鉴定生物药物中与免疫原性相关表位的方法

专利名称：鉴定生物药物中与免疫原性相关表位的方法
促成生物疗法免疫毒性的一个方面是其免疫原性。具有免疫原性的生物药物在临床试验中会产生导致效力丧失和不利事件如过敏反应、输液反应或自身免疫性的抗体。产生免疫原性的可能性取决于蛋白质药物序列中T细胞表位的存在。本发明涉及在诱导生物药物(例如抗体或其它治疗性蛋白质)免疫原性中起因果作用的表位的体外鉴定方法。更加具体而言，本发明的方法可用于鉴定经树突状细胞(其激发导致免疫原性的免疫反应)的肽受体递呈的免疫原性肽的序列。对免疫原性表位的认识使得可以通过定点诱变降低治疗性多肽的风险，其目的在于产生无免疫原性生物药物。
本发明涉及用于鉴定可能赋予蛋白质免疫原性表位的方法。迄今为止，所用的方法依赖计算机(in silico)预测算法、T细胞活化分析或动物接种模型中重叠的成肽的体外筛选。该方法基于从经各个药物蛋白质负载的人树突状细胞中分离免疫原性肽以及对该药物蛋白质潜在T细胞表位序列的鉴定。本发明方法可用于鉴定工程化多肽、抗体或其它治疗性蛋白质中含有的免疫原性表位。
几乎任何治疗性蛋白质在临床试验中呈现一定程度的免疫原性。免疫原性的初次激发为CD4+T淋巴细胞在对各个治疗性蛋白质的肽片段识别基础上的活化。这些肽称作“T细胞表位”，或简称作“表位”。
只有当T细胞表位由主要组织相容性复合物(MHC)编码的分子递呈时才能实现CD4+T细胞的活化。在人体中，MHC分子称为人白细胞抗原(HLA)。HLA结合肽较短，包含9-25个氨基酸(Kropshofer，H.和Vogt，A.B.，Immunol Today 18(1997)77-82)。
根据其功能，可区分两类MHC-肽复合物(Germain，R.，Cell 76(1994)287-299)(i)MHC I类-肽复合物可由几乎所有的有核细胞表达，以吸引可裂解感染细胞或肿瘤细胞的CD8+细胞毒性T细胞，(ii)MHC II类-肽复合物仅仅在所谓的抗原递呈细胞(APC)上组成型表达，例如B淋巴细胞、巨噬细胞或树突状细胞(DC)。具体而言，DC具有使CD4+T辅助细胞致敏的能力从而启动免疫原性(Banchereau，J.和Steinman，R.M.，Nature 392(1998)245-254)。
因此，用于鉴定治疗性蛋白质中免疫原性热点的本创新方法为使用经选择生物药物负载的DC并确定与DC上的MHC II类分子结合的肽的序列。为了以适用于全部人群的方式确定生物药物的潜在免疫原性，不得不使用来自一系列供血者的DC，其代表着各个群体MHC II类基因型的多样性。
本发明提供用于分离和鉴定源自药物蛋白质的飞摩尔量潜在免疫原性肽抗原的方法。所述方法涉及治疗性蛋白质(如多肽、单克隆抗体或其它蛋白质)的免疫原性监测。本发明方法的优势在于可通过从健康供体常规量外周血获得的少量树突状细胞来对所结合和/或递呈肽进行鉴定。所述方法可以确保所分离和鉴定的免疫原性肽是由DC在遇到治疗性蛋白质时体内天然加工和递呈的那些肽。
方法本发明提供用于分离和鉴定赋予生物药物在施用于人之后具有免疫原性的肽的方法。本方法提供0.1至5μg量、优选0.2至3μg量的肽受体与潜在免疫原性肽的复合物。该量与正常情况下从获自病人或健康供体外周血的DC细胞可得到的物质的量相当。现有技术中需要的物质最低量为约200μg的源自非限制性来源(近交系小鼠)的MHC II类分子(Dongre A R等，EJI 2001，31，1485-94)。这比从人外周血获得的物质高两个数量级。
具体地，本发明提供用于鉴定与免疫原性有关的肽的方法，其包括步骤a)提供以0.1-5μg、优选0.2-3μg的量表达抗原递呈受体(APR)的细胞，
b)将来自(a)的细胞与免疫原性肽源接触，c)从细胞分离APR-免疫原性肽复合物，d)从APR洗脱所结合的肽，e)鉴定免疫原性肽，f)鉴定为表位的免疫原性肽。
优选地，用于鉴定与免疫原性有关的肽的方法包括步骤a)提供以0.1-5μg、优选0.2-3μg的量表达抗原递呈受体(APR)的细胞，b)将来自(a)的细胞与免疫原性肽源接触，c)通过免疫沉淀或免疫亲合层析从细胞分离APR-免疫原性肽复合物，d)用水或低盐缓冲液洗涤ARP与抗原性肽的结合复合物，e)从APR洗脱所结合的肽，f)鉴定免疫原性肽，g)验证被鉴定为表位的免疫原性肽。
