专利名称：D－氨甲酰水解酶的突变体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体内容涉及D-氨甲酰水解酶的突变体及其在生产D-对羟基苯甘氨酸中的应用。
背景技术：
β-内酰胺类抗生素具有抗菌活力强，广谱低毒等优点，是临床控制细菌感染的首选药物之一。D-对羟基苯甘氨酸(DHPG)是合成该类药物的一种重要中间体，用于制备羟氨苄青霉素和羟氨苄头孢菌素的侧链。D-对羟基苯甘氨酸的制备在工业上有化学合成法和酶法两种方法，其中化学合成法成本高，污染大；而酶法具有成本较低、无污染的特点，因此日益受到重视。酶法的技术原理是用D-乙内酰脲酶(也称为D-海因酶)将DL-对羟基苯海因不对称水解成N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸，然后在N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶(也称为D-氨甲酰水解酶，简称DCase)的作用下，将N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸不可逆水解转变成DHPG。
工业生产中发现在两步酶法生产D-对羟基苯甘氨酸的过程中，由于DCase催化效率低、稳定性差的缺点，导致中间物N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸大量积累，终产物D-对羟基苯甘氨酸产率低。因此DCase成为两步酶法反应系统中的一个关键酶、限速酶。
随着基因工程技术的发展，大肠杆菌表达系统的日臻成熟，将DCase基因在大肠杆菌表达系统中进行过量表达，从而获得高表达、高活力的基因工程菌株成为可能。例如，许祯等从一株能将DL-对羟基苯海因转化为D-对羟基苯甘氨酸的菌株中，成功克隆出DCase基因，Genebank登陆号为AF320814(许祯等，生物工程学报，2002，18(2)149-54)。我们在将DCase基因构建入pET表达系统，转化E.coli过量表达后，对目的蛋白的活性和SDS-PAGE进行分析，结果显示E.coli可以大量表达出重组蛋白，但是70-80％左右的重组蛋白是以包涵体的形式存在，严重地影响了工程酶的功能发挥。如何使更多的目的蛋白表达后能够正确折叠成为有活力的蛋白成为研究和努力的方向。
虽然天然酶分子在自然条件下已进化了千百万年，但是因为天然酶分子存在的环境与实际应用的环境不同，酶分子仍然蕴藏着巨大的进化潜力。运用分子定向进化技术比如易错PCR技术(error-prone PCR)、DNA改组(DNA shuffling)技术和定点突变技术等对微生物来源的酶进行分子改性和人工进化在近些年中取得了令人瞩目的进展(参见王正祥等，生物工程学报，16(3)，2000)，已经成为酶的人工定向进化常用手段。这种分子水平上的人工定向进化技术是通过体外重组来改造靶基因，并定向筛选具有预期性状的突变体，从而创造具有新功能的改性的酶，大大加速了蛋白质的进化进程。
发明内容
本发明的目的就在于通过定向进化技术对目的基因进行随机突变，并用高通量的筛选方法，获得可溶性表达提高的D-氨甲酰水解酶突变体。
本发明的另一个目的在于提供所述D-氨甲酰水解酶突变体在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
为达到上述目的，本发明使用易错PCR技术和DNA改组技术相结合的方法对DCase基因进行随机突变，再通过一种蛋白质可溶性监测系统将正突变检出。
本发明采用一种蛋白质可溶性监测系统(W.Christian Wigley etc.2001 NatureBiotechnology 19，131-136)检测重组蛋白的可溶性。该监测系统是建立在β-半乳糖苷酶的α互补的结构基础上，通过载体上融合的β-半乳糖苷酶的α片段与大肠杆菌中ω片段实现互补来检测目的蛋白的可溶性。
通过上述方法，本发明人筛选得到了3个重组蛋白可溶性表达增加的突变体，分别为A18T、Y30N和K34E。
D-氨甲酰水解酶的Genebank登陆号为AF320814，由304个氨基酸组成，其编码DNA序列包括915bp，其编码DNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。本发明所获得的3个突变体与DCase的区别分别为1、A18T的第18位的氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸，相对应地，其编码DNA序列中52-54bp的GCG变为ACG；2、Y30N的第30位的氨基酸由酪氨酸突变为天冬酰胺，相对应地，其编码DNA序列中88-90bp的TAC变为AAC；3、K34E的第34位的氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸，相对应地，其编码DNA序列中100-102bp的AAA变为GAA。
在获得上述3种突变体之后，发明人进一步将上述3个突变体进行叠加突变，获得一个新的突变体A18T/Y30N/K34E，该叠加突变酶的第18位的氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸，第30位的氨基酸由酪氨酸突变为天冬酰胺，第34位的氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸。相对应地，其编码DNA序列中52-54bp的GCG变为ACG，88-90bp的TAC变为AAC，100-102bp的AAA变为GAA。
