专利名称：利用促血管生成素1多态性位点确定缺血性脑卒中易感性的方法
技术领域：
本发明涉及利用促血管生成素1多态性位点确定患者对缺血性脑卒中的遗传易感性的方法，用于该方法的物质、组合物、试剂盒及其用途。
背景技术：
脑卒中(Stoke)，又称中风或脑血管意外(Cerebrovascularaccident)，是一组突然起病，以局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管疾病。脑卒中有极高的病死率和致残率，在我国，脑卒中则是仅次于癌症的第二大致死疾病，每年死于脑卒中的超过100万人，是冠心病死亡人数的2-3倍。脑卒中的防治已成为卫生工作中的一项重要课题，越来越引起国内外医学界特别是神经科学界的重视。
脑卒中是临床症状复杂的多因素疾病脑卒中的临床症状复杂，但主要可分为两大类缺血性卒中和出血性卒中。在西方国家进行的流行病学调查结果表明，前者约占60-70％，后者占30-40％。在我国，缺血性脑卒中和出血性脑卒中的发病基本持平。缺血性卒中又进一步分为大血管阻塞性疾病，是由于动脉狭窄、管腔内逐渐形成血栓而最终阻塞动脉所致，称为脑血栓形成，其最常见的病因是动脉粥样硬化；小血管阻塞性疾病，是由于大脑小动脉逐渐狭窄而最终闭塞所致，管腔内既无血栓亦无栓子，称为腔隙性脑梗塞，高血压动脉硬化是最常见的原因；心源性脑卒中，是由于血栓脱落或其它栓子进入血流中阻塞脑动脉所引起，如房颤或冠心病患者心腔内的栓子脱落便可引起脑栓塞。出血性脑卒中根据出血部位的不同又分为脑出血和蛛网膜下腔出血。脑出血俗称“脑溢血”，是由于脑内动脉破裂，血液溢出到脑组织内。蛛网膜下腔出血则是脑表面或脑底部的血管破裂，血液直接进入含有脑脊液的蛛网膜下腔和脑室中。长期的原发性高血压和动脉粥样硬化是出血性卒中的主要原因。
研究脑卒中新的遗传危险因素意义重大大量的临床实践已证明，对已发生的脑卒中，无论如何完美的治疗，对其短时病死率和自然史的影响都不很理想。因此，对脑卒中的防制更应特别强调“预防为主”的方针，而寻找、确定脑卒中的危险因素(risk factor)，然后设法减少或清除这些危险因素的损害，则是预防脑卒中最基本的手段，也是降低卒中发病率与死亡率的主要公共卫生措施。存在危险因素的人，可称之为“卒中倾向个体”(stroke-prone individual)。检出这些个体，并告知他们减少危险因素损害的方法，是脑卒中预防工作的重要内容，也是危险因素研究的意义所在。
引起脑卒中的原因众多，如高龄、吸烟、饮酒、高血压、高血脂、高血糖、心脏病、凝血机制障碍等等，此外许多证据表明遗传因素在脑卒中的发病中有显著作用。寻找脑卒中的致病基因，从分子水平揭示脑卒中的发病机理，可为及早发现脑卒中的危险人群、预防脑卒中的发生提供有利手段。在脑卒中发病的遗传学研究中，候选基因的病例-对照研究是经典的方法。以这种方式在群体中抽取大样本进行分析和统计学处理，可以有效地确定染色体上与脑卒中发病相关的位置、位点，进而通过功能学分析确定其中的分子机制，为寻找药物的靶位点和进一步的药物筛选提供坚实的理论依据。
促血管生成素-1多态性及其与缺血性脑卒中的易感性关系作为本研究的候选基因，促血管生成素-1(Angiopoietin-1，AGP1)是1996年发现的特异作用于血管内皮细胞的生长因子，主要表达于血管旁细胞、血管平滑肌细胞和肿瘤细胞，是受体类酪氨酸激酶Tie-2的特异性配体，与血管内皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor，VEGF)在血管生成过程中有协同作用，促进血管重塑、成熟，维持血管的完整性和调节血管功能，并有维持成熟血管中内皮细胞的静息状态和血管的完整的作用。AGP1/Tie2还有阻止内皮细胞凋亡，促进血管损伤修复的功能。由于促血管生成素-1在血管内皮细胞的生长和发育过程中具有重要的调节作用，其对于血管生理具有不可忽视的影响。血管损伤时促血管生成素-1可辅助VEGF等促使内皮细胞聚集以利于血管损伤后的再内皮化。Wei L已经证明，在脑卒中过程中会发生血管生成的过程，并且血管生成对于卒中的治疗策略可能发挥着极为重要的作用。Mandriota等人研究发现促血管生成素-1基因的表达水平与脑卒中尤其是缺血性脑卒中有很大的相关性。由于3’非翻译区在基因表达的转录后调节过程中具有重要的作用，直接影响到相应mRNA的半衰期及蛋白的翻译效率，进而与相应基因的表达水平发生关联，因此，在已知的几个位于AGP1基因上的SNP位点中，2914C/G由于处于AGP1 mRNA的3’非翻译区而受到我们的关注。
单核苷酸多态性人类基因组中的序列变异主要由单核苷酸多态性(″SNP″)组成，其余序列变异是短串联重复(包括微卫星)、长串联重复(小卫星)和其它插入和缺失。SNP是群体中以可测频率(即＞1％)出现两个可替换碱基的位置。SNP被称为是″等位的″，因为由于此多态性的存在，一个物种的一些成员可能具有未突变序列(即，原始“等位基因”)，而其它成员可能具有突变序列(即变体或突变等位基因)。在最简单的情况下，可能仅存在一个突变序列，该多态性被称为二对等位基因多态性。可替换突变的发生可产生三对等位基因多态性等。SNP广泛存在于基因组中，改变基因功能的SNP可能直接有助于表型变异。由于它们的流行和普遍本质，SNP有潜力成为定位参与人类疾病情况的基因的重要工具，见如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，它公开了一个探索性研究，其中2,227个SNP被作图定位于一个2.3兆碱基的DNA区域内。