优选地，抗原递呈受体是MHC II类分子。
此外，本发明提供降低多肽免疫原性的方法，其包括a)如上所述鉴定多肽的免疫原性肽，b)修饰多肽的相应表位，以降低或消除APR分子的结合，c)由此产生具有降低免疫原性潜能或无免疫原性潜能的突变多肽。
本文所用的术语“多肽”指相连的氨基酸链。
本文所用的术语“免疫原性”指能激起针对物质的免疫应答的物质特性。对该物质能力的测量在于激发针对其的免疫应答。
本文所用的术语“免疫原性潜能”指多肽引发免疫应答的潜在能力。
本文所用的术语“免疫应答”指可识别入侵物质并产生抗该抗原特异性抗体的机体防御反应。
为获得例如100ng MHC II类分子所必需的组织或体液量依赖于表达MHC II类分子的细胞数量和MHC II类分子的表达速率如100ng MHCII类分子与来自约50ml血液的约2×105个成熟DC或5至10×106个外周血单核细胞或约5×107个外周血单个核细胞相当。
鉴定MHC II类分子结合肽所需的高灵敏度可以通过以下事实解释，即这些肽受体的每一类型(如人MHC II类基因产物HLA-DR1)可携带约500至1000种不同的抗原肽(Chicz R M等，J Exp.Med.1993，178，27-47；Chicz R M和Urban R G，Immunol.Today，1993，15155-160)。然而，在500至1000种不同的肽当中，大多数仅达到很低的拷贝数，因此不太可能发挥生理作用。特别是在MHC II类中，那些免疫相关肽(如激活辅助T细胞并因此促进药物蛋白质免疫原性的那些肽)可达到中等拷贝数至高拷贝数(Latek R R和Unanue E R，Immunol.Rev.1999，172209-228)。这些肽占从MHC II类分子洗脱肽物质总量的约40％至50％，并等于约10至20种单个肽。
许多MHC II类分子结合肽代表着一组2-5个C末端和N末端截短变体(Rudensky A Y等，Nature 1992，359，429-431；Chicz等，Nature 1992，358764-768)，该些变体具有被T细胞受体识别所必需的大约10-13个氨基酸的共同核心序列。这些截短或延长的变体构成同一T细胞表位。这表示重要的不同表位的数目实际上更少，约5-70个不同的表位。因此免疫原性表位的丰度范围为0.2％-5％。
肽的来源本发明的抗原肽是与人DC表面的MHC II类分子结合的肽。抗原肽可结合胞内或胞外MHC II类分子。本文所用的术语“免疫原性肽”指引发免疫应答的抗原肽。免疫原性肽源自与DC共孵育后的多肽。免疫原性肽可能来源的多肽是包括治疗性多肽在内的多肽，例如细胞因子(即干扰素、白细胞介素、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞/巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)或肿瘤坏死因子(TNF))、趋化因子、生长因子、抗体(即单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体或人源化)、酶、结构成分、激素和其片段。
由于所有这些肽受体能容纳广泛多样的肽配体(参见上文)，所以必须要确定序列的每种单个肽仅有飞摩尔的量。1μg MHC II类分子(16pmol)可携带各种单个肽占主要肽种类的0.1-2％(这等于约16-320飞摩尔)。本发明方法允许从0.1-5μg荷肽抗原递呈受体分离飞摩尔量的这些潜在免疫原性肽并且随后对它们测序。
抗原递呈受体的来源本文所用的术语“抗原递呈受体”或“APR”指结合抗原肽并将它们递呈至其它免疫细胞并由此介导特异性体液免疫应答的肽受体。优选抗原递呈受体是MHC II类分子。MHC II类分子包括但不限于HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP分子。备选地，起作用的APR是CD1家族的受体或其它迄今为止不明确的能向CD4+辅助T细胞递呈潜在免疫原性肽的受体。