相比于野生型Dcase，本发明的4个突变体A18T、Y30N、K34E和A18T/Y30N/K34E的每毫升发酵菌体的酶活分别提高1倍、1.5倍、4.7倍和8.4倍；可溶性表达分别是野生酶的1.3、1.4、1.9、3.2倍，其中尤以叠加突变体为最佳，显示出在D-对羟基苯甘氨酸生产中的潜在应用价值。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。
实施例1、DCase基因的克隆1.1、PCR扩增设计一对引物5’-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3’；和5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3’以质粒pXZ-total(许祯等，生物工程学报，2002，18(2)149-54)DNA为模板，进行PCR扩增。PCR条件为94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
1.2、含DCase基因的质粒构建PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，接着按照宝生物公司(网址www.takara.com.cn)2005-2006产品目录说明书描述的方法，将所获得的DNA片段和载体pET-28b(Novagen公司)用限制性内切酶NdeI和HindIII进行双酶切。
酶切产物再次进行电压为100伏的核苷酸电泳，回收相应大小分别为900bp、5300bp左右的片段和载体，最后将载体和片段按1∶4的比例混合后，加入1个单位的T4连接酶，16℃连接10小时以上。
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选，重组子经过Nde I和HindIII双酶切和DNA测序验证，得到基因序列正确的克隆，其序列如SEQ ID NO.1所示，与Genebank登陆号为AF320814的DCase基因相同，称为野生型，将其命名为WT。
1.3、表达DCase的基因工程菌株构建用常规方法(郝福英等编著，分子生物学实验技术，北京大学出版社，1998，第12-15页)将WT转化入E.coli BL21(Novagen公司)，即获得DCase基因的大肠杆菌表达菌株。
实施例2、DCase基因的随机突变2.1、易错PCR100μl易错PCR反应体系为20ng的DNA模板pXZ-total，各30pmol的一对引物5’-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3’和5’-CCCAAGCTTGAGTTCCGCGAT-3’，7mMMgCl2，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，0.01％gelatin，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，0.15mM MnCl2，和5个单位的Taq酶(上海sangon公司)。
PCR反应条件为94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
2.2、DNA改组使用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)纯化PCR产物。按照文献(StemmerWPC.Nature，1994，370(6488)389.)所述的方法，将获得的DNA片段进行DNA改组，包括降解DNA、回收50-200bp的小片段、无引物PCR、有引物PCR。
经过DNA改组后获得的DNA重组片段，按照宝生物公司2005-2006产品目录说明书描述的方法，用Nde I和HindIII双酶切消化后，与经过相同酶切的pMAL-c2x(NEB公司)载体进行连接反应，反应条件为载体和片段按1∶4的比例混合，加入1个单位的T4连接酶，16℃连接过夜。得到了超过104个克隆的突变体库。
实施例3、突变体库的筛选3.1、突变体转化通过电击的方法将步骤2.2中构建得到的突变体转化到DH5α菌株中。转化细胞涂布于含Ampr抗生素、IPTG诱导剂和显色底物X-gal的LB平板上(蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％、琼脂2％)，37℃培养。
3.2、突变体筛选与鉴定菌株生长16h后，挑取每块平板上蓝色深的克隆，用小量质粒抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)抽提质粒，使用Nde I和HindIII进行双酶切鉴定和测序测定。
3.3、突变体基因扩增设计一对引物5’-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3’；和5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3’以步骤3.2中所获的突变体质粒为模板，进行PCR扩增。