单核苷酸多态性和特定表型之间的关系不表示或需要SNP是该表型的原因。相反，这种关系可能仅表示SNP位于表型决定因子在基因组上的存在位置的附近，由此更可能被发现与这些决定因子关联和由此与感兴趣的表型关联。因此，SNP可能与“真正”的功能变异存在连锁不平衡(LD)。当基因组两个不同位置上的等位基因的相关性比期望的相关性更高时存在LD，又称作等位基因相关(allelicassociation)。因此，SNP可以用作标记，由于其接近引起特定表型的突变而具有价值。
本发明在以促血管生成素-1作为缺血性脑卒中易感候选基因的病例-对照研究中，通过对该基因2914多态性位点与缺血性脑卒中的关系进行关联研究，研究该位点C等位基因与缺血性脑卒中的相关性，从而确定中国人缺血性脑卒中病的易感基因。同时，根据本发明所鉴别的缺血性脑卒中相关SNP确定药物的靶位点，可以为后续的药物筛选提供指导性方针。
发明内容
本发明的一个方面，涉及用于检测促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的工具。在本发明的一个实施方案中中，所述工具可以是促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测促血管生成素-1的多态性位点2914C/G的多态性，或者(2)用于检测促血管生成素-1中多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，所述工具是限制性内切酶。
本发明的另一方面，涉及用于上述检测的试剂盒，其中至少一种上述的工具，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。
本发明的又一方面，涉及一种诊断患者缺血性脑卒中(包括脑血栓形成和/或腔隙性脑梗塞)的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的存在，其中2914CC基因型的携带者患脑血栓的相对危险度达1.448(CI 1.091～1.923)。
本发明的又一方面，涉及一种确定患者缺血性脑卒中(包括脑血栓形成和/或腔隙性脑梗塞)的易感性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的存在，其中2914C/G的基因型以G等位基因作对照，C等位基因可使脑血栓发病的危险性显著增加(OR 1.174，CI 1.027～1.342)。
本发明的再一方面，还涉及一种分析从患者分离的离体生物样品的方法，包括确定所述样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的核苷酸。在本发明的优选实施方案中，使用包括，但不限于，选自以下的差异核酸分析技术的试验用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性，检测所述样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的核苷酸的存在。
本发明的再一方面，还涉及一种微阵列，其中包含上述定义的促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的分型寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所述微阵列是DNA芯片的形式。
本发明的再一方面，还涉及检测生物学样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的存在的物质在制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者缺血性脑卒中(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞)的遗传易感性。在本发明中，所述物质选自用于检测促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的工具，例如，促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测促血管生成素-1的多态性位点2914C/G的多态性，或者(2)用于检测促血管生成素-1中多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸；能够特异识别促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的突变的抗体；和能够特异识别促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的引物或者探针或者限制性内切酶。
具体实施例方式
本发明利用促血管生成素-1作为缺血性脑卒中易感候选基因的病例的对照研究，对该基因2914多态性位点与缺血性脑卒中的关系进行了关联研究，根据统计学结果得出了该位点C等位基因与缺血性脑卒中的相关性。