细胞材料的来源本发明方法包括表达抗原递呈受体并同时使CD4+T细胞致敏或活化的所有细胞。这些细胞也称为抗原递呈细胞(APC)(Unanue，E.R.Macrophages，antigen presenting cells and the phenomena of antigenhandling and presentation.在Fundamental Immunology，第2版，(编者Paul，W.E)New York，Raven Press，1989)。所用的APC包括人B细胞、人巨噬细胞、优选人树突状细胞。除此之外，可使用含有APC的细胞混合物，例如外周血单个核细胞(PBMC)或外周血淋巴细胞(PBL)。
优选的APC是表达MHC II类分子的细胞。甚至更优选的APC是树突状细胞。
为了判断多肽在特定人群中的免疫原性，使用一系列HLA型树突状细胞，HLA型代表了整个群体的HLA频率。例如，为了在HLA-DR基因座的HLA多态性方面覆盖高加索人群，必须用源自约15-20个HLA-DR基因型不同的血液供体的树突状细胞分析潜在免疫原性肽。
来自细胞的抗原递呈受体的溶解作用为了纯化来自细胞的抗原递呈受体-肽复合物，必须将细胞膜溶解。用本领域公知方法实施细胞裂解，例如冻融和使用去污剂及其组合。优选的裂解方法是用去污剂溶解，去污剂优选TX-100、NP40，n-辛基葡糖苷、Zwittergent、Lubrol、CHAPS、最优选TX-100或Zwittergent 3-12。通过离心从含有溶解的受体-肽复合物的细胞裂解液中去除细胞碎片和核。因此，在本发明另外的实施方案中，使用包括去污剂溶解的方法将抗原递呈受体与免疫原性肽的复合物从细胞中分离。
MHC-肽复合物的纳级(Nano-Scale)纯化此外，发明提供了通过包括免疫沉淀或免疫亲合层析的方法从细胞裂解液中纯化MHC-肽复合物。对于免疫沉淀或免疫亲合层析，使用MHC II类分子特异的且适于这些方法的抗体。特异性抗体优选是单克隆抗体，并且是共价或非共价地(例如经蛋白A)与珠(如琼脂糖凝胶珠或琼脂糖珠)偶联。现有技术中使用的一组抗-HLA抗体包括抗HLA-DR抗体L243、TU36、DA6.147，优选L243；抗HLA-DQ抗体SPVL3、TU22、TU169，优选TU22和TU169；抗HLA-DP抗体B7/21。
对不同MHC II类分子特异的单克隆抗体可商业获得(如Pharmingen，Dianova)，或者使用蛋白A或蛋白G亲合层析从各个杂交瘤上清中纯化。纯化的单克隆抗体可通过各种本领域公知方法偶联，优选将抗体的氨基与CNBr-活化琼脂糖凝胶共价偶联。
通过在旋转情况下将抗体-珠与细胞裂解液孵育几小时，或通过泵送细胞裂解液经过微型柱的层析法，进行MHC分子的免疫分离。抗体-珠的洗涤在Eppendorf管或微型柱中进行。通过SDS-PAGE和使用识别变性MHC分子的抗体(抗HLA-DRα:1B5)进行蛋白质印迹来分析免疫沉淀的效果。
抗原递呈受体结合肽的洗脱和分级分离将肽从受体分子上洗脱，得到源自潜在免疫原来源的或胞内和胞外来源多肽的天然加工肽的复杂混合物。只有在洗脱后，可能将肽分级分离并进行序列分析。
本文所用的术语“免疫原”指当导入体内时会激发免疫应答的任何多肽。
本发明方法中的免疫原性肽可通过本领域公知的多种方法洗脱，优选使用稀酸如稀乙腈(Jardetzky T S等，Nature 1991 353，326-329)、稀乙酸并加热(Rudensky A Y等，Nature 1991，353，622-626；Chicz R M等，Nature 1992，358，764-768)或稀三氟乙酸并于37℃(Kropshofer H等，JExp Med 1992，175，1799-1803)洗脱。最优选地，在37℃用稀三氟乙酸洗脱肽。
在另外的实施方案中，在洗脱之前将分离的抗原递呈受体-肽复合物用水或低盐缓冲液洗涤，以除去残留的去污剂污染物。低盐缓冲液可以是0.5-10mM浓度范围、优选0.5mM浓度的Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液或乙酸缓冲液。在更优选的实施方案中，抗原递呈受体-肽复合物用常规用于HPLC分析的超纯水(测序级)、优选用来自MERCK的超纯水(测序级)进行洗涤。通过超滤实施洗涤步骤。在具有30kD、20kD、10kD或5kD、优选30KD截留分子量和0.5-1.0ml管体积的超滤管(“Ultrafree”管；Millipore)中进行超滤。在超滤管中用携带受体-肽复合物的珠的10-20倍体积、优选15倍体积洗涤4-12次、优选6-10次。使用相同超滤管从保留的抗原递呈受体分子分离洗脱的肽。然后将洗脱的肽冻干。通过液相层析质谱(LC-MS)分析肽序列。