PCR条件为94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
3.4、含Dcase突变基因的质粒构建PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，接着按照宝生物公司(网址www.takara.com.cn)2005-2006产品目录说明书描述的方法，将所获得的DNA片段和载体pET-28b(Novagen公司)用限制性内切酶Nde I和HindIII进行双酶切。
酶切产物再次进行电压为100伏的核苷酸电泳，回收相应大小分别为900bp、5300bp左右的片段和载体，最后将载体和片段按1∶4的比例混合后，加入1个单位的T4连接酶，16℃连接10小时以上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选，重组子经过Nde I和HindIII双酶切和DNA测序验证，得到正确的含Dcase突变基因的质粒。
3.5、DCase突变体的菌株构建与表达用常规方法(郝福英等编著，分子生物学实验技术，北京大学出版社，1998，第12-15页)将含Dcase突变基因构建的质粒转化E.coli BL21(Novagen公司)，获得突变体的大肠杆菌表达菌株。
将构建获得的大肠杆菌表达菌株先在LB试管中(蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％)培养过夜，按1％体积比的接种量接于装有30ml LB液体培养基的250ml摇瓶中，生长至OD600≈0.6，然后加入0.3mM的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导表达，放于200转/分钟的摇床，培养过夜。
4000转/分钟，离心10分钟，收集菌体并悬浮在PBS缓冲液中，经超声波破碎处理，离心，取上清，沉淀物进行SDS-PAGE分析。
3.6、筛选结果通过上述筛选步骤，从突变体库中，筛选获得了3个重组蛋白可溶性表达增加的突变体。它们分别是A18T、Y30N和K34E，其可溶性表达量如表1所示，分别是野生酶的1.3、1.4和1.9倍。
表1、野生型DCase和4个突变体的重组蛋白可溶性表达比较
3.7、突变体测序经对三个突变体的氨基酸序列和基因序列进行测定，发现与野生型D-氨甲酰水解酶相比，分别是3个位置的氨基酸发生了变化，相应的编码DNA也发生了改变，具体如表2所示表2、三个DCase突变体的氨基酸序列和基因序列变化结果
实施例4、三个突变位点的叠加4.1、PCR扩增以含有K34E突变的DCase基因为模板，分别使用引物对5’-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3’；和5’-GCGTGTCTCCGTGCGCGCGAT-3’；另一引物对5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3’；和5’-ATCGCGCGCACGGAGACACGC-3’；进行PCR扩增。
PCR条件为94℃变性10min后，94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
42、回收PCR产物PCR扩增结束后，先使用1.5％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收50bp、850bp左右的DNA片段。
4.3、再次PCR扩增以步骤4.2中所回收的两个片段为模板，使用引物对5，-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3’；和5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3’；进行PCR扩增。
PCR条件为94℃变性6min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
4.4、PCR产物测序PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，测序。
经测序显示，所得D-氨甲酰水解酶的突变体是A18T和K34E的突变点融合突变体，即野生型DCase的DNA序列中52-54bp的GCG变为ACG，100-102bp的AAA变为GAA。
4.5、再次PCR扩增以步骤4.4中所得的A18T/K34E突变体的DNA为模板，分别使用引物对5’-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3’；和5’-CGTCAGCATGTTGAGAAGACGAA-3’；另一对引物5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3’；和5’-TTCGTCTTCTCAACATGCTGACG-3’进行PCR扩增。
PCR条件为94℃变性10min后，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