促血管生成素-1基因位于染色体8q22.3-q23区，cDNA全长4338bp，NCBI RefSeq mRNA accession No.为NM_001146。
在本文中，促血管生成素-1基因序列和编码的蛋白质序列按照常规方法进行编号。转录起始位点的碱基编号为1。
本发明所提及的核酸序列和氨基酸序列中核苷酸和氨基酸残基的编号是指与NCBI RefSeq mRNA accession No.为NM_001146的序列或其编码的氨基酸序列相同位置(或编号)对应的核苷酸和氨基酸残基。
“对应”是指本发明核酸分子或者蛋白质的序列在与参考序列的cDNA序列所示序列最佳比对(alignment)后与该参考序列某位置相对的位置。因此，本发明核酸分子或者蛋白质“对应位置”或者“对应核苷酸”或者“对应氨基酸”不一定是与参考序列编号相同的位置、或者核苷酸或者氨基酸。
促血管生成素-1基因单核苷酸多态性位点“2914C/G”是指该基因第2914位多态性C和G。
单核苷酸多态性及其检测术语“患者”是指动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。
术语“多态性”广义上限定为包括已知发生在核苷酸序列中的所有变异，包括插入，缺失，置换和重复序列(包括二重重复)。
根据本发明的上述方法可通过使用用于检测单核苷酸变异的任何合适方法而得以施用，比如用质谱对PCR产物的直接质量分析，对侵入性切割产物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特异性扩增(即，ARMSTM-等位基因特异性扩增，ARMS指扩增受阻突变体系(amplification refractory mutationsystem))，ALEXTM(扩增受阻突变系统线性延伸(amplificationrefractory mutation system linear extension)和COPS(竞争性寡核苷酸引发系统)，等位基因特异性杂交(ASH)，寡核苷酸连接试验(OLA)，侵入者试验，DNA芯片分析和限制性片段长度多态性(RFLP)(综述参见基因组研究(Genome Research)，1998年，8卷，769-776页；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100页；人类突变(HumanMutation)，2001年，17卷，475-492页)。
携有所述多态性核酸的获自患者的样品可以方便地是从个体中获得的，包括但不限于血清、尿样、唾液、体液、(活检)组织样本等。这些样品可以预先进行纯化，例如分离总DNA。可以明了，样品同样可以是对应于试样中序列的核酸序列，也就是说，在等位基因变异分析前，核酸样品中的全部或一部分区域可先用任何一种方便的技术如聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)扩增。
显然，对于对本领域技术人员来说有大量的分析方法可被用于检测在本发明的一个或多个多态位置处变异核苷酸存在与否。一般来说，等位基因变异的检测需要突变辨别技术，任选地扩增反应和任选地信号生成系统。国际专利申请WO00/06768列出了许多扩增技术和突变检测技术，其中一些是基于PCR技术的。这些技术可和许多信号生成系统联合使用，可选的信号生成系统也被列于WO00/06768。
用于检测等位基因变异的许多现行方法综述于Nollau等，临床化学(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120页；在标准教科书例如“突变检测实验指南”(Laboratory Protocols for MutationDetection)U.Landegren编辑，牛津大学出版社，1996年和“PCR”第二版Newton & Graham编辑，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。
本发明涉及可被用做检测促血管生成素-1基因中多态性的诊断引物的等位基因特异性核酸引物，该诊断引物能够与在序列内于促血管生成素-1基因位点2914处包含多态性(例如促血管生成素-1基因位点2914C/G或者其反向互补序列)的核酸杂交。
等位基因特异性引物通常与恒定引物一起用于诸如PCR反应等扩增反应中，通过对位于一个特定序列位置处的一个等位基因的选择性扩增而使等位基因之间得以区分开来，例如用在ARMSTM试验中的引物。等位基因特异性引物的长度优选17-50个核苷酸，更优选大约17-35个核苷酸，最优选大约17-30个核苷酸。
优选地，等位基因特异性引物与待检测的等位基因完全地相对应，但是也可以考虑其衍生物，其中3’端大约有6到8个核苷酸与待检测的等位基因对应而不超过10个，比如不超过8，6，4，2或者1个剩余核苷酸在不显著影响引物特性的情况下可以发生变化。常常在第2和/或第3位(相对于3’端)的核苷酸被错配以优化差异引物结合和优先仅从正确的等位基因辨别引物延伸。
本发明还涉及用于检测促血管生成素-1基因中的多态性的寡核苷酸探针，该探针能特异地与在序列内包含位于促血管生成素-1基因位点2914位的多态性(例如促血管生成素-1基因位点2914C/G或者其反向互补序列)的核酸杂交。