在本发明另外的实施方案中，将所分离免疫原性肽分级分离、测序并鉴定。通过测序可知，在所分离的免疫原性肽混合物中各个肽的氨基酸序列可通过适于飞摩尔量肽测序的方法进行解析。通过鉴定可知，免疫原性肽源自哪个蛋白质或多肽以及它们构成这些蛋白质或多肽中的哪个序列。
在第一个步骤中，所洗脱肽的复杂混合物可通过多种可行层析法之一进行分级分离，如通过反相层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析或其组合。优选地，如MudPit所述(Washburn M P等，Nat Biotechnol.，(2001)，19，242-247)，通过C18反相层析或通过反相/阳离子交换二维HPLC实施分离。
可使用熔融石英微毛细管柱以HPLC方式进行分级分离，其中该微毛细管与质谱仪的纳流电喷雾源相连，或与将级分点样到用于MALDI分析的平板上的微分级分离装置相连。
各种质谱技术是适宜的，优选MALDI-源后衰减(PSD)MS或电喷雾离子化串联质谱(ESI-MS)，最优选离子阱ESI-MS。
可以通过本领域已知方法确定各个肽的序列。优选地，通过肽片段化以及使用例如MASCOT或SEQUEST的算法对片段谱进行计算机辅助解析来实现序列分析。两种计算机算法均使用蛋白质和核苷酸序列数据库以对实验和理论产生的串联质谱进行交叉相关分析。这允许进行自动化高通量序列分析。
通过MALDI质谱的定性肽分析为了对洗脱获得的整个肽库进行定性分析，开展了基质辅助激光解吸和离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析。使用不对肽进行片段化的设置，MALDI-TOF分析提供关于肽混合物的复杂度和优势肽存在的粗略概括。
定量肽分析为了评估从抗原递呈受体洗脱的各个肽的数量，通过在214nm检测波长下工作的流过UV检测仪分析微毛细管柱的流过液。为了定量，将所分析肽的峰面积与合成的标准肽的分级数量的峰面积进行比较。
策略本发明策略预见，可以对已经负载到细胞培养APC的抗原递呈受体上的免疫原性肽进行鉴定(体外方法，

图1)。
在另外的实施方案中，本发明涉及与免疫原性有关的肽的鉴定方法，其包括步骤a)提供以0.1-5μg、优选0.2-3μg的量表达抗原递呈受体(APR)的细胞，b)将细胞与免疫原性肽源接触，c)从细胞分离APR-免疫原性肽复合物，d)从APR洗脱所结合的肽，e)鉴定免疫原性肽，f)验证被鉴定为表位的免疫原性肽。
APR表达细胞可以是MHC II类表达细胞(APC)。优选地，APC是树突状细胞，更优选地，APC是未成熟的树突状细胞，最优选地，APC是由外周血单核细胞产生的未成熟的树突状细胞。
可从外周血单核细胞或从骨髓来源的CD34+干细胞前体细胞产生树突状细胞。通过密度梯度离心从血样分离外周血单个核细胞(PBMC)。然后通过本领域已知方法，如通过磁珠分选法，从PBMC分离单核细胞。树突状细胞源可以是哺乳动物物种，优选人。然后将单核细胞在细胞培养中分化形成未成熟的树突状细胞。通过流式细胞术分析(如细胞表面标记物CD83、CD80、CD86、HLA-DR的上调)监测分化状态。
为获得如100ng MHC II类分子所必需的细胞量依赖于表达MHC II类分子的细胞数和MHC II类分子的表达速率如100ng MHC II类分子与来自约50ml血液的约2×105个未成熟DC或5-10×106个外周血单核细胞或约5×107个外周血单个核细胞相当。然后将APC与治疗性蛋白质源接触。APC，优选未成熟的树突状细胞可通过本领域已知方法(如与炎性细胞因子、类TNFα或TNFα混合物、IL-6、IL-1β、PGE2共孵育)同时被激发成熟。
向APC提供的治疗性蛋白质源选自非合成或合成蛋白质。对照APC除了不暴露于治疗性蛋白质之外，它们进行相同处理(参照图1)。
APC与多肽或其片段接触，其中多肽或其片段可通过受体介导摄取或通过液相摄取和内化而被APC吸收。
