琼脂块倒置于生物鉴定平板上，37℃培养16hr，观察并测量抑菌圈直径；依据抑菌圈的有无和抑菌圈直径的大小来筛选具有磷霉素生物转化能力的菌株。
4.按照权利要求1或3所述的筛选方法，其特征在于生物鉴定盘所用的指示菌为大肠杆菌或其它磷霉素敏感菌。
5.按照权利要求1所述的筛选方法，其特征在于通过摇床发酵法对初筛的菌株复筛，培养基为顺丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.02％，余量为自来水，30℃，160rpm培养4天，通过抑菌圈直径大小，进一步筛选出转化效率较高的菌株。
6.按照权利要求1或5所述的筛选方法，其特征在于利用薄层层析分析磷霉素，展开剂为正丁醇、乙酸、水的体积比为3∶1∶1，将展开后的层析板风干，置于生物鉴定平板上，待浸润后取下，37℃培养16hr，含有磷霉素部分产生抑菌圈。
全文摘要
本发明涉及生物转化/生物催化技术领域，具体为一种磷霉素生物转化菌株的筛选方法。本发明利用圆柱状固体培养基(琼脂块)培养待检测菌株，利用大肠杆菌为生物鉴定的指示菌，将琼脂块倒置于生物鉴定盘上筛选磷霉素转化菌株。根据在等体积并含有等量前体物的琼脂块上生长的待选菌株转化能力不同，产生的磷霉素浓度不同，进而由磷霉素在指示菌平板上产生的抑菌圈大小也不同，最终筛选出磷霉素转化优势菌种。该方法的设备要求低，操作简单，非常适用于抗生素生物转化细菌的初级批量筛选。
文档编号C12Q1/04GK1683553SQ200510045858
公开日2005年10月19日 申请日期2005年2月6日 优先权日2005年2月6日
发明者李智峰, 徐慧, 张雪姝, 张颖, 陈冠雄, 张忠泽, 王兰君, 陈玉 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所