术语“寡核苷酸探针”指长度至少有17个核苷酸的一种核苷酸序列，此序列与部分或全部的人类促血管生成素-1基因，特别是表达多态性的人类促血管生成素-1基因部分对应。优选长度17到50个核苷酸。一般来说这样的探针包含与基因中相应的野生型或变体座位完全互补的碱基序列。
然而，如果需要，可以引入一个或多个错配，前提是寡核苷酸探针的辨别能力不被过度影响。本发明的探针可以携有一个或多个标记以便于检测，比如在Moleaular Beacons中。
本发明还涉及一种用于检测促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的试剂盒，其包含至少一种促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G多态性分型寡核苷酸，或是限制性内切酶。本发明中所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测促血管生成素-1的多态性位点2914C/G的多态性，或者(2)用于检测促血管生成素-1中多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒中任选的含有适于所述检测反应的缓冲体系和显色体系。
在一些实施方案中，一种组合物含有用于同时探测两个或更多个多态性位点的寡核苷酸身份的两个或更多个不同标记的基因分型寡核苷酸。也可考虑含有两套或更多套等位基因特异性引物对以允许同时靶向和扩增含多态性位点的两个或更多个区域的引物组合物。
本发明的促血管生成素-1基因分型寡核苷酸也可以固定在固体表面或在固体表面合成，如芯片、珠或玻片(如见WO98/20020和WO98/20019)。这种固定的基因分型寡核苷酸可以用于各种多态性检测试验，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸试验。本发明的固定的促血管生成素-1基因分型寡核苷酸可以包括为同时快速筛选DNA样品在多个基因中的多态性而设计的有序寡核苷酸阵列。
本发明等位基因特异性寡核苷酸引物优选具有与特定SNP的仅一种核苷酸互补的3’末端核苷酸，或优选地3’倒数第二个核苷酸，由此只有存在含该核苷酸的等位基因时其才可以用作聚合酶介导的延伸反应的引物。与编码链或非编码链杂交的等位基因特异性寡核苷酸引物包括在本发明中。
本发明其它基因分型寡核苷酸与位于这里所述的多态性位点之一下游一个至几个核苷酸处的靶区域杂交。这种寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法中以检测这里所描述的多态性之一，因此这种基因分型寡核苷酸这里称作“引物延伸寡核苷酸”。在优选实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是与多态性位点紧临的核苷酸互补的脱氧核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括包装在分开容器中的至少两个基因分型寡核苷酸的试剂盒。该试剂盒也可以含有包装在分开容器中的其它成分如杂交缓冲液(此时寡核苷酸待用作探针)。可供选择地，当寡核苷酸待用于扩增靶区域时，该试剂盒可以含有包装在分开容器中的聚合酶和用于聚合酶介导的引物延伸如PCR的经优化反应缓冲液。
本发明还涉及一种诊断患者缺血性脑卒中(包括脑血栓形成和/或腔隙性脑梗塞)的体外方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的存在，其中2914CC基因型的携带者患脑血栓的相对危险度达1.448(CI 1.091～1.923)。
本发明还涉及一种确定患者缺血性脑卒中(包括脑血栓形成和/或腔隙性脑梗塞)的易感性的体外方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的存在，其中2914C/G的基因型以G等位基因作对照，C等位基因可使脑血栓发病的危险性显著增加(OR 1.174，CI 1.027～1.342)。
本发明还涉及一种分析从患者分离的离体生物样品的方法，包括确定所述样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的核苷酸。在本发明所述方法中，使用包括选自以下的差异核酸分析技术的试验用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。
在本发明所述方法中，其中所述来自患者的样品选自血清、尿样、唾液、体液和/或(活检)组织样本，任选的，所述样品可以预先进行纯化，例如分离总DNA。
本发明还涉及一种用于检测促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的微阵列，其中包含前述定义的促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的分型寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所述微阵列是DNA芯片的形式。