通过从MHC分子洗脱肽，得到一组源自多肽或其片段的天然加工肽。该多肽可以是所选择的治疗性多肽或者是胞内来源(在不负载治疗性多肽的情况况下由APC表达的自体蛋白质)或胞外来源(在不负载治疗性多肽的情况下也存在的源自细胞培养基的蛋白质)的不相关多肽。
通过将从接触潜在免疫原来源的细胞鉴定的肽，与从未接触该来源的细胞鉴定的那些肽(对照)进行比较，鉴定分离的免疫原性肽。
MHC结合肽的表位验证通过本发明方法鉴定的肽序列，可通过几个标准之一(包括MHC结合基序、MHC结合能力和经CD4+淋巴细胞的识别)进行验证。
MHC结合基序是特定MHC分子(等位变体)结合肽的共同结构特征，其为与MHC分子形成稳定复合体所必需的。就MHC II类分子而言，因为肽结合槽的两端开放，可结合肽长度为12-18个氨基酸和甚至更长的肽。在九聚体核心区包含相对位置P1、P4、P6、P9，多数HLA II类分子容纳多达4个与结合有关的残基，称为“锚定残基”。然而，该核心区在肽的N末端具有可变的长度。在多数情况中，2-4个N末端残基位于核心区之前。因此，P1锚定残基位于大多数HLA II类分子结合肽中的位点3、4或5。从HLA DR II类分子洗脱的肽共有一个大的疏水性P1锚，其为酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
锚定残基的位置和确切类型构成肽结合基序，其对于大多数常见HLA-DR II类等位基因产物是已知的。用于肽序列中基序确认的计算机算法是“Tepitope”，其可从www.vaccinome.com(由J.Hammer，Nutley，美国所提供)获得。
通过本领域已知方法，使用例如分离MHC II类分子和具有与本发明方法所鉴定那些肽相同氨基酸序列的合成肽测试本发明方法所鉴定肽的MHC结合能力(Kropshofer H等，J.Exp.Med.1992；175，1799-1803；Vogt A B等，J.Immunol.1994；153，1665-1673；Sloan V S等，Nature 1995；375，802-806)。备选地，可以使用MHC II类表达细胞系和生物素化肽的细胞结合测定法证实所鉴定表位(Arndt S O等，EMBO J.，2000；19，1241-1251)。
在两种测定法中，通过确定使标记报告肽的结合减少50％所需的浓度(IC50)来测量肽的相对结合能力。以适当亲和力与相关HLA II类分子结合的肽的IC50值不超过已确认参考肽IC50值的10倍。
相同结合测定法可用于测试肽结合备选MHC II类分子的能力，备选MHC II类分子即使用本发明方法洗脱的那些分子以外的MHC II类分子。
使CD4+T细胞致敏的能力代表着最重要的表位验证方法。该方法涉及测试本发明方法所鉴定肽激活CD4+T细胞群体的能力。合成具有与本发明方法鉴定的那些序列相同或者对应于源自本发明方法所鉴定嵌套组肽核心序列的氨基酸序列的肽。然后在可表达目的MHC II类分子的自体树突状细胞的环境中测试合成肽激活CD4+的能力。
通过本领域已知的各种体外方法测定CD4+T细胞应答。例如，在有或无候选合成肽存在情况下培养全外周血单个核细胞(PBMC)并通过例如[3H]-胸腺嘧啶向其DNA的掺入测定其增殖性反应。增殖性T细胞为CD4+T细胞这一情况可通过在分析前从PBMC中除去CD4+T细胞或者通过加入结合T细胞上CD4+分子的抑制性抗体(由此抑制CD4+细胞增殖)而测试。在两种情况中，只有当CD4+T细胞是增殖性细胞时，增殖性反应会被抑制。或者，可从PBMC纯化CD4+T细胞，并在表达合适MHC II类分子的APC存在情况下测试对肽的增殖性反应。所述的APC可以是B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞或所有PBMC。APC也可以是源自B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的永生化细胞系。APC内源表达目的MHC II类分子，或者表达编码该分子的转染多核苷酸。在所有情况中，可通过例如电离辐射或丝裂菌霉C处理而使APC在分析前为非增殖性的。