4.6、回收PCR产物PCR扩增结束后，先使用1.5％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收90bp、800bp左右的DNA片段。
4.7、再次PCR扩增以步骤4.6所回收的上述两个片段为模板，使用引物对5’-CGCCATATGACACGTCAGATGATA-3’；和5’-CCCAAGCTTTCAGAGTTCCGCGAT-3’进行PCR扩增，PCR条件为94℃变性6min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共进行30循环，最后72℃充分延伸10min。
4.8、PCR产物测序PCR扩增结束后，先使用1％的琼脂糖凝胶进行电压为100伏的核苷酸电泳，割胶后，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，测序。
经测序显示，所得D-氨甲酰水解酶的突变体是A18T、Y30N和K34E的突变点融合突变体，即野生型DCase的DNA序列中52-54bp的GCG变为ACG，88-90bp的TAC变为AAC，100-102bp的AAA变为GAA。
4.9、A18T/Y30N/K34E突变体的构建按照宝生物公司2005-2006产品目录说明书描述的方法，将步骤4.8中所获得的DNA片段和载体pET-28b(Novagen公司)经限制性内切酶Nde I和HindIII双酶切，再次进行电压为100伏的核苷酸电泳，用胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收900bp、5300bp左右的片段和载体。
将载体和片段按1∶4的比例混合后，加入1个单位的T4连接酶，16℃连接10小时。
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选，重组子经过Nde I和HindIII双酶切和DNA测序验证，最终获得3点突变的克隆，命名为A18T/Y30N/K34E。
实施例5、突变体可溶性表达对比按照步骤3.5中所述的方法，测定野生型和D-氨甲酰水解酶突变体(A18T、Y30N、K34E和A18T/Y30N/K34E)可溶性情况，结果见表1。试验表明，多个突变叠加的D-氨甲酰水解酶突变体相比单个突变体，重组蛋白可溶性表达进一步增加，且都优于野生型。比如，A18T/Y30N/K34E的可溶性表达蛋白比例高达81.4％，是野生酶的3.2倍，即包涵体的比例仅为18.6％。因此在D-对羟基苯甘氨酸的生产中这4个突变体都具有潜在的应用优势。
实施例6、野生型酶和突变型酶的单位菌体酶活比较6.1、菌体(粗酶)制备分别取实施例5中发酵培养的菌体(A18T、Y30N、K34E和A18T/Y30N/K34E)各1ml，加入1.5ml的离心管中，离心，弃上清。在-20℃冰箱冻存2小时以上，备用。
6.2、酶促水解反应各菌体分别悬浮于1ml的0.1M、pH7.5的磷酸缓冲液中，取400ul的悬浮液，加入400μl的100mM的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸底物，进行水解反应。在40℃的水浴摇床，以150转/分钟的速度振荡。
反应30分钟后，加入800μl的10％盐酸中止反应。
6.3、酶活测定取适量反应液进行稀释后，13000转/分钟离心5分钟，取上清进行HPLC测定。
HPLC测定D-氨甲酰水解酶的方法是以含磷酸2.25mM，磷酸二氢钾20mM，pH5.0的甲醇与水为流动相，其比例是20∶80，流速为1.0ml/min，在210nm处检测不同含量物质以及相同物质的不同峰高和保留值，绘制出标准曲线。
1U酶活定义为每分钟产生1微摩尔D-对羟基苯甘氨酸所需的酶量。
6.4、菌体酶活比较酶活测定结果见表3表3、野生型DCase和4个突变体的单位菌体酶活比较
相比于野生型D-氨甲酰水解酶，突变酶A18T、Y30N、K34E和A18T/Y30N/K34E的单位菌体的酶活分别提高1倍、1.5倍、4.7倍和8.4倍，其中叠加突变酶的优势尤其明显。
上述实施例显示，4个突变酶在可溶性表达和单位菌体酶活方面都优于野生型，同时也进一步表明，突变叠加具有很大潜力，采用定向进化技术改造工业用酶是一个十分有效的手段。
此外应理解的是，在阅读了本发明的讲述内容之后，在不偏离本发明之精神和范围的前提下，本领域技术人员对本发明作任何修饰或修改都是应包括在本申请所附权利要求书所限定的范围之内。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>D-氨甲酰水解酶的突变体及其应用<130>051644N<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>915<212>DNA<213>Ralstonia pickettii<220>