本发明还涉及检测生物学样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的存在的物质在制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者缺血性脑卒中(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞)的易感性。在本发明中，所述物质选自用于检测促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的工具，例如，促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测促血管生成素-1的多态性位点2914C/G的多态性，或者(2)用于检测促血管生成素-1中多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸；能够特异识别促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的突变的抗体；和能够特异识别促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的引物或者探针或者限制性内切酶。
以下实施例用于对本发明作进一步举例说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1。脑卒中患者和对照人群的入选本研究的样本来源于多中心合作的973项目高血压易患脑卒中的分子遗传机制。2000年12月至2001年12月，从位于兖州、西安、重庆、武汉、北京和天津6个地区的7个医疗中心收集脑卒中患者，同时在当地选择与之性别、年龄相匹配的对照组成1比1配对。脑卒中的诊断根据国际疾病分类标准，经过严格的神经学检查，颅脑CT或核磁共振检查确诊。每入选一个脑卒中病例，在同一个医院的眼科、消化科、耳鼻喉科或骨科的轻型病例中，或者在当地社区人群中选择没有神经科疾病的，年龄(±5岁)、性别相匹配者作为对照。
实施例2基因组DNA的提取以及血管生成素-1的多态性位点2914C/G的多态性的鉴别一.材料(一)生物材料人外周血(973课题经费收集)(二)工具酶及常用试剂1.酶类限制性内切酶Alu I，TaqI(大连TaKaRa公司)其它工具酶Taq DNA聚合酶(北京鼎国公司)2.常用试剂3.8％枸橼酸钠抗凝剂3.8g枸橼酸钠，加生理盐水至100ml，4℃冰箱保存备用。
溶血液8.29g NH4Cl，1.0g KHCO3，0.03734g EDTA-Na2，加水定容至1,000ml。
SE4.383g NaCl，9.306g EDTA-Na2，pH8.0，加水定容至1,000ml。
10％SDS10.0g SDS溶于90ml水中，调pH7.2，加水定容至100ml。
TE10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA-Na2(pH 8.0)6)50 X TAE电泳缓冲液242.0g Tris-HCl，27.5ml冰乙酸，100ml 0.5mM EDTA-Na2，终体积1升。
二.方法(一)采用盐析法从白细胞中提取DNA(二)聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增目的片段1.引物序列
Coelenterazine-非依赖型真核荧光素酶
表3Coelenterazine-非依赖型真核荧光素酶还可以根据某些荧光素酶的底物专一性区分各种荧光素酶。最重要的底物包括Coelenterazine(Jones等1999)和荧光素，以及这两种物质的衍生物。下面示出了这两种底物及其通过荧光素酶进行的转化的示意图荧光素酶底物下面通过举例形式示出了某些荧光素酶底物及其转化。本文所示出的所有底物是通过酶促转化的，同时释放出光和二氧化碳(CO2)并且消耗氧气(O2)。所述反应对辅因子或能量载体(例如，对于萤火虫荧光素酶来说是ATP)的依赖性是酶专一性的。
Coelenterazine
水母蛋白在将Coelenterazine转化成Coelenteramide时，会发出波长为470纳米的光线。
实施例3基因型分析结果的统计学分析采用χ2检验和非配对t检验分别比较脑卒中卒和对照组之间的计数和计量资料。单因素方差分析比较多组间计量资料。用χ2检验对基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验。基因型和等位基因频率比较用SPSS10.0软件包2×2列联表进行χ2检验。计算基因型与脑卒中的OR值。
结果1.研究人群的临床特点(参见表1)表1。
可见，病历组与对照组间在年龄构成、血压、血脂水平、血糖等方面均有显著差异(P＜0.05)。在体重指数，性别组成上，对照组和病历组之间差异不显著。在缺血性脑卒中的2个亚型的病例中，罹患高血压和糖尿病的患者比例高于对照组(P＜0.05)。
2.多态性位点2914C/G的基因型频率在各组之间的分布(参见表2)表2
三种基因型的分布在脑血栓和腔隙性脑梗塞中的分布与对照组均有差异(P＜0.05)，脑血栓组的等位基因频率与对照组间的差异显著(P＜0.05)。在未考虑缺血性脑卒中传统危险因子的情况下，以G等位基因作对照，C等位基因可使脑血栓发病的危险性显著增加(OR1.174，CI 1.027～1.342)。
3.多因素Logistic回归分析基因多态性与其它危险因素和脑卒中的关联性Logistic多元回归分析了缺血性脑卒中卒中年龄、性别、体重指数、总胆固醇、甘油三脂、高血压、吸烟、糖尿病史、高血压家族史、脑卒中家族史和AGP1基因2914 CG和CC基因型对缺血性脑卒中的相对危险度。