作为测定细胞增殖的备选方法，可通过本领域技术人员已知方法测定由CD4+T细胞所产生的细胞因子。细胞因子包括但不限于白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、TNF-α、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)或TGF-β。测定它们的分析法包括但不限于ELISA、ELISPOT和生物测定法，其中在所述生物测定法中，在测试样品存在下测试对相关因子作出响应的细胞的反应性(例如增殖)。
应用本发明方法可用于鉴定任何生物药物，特别是具有下列情况的药物中与免疫原性有关的肽，所述情况即由于中和性抗药物抗体而导致不可接受的效力丧失或者临床试验中副作用或严重副作用被认为是依赖于免疫原性的。
所鉴定的免疫原性肽还用于消除各种(治疗性)多肽具有免疫原性的风险。通过与MHC II类分子结合至关重要的一个或多个关键锚定残基的交换，从而产生具有降低或没有免疫原性潜能的突变的治疗性多肽而实现风险消除。备选地，可以将对CD4+T细胞上的T细胞受体识别至关重要的残基进行交换。
用于对MHC II类分子结合至关重要锚定残基进行交换的方法是本领域众所周知的，即通过丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或带电残基取代HLA-DR1-限制性T细胞表位的P1锚点(参照Kropshofer等，EMBO J.15，6144-6154；1996)。
本发明方法可用于减少通过计算机表位预测算法所鉴定的表位数量。预测规则倾向于过多预测治疗性多肽中含有的表位数量。此种过多预测的结果是对所预测的大量表位进行风险消除会导致在下列情况下生物活性的丧失，即某些序列延伸赋予了生物活性和免疫原性的那些情况。由于本发明鉴定的是天然递呈的肽表位，其经历了MHC结合位点的竞争并通过APC内部的肽编选者HLA-DM的质量控制，所以本文所用的方法将潜在表位数量减少至合理的较少数量。降低表位数的风险消除更可能保留治疗性多肽的生物活性。
现已概述了本发明，通过参考具体实施例连同下列附图可以更好地理解本发明，除非另外指出，本文包含的实施例仅用于解释的目的而不旨在限制本发明。
附图简述图1显示研究源自加至人树突状细胞的治疗性多肽的天然加工MHCII类结合肽表位的方法学图解。
图2显示通过计算机预测算法TEPITOPE鉴定的和涉及树突状细胞的体外方法鉴定的OKT3来源肽表位的比较。预测了对于HLA-DRB1等位基因*0301、*0401、*0701和*1101的潜在T细胞表位，如蛋白质序列上面小的黑色矩形所示。用于TEPITOPE分析的阈值设定为1-4％。省略了未加工的OKT3轻链的信号肽。通过体外细胞技术所鉴定的表位用OKT3序列中的数字和框标记。
图3显示通过合成的OKT3来源肽#1-4活化CD4+T细胞的图示。T细胞活化强度通过刺激指数(SI)表示。用于刺激(每种10μM)的肽序列如下#1，OKT3-lc 98-113，GSGTKLEINRADTAPT；#2，OKT-lc143-158，INVKWKIDGSERQNGV；#3，OKT3-hc 194-209，WPSQSITCNVA HPASS；#4，OKT3-lc 164-183，DQDSKDSTYSMSSTLTLTKDE。用各个肽和成熟树突状细胞重刺激T细胞一次(B)或两次(A，C)。每张图上方显示所采用树突状细胞和T细胞的HLA-DRB1基因型。误差条表示从3次独立试验获得的SD。将不加入肽的情况下的平均SI调整为1.0。使用了具有下列DRB1单体型的供体细胞*0401/*0701(A)、*0301/*1501(B)和*1001/*1201(C)。
实施例下列实施例与上述附图结合，并以图1中概括的方法学为基础并在以下详细描述。除非另外指明，实施例中所指的商业可得的试剂根据制造商的说明书使用。
本发明的方法学细胞系和培养如下所述，使用从单核细胞分化而来的人树状细胞开展研究。从人外周血纯化单核细胞。所有细胞在补充1mM丙酮酸、2mM谷氨酰胺和10％热灭活胎牛血清(Gibco BRL，Rockville，Md.)的RPMI 1640培养基(缩写RPMI)中培养。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离从作为来自健康供体的标准血沉棕黄层制剂的当地血库获得外周血。使用肝素(200I.U./ml血，Liquemine，Roche)以防止凝固。在LSM(1.077-1.080g/ml；ICN，Aurora，Ohio)中以800g(室温)离心30分钟以分离外周血单个核细胞(PBMC)。从中间相收集PBMC并在含有20mM Hepes的RPMI中洗涤两次(500g，15分钟；300g，5分钟)。为了除去红血球，用ALT缓冲液(140mM氯化铵，20mM Tris，pH 7.2)在37℃处理PBMC 3分钟。用含有20mM Hepes的RPMI洗涤PBMC两次(200g，5分钟)。