<221>CDS<222>(1)..(915)<400>1atg aca cgt cag atg ata ctt gca gtg gga caa caa ggt ccg atc gcg 48Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala1 5 10 15cgc gcg gag aca cgc gaa cag gtc gtc gtt cgt ctt ctc tac atg ctg 96Arg Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Val Arg Leu Leu Tyr Met Leu20 25 30acg aaa gcc gcg agc cgg ggc gcg aat ttc att gtc ttc ccc gaa ctc 144Thr Lys Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu35 40 45gcg ctt acg acc ttc ttc ccg cgc tgg cat ttc acc gac gag gcc gag 192Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu50 55 60
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权利要求
1.一种D-氨甲酰水解酶的突变体，其特征在于，具有以下任一项所述的氨基酸序列A、SEQ ID NO2所示的D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第18位的丙氨酸突变为苏氨酸；B、SEQ ID NO2所示的D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第30位的酪氨酸突变为天冬酰胺；C、SEQ ID NO2所示的D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第34位的赖氨酸突变为谷酰胺；D、SEQ IDNO2所示的D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第18位的丙氨酸突变为苏氨酸，第30位的酪氨酸突变为天冬酰胺，且第34位的赖氨酸突变为谷酰胺。
2.如权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶的突变体，其特征在于，该突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO2所示的D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第18位的丙氨酸突变为苏氨酸，第30位的酪氨酸突变为天冬酰胺，且第34位的赖氨酸突变为谷酰胺。
3.编码权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体的DNA序列。
4.如权利要求3所述的DNA序列，其特征在于，具有以下任一项所述的DNA序列A、SEQ ID NO1所示的D-氨甲酰水解酶的基因序列中第52-54bp的GCG突变为ACG；B、SEQ ID NO1所示的D-氨甲酰水解酶的基因序列中第88-90bp的TAC突变为AAC；C、SEQ ID NO1所示的D-氨甲酰水解酶的基因序列中第100-102bp的AAA突变为GAA；D、SEQ ID NO1所示的D-氨甲酰水解酶的基因序列中第52-54bp的GCG突变为ACG，第88-90bp的TAC突变为AAC，且第100-102bp的AAA突变为GAA。
5.如权利要求4所述的DNA序列，其特征在于，该DNA序列为SEQ ID NO1所示的D-氨甲酰水解酶的基因序列中第52-54bp的GCG突变为ACG，第88-90bp的TAC突变为AAC，且第100-102bp的AAA突变为GAA。
6.如权利要求1或2所述的D-氨甲酰水解酶突变体在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
7.如权利要求3所述的D-氨甲酰水解酶突变体的编码基因在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将如权利要求3所述的DNA序列克隆入宿主细胞，并将该宿主细胞的发酵菌体用于D-对羟基苯甘氨酸的生产。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌E.coli BL21。
全文摘要
本发明公开了D－氨甲酰水解酶的四个突变体及其在生产D－对羟基苯甘氨酸中的应用，属于生物工程领域。通过定向进化技术获得的突变酶1的第18位的氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸，突变酶2的第30位的氨基酸由酪氨酸突变为天冬酰胺，突变酶3的第34位的氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸，在此基础上进行了三个位点叠加突变，获得突变酶4。这四个突变酶具有更高的可溶性表达水平，并在D－对羟基苯甘氨酸的生产中表现出更高的酶活力。
文档编号C12N15/55GK1995336SQ20061002314
公开日2007年7月11日 申请日期2006年1月6日 优先权日2006年1月6日
发明者姜卫红, 姜世民, 杨蕴刘, 杨晟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院