(1)脑血栓病例组在传统的缺血性脑卒中危险因素中，高甘油三酯、高血压、吸烟以及糖尿病会导致缺血性脑卒中危险度显著增高。而与GG基因型比较后，CC基因型的携带者患脑血栓的相对危险度达1.448(CI 1.091～1.923)，结果见表3。
表3
(2)腔隙性脑梗塞组在不分层的情况下调整各传统危险因素后，未发现2914多态性位点与腔梗发病发生关联。但进一步性别分层后，本研究发现，2914CC基因型是腔隙性脑梗塞发病的独立的危险因素。
男性多元Logistic回归分析腔梗的独立危险因素的结果如下表4所示
表4
由以上结果可见，在促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G在中国人群中确实与缺血性脑卒中相关。本研究作为第一个针对此SNP与缺血性脑卒中的关联研究，确立了这个多态性位点与脑血栓、腔隙性脑梗塞的联系，为以后的药物靶点选择和药物筛选提供了理论依据。
权利要求
1.用于鉴别促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的工具。
2.权利要求1的工具，它是促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G多态性分型寡核苷酸，优选地，所述多态性分型寡核苷酸是(1)等位基因特异性核酸引物，它能够检测促血管生成素-1的多态性位点2914C/G的多态性，或者(2)用于检测促血管生成素-1中多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的核酸杂交，优选地，寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。
3.根据权利要求2的工具，其是限制性内切酶。
4.一种试剂盒，其包含至少一种权利要求1-3中任一项的工具，以及，任选的，用于检测反应的合适的缓冲体系和显色体系。
5.诊断患者缺血性脑卒中(包括脑血栓形成和/或腔隙性脑梗塞)的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的存在，其中2914CC基因型的携带者患脑血栓的相对危险度达1.448(CI 1.091～1.923)。
6.确定患者缺血性脑卒中(包括脑血栓形成和/或腔隙性脑梗塞)的易感性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的存在，其中2914C/G的基因型以G等位基因作对照，C等位基因可使脑血栓发病的危险性显著增加(OR 1.174，CI 1.027～1.342)。
7.分析从患者分离的离体生物样品的方法，包括确定所述样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的核苷酸。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中使用包括选自以下的差异核酸分析技术的试验用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。
9.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述来自患者的样品选自外周血细胞、白细胞、血清、尿样、唾液、体液和/或(活检)组织样本，任选的，所述样品可以预先进行纯化，例如分离总DNA。
10.一种微阵列，其中包含权利要求2所定义的促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的分型寡核苷酸。
11.权利要求10的微阵列，它是DNA芯片的形式。
12.检测生物学样品中促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的存在的物质在制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者缺血性脑卒中(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞)的遗传易感性。
13.权利要求12的用途，其中所述物质选自权利要求1-3的工具；能够特异识别促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的突变的抗体；和能够特异识别促血管生成素-1上的多态性位点2914C/G的引物或者探针或者限制性内切酶。
全文摘要
本发明涉及确定患者缺血性脑卒中(特别是包括脑血栓形成、腔隙性脑梗塞)的易感性的方法。具体地，本发明方法包括确定促血管生成素－1上的多态性位点2914C/G。本发明还涉及用于该方法的物质、组合物、试剂盒及其用途。
文档编号C12Q1/68GK1847407SQ20051006590
公开日2006年10月18日 申请日期2005年4月15日 优先权日2005年4月15日
发明者惠汝太, 张陆, 马丽娜, 石毅, 孙凯, 张春玲, 刘晓宁 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院