外周血单核细胞的HLA分型用于分离单核细胞和分化成树突状细胞的PBMC的HLA-DR基因型通过Roche Molecular Systems(Alameda，CA，美国)确定。
树突状细胞从外周血单核细胞的产生根据制造商的方法，使用抗CD14磁珠(Miltenyi Biotech，Auburn，Calif.)的阳性分选法，从PBMC分离单核细胞。在补充1％非必需氨基酸(Gibco，BRL，Rockville，Md.)、50ng/ml重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；S.A.1.1×107U/mg)(Leucomax；Novartis，Basel，瑞士)以及3ng/ml重组人IL-4(S.A.2.9×104U/mg)(R&D Systems，Minneapolis，Minn.)的RPMI中培养单核细胞。将单核细胞以0.3×106/ml接种于6孔平板(Costar)中培养5天以获得未成熟的树突状细胞。
通过流式细胞术分析常规监测单核细胞来源的未成熟树突状细胞的质量，未成熟树突状细胞符合下列表型CD1a(高)、CD3(阴性)、CD14(低)、CD19(阴性)、CD56(阴性)、CD80(低)、CD83(阴性)、CD86(低)和HLA-DR(低)。与此相反，成熟树突状细胞(参照以下)呈现下列表型CD1a(低)、CD80(高)、CD83(高)、CD86(高)和HLA-DR(高)。抗CD1a、CD3、CD14、CD19、CD56、CD80、CD83、CD86的单克隆抗体以及各自的同种型对照可从Pharmingen(San Diego，Calif.)购买。
树突状细胞暴露于治疗性多肽为促使树突状细胞摄取药物蛋白质，将6×106个未成熟树突状细胞暴露于5-50μg生物药物中。同时，加入10ng/ml重组人肿瘤坏死因子(TNFαS.A.1.1×105U/mg)诱导树突状细胞成熟。作为对照，6×106的树突状细胞只和TNFα孵育(图1)。
共培养24-48小时后，通过以300g离心10分钟收集成熟树突状细胞。细胞用含有10％FCS的RPMI洗涤，并转移至eppendorf管中。400g离心3分钟后，彻底除去上清液并将细胞冻存于-70℃。
抗HLA II类分子珠的产生抗HLA-DR单克隆抗体(mAb)L243(ATCC，Manassas，Va.)通过培养各个小鼠杂交瘤细胞系产生。根据制造商的方法，使用蛋白A琼脂糖凝胶(Pharmacia，Uppsala，瑞典)纯化mAb L243，并以终浓度2.5mg/ml固定于CNBr活化的琼脂糖凝胶珠(Pharmacia)。L243珠储存于含有0.1％Zwittergent 3-12(Calbiochem，La Jolla，Calif.)的PBS中。
HLA-DR-肽复合物的纳级纯化将冷冻的树突状细胞沉淀重悬于10倍体积的冰冷裂解缓冲液(1％Triton-X-100，20mM Tris、pH 7.8，5mM MgCl2，含有蛋白酶抑制剂chyrnostatin、抑胃酶肽、PMSF和亮抑蛋白酶肽(Roche，Mannheim，德国)，并在水平振荡器中于4℃下以1000转/分裂解1小时。通过于4℃下以2000g离心10分钟，去除细胞裂解液中的细胞碎片和核。裂解液与L243珠(每100μl细胞裂解液使用5-10μl L243珠)在水平振荡器中于4℃下以1000转/分共孵育2小时。结合到L243珠上的免疫沉淀的HLA-DR-肽复合物通过于4℃下以2000g离心5分钟进行沉淀，并用300μl溶于PBS的0.1％Zwittergent 3-12(Calbiochem)洗涤三次。
通过在免疫沉淀之前和之后分析各个细胞裂解液监测HLA-DR-肽复合物的损耗效率。同时，使用抗HLA-DRα特异性mAb 1B5(Adams，T.E.等，Immunology 50(1983)613-624)通过蛋白质印迹法分析等份小珠。
HLA-DR结合肽的洗脱结合于L234珠上的HLA-DR-肽复合物重悬于400μl H2O(HPLC级；Merck，Darmstadt，德国)，转入30kD截留分子量的超滤管UltrafreeMC(Millipore，Bedford，Mass.)中，并用400μl H2O(HPLC级)通过于4℃下以14000转/分离心2-4分钟洗涤10次。为了洗脱结合肽，加入50μl含0.1％三氟乙酸(Fluka，Buchs，瑞士)的H2O(HPLC级)，并于37℃孵育30分钟。通过将超滤管以14000转/分室温离心3分钟将洗脱的肽收集到一新eppendorf管中，并立即在Speed-Vac真空离心机中冻干。
肽通过纳-HPLC的分级分离从HLA-DR分子洗脱的冻干肽溶于含0.05％三氟乙酸、5％乙腈(Merck，Darmstadt，德国)的H2O(HPLC级)中，并在连接于FAMOS自动取样器和ULTIMATE纳流HPLC(Dionex，Olten，瑞士)的75μm×15cmC18 PepMap毛细管(C18；3μm；100)(LC-Packings，Amsterdam，荷兰)上分离。使用200nl/分钟的恒定流速的下列非线性梯度在0-40分钟运行5-50％的系统B；在40-50分钟运行50-90％的系统B。系统A为0.05％三氟乙酸、5％乙腈/H2O，系统B为0.04％三氟乙酸、80％乙腈/H2O。通过在214nm和280nm的双重UV吸收，监测分离情况。使用级分收集器PROBOTT(BAI，Weiterstadt，德国)收集级分(400nl)，并点样在AnchorChip 600/384 MALDI-MS靶(Bruker，Bremen，德国)上。肽通过离子阱MS/MS质谱的序列分析为对复杂的肽混合物进行高通量测序，使用了MudPIT(多维蛋白质鉴定技术)(Washburn M P等，Nat Biotechnol 19(2001)，242-247)，MudPIT基于液相层析分级分离及随后的质谱测序。
为此，从HLA分子洗脱的冻干肽重悬浮于含有5％(v/v)乙腈、0.5％(v/v)乙酸、0.012％(v/v)七氟丁酸(HFBA)和5％(v/v)甲酸的缓冲液中。样品在由Model P-2000激光拉出器(Sutter Instrument Co.，Novato，Calif.)产生的熔融石英微毛细管柱(100μm内径×365μm)上分离。微柱用3μm/C18反相材料(C18-ACE 3μm[ProntoSIL 120-3-C18 ACE-EPS，Leonberg，德国])继之以3cm的5μm阳离子交换材料(PartisphereSCX；Whatman，Clifton，N.J.)填充。
使用下列缓冲液，在Agilent 1100系列HPLC(Agilent Technologies，Waldbronn，德国)上实施完全自动化的8步骤梯度分离5％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(缓冲液A)、80％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(缓冲液B)、250mM醋酸铵/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(缓冲液C)以及1.5M醋酸铵/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(缓冲液D)。第一步骤(106分钟)为100分钟的0至80％缓冲液B梯度和保持6分钟的80％缓冲液B。接着的6个步骤(每个步骤106分钟)为5分钟的100％缓冲液A、2分钟的x％缓冲液C、5分钟的100％缓冲液A、3分钟的0至10％缓冲液B梯度、55分钟的10至35％缓冲液B梯度、20分钟的35至50％缓冲液B梯度、16分钟的50至80％缓冲液B梯度。下列是步骤2-7中2分钟缓冲液C百分数(x)10、20、30、40、70、90和100％。步骤8为5分钟的100％缓冲液A洗涤、用100％缓冲液D进行20分钟的盐水洗涤以及100分钟的0-80％缓冲液B梯度。
HPLC柱与装备有纳-LC电喷雾电离源的Finnigan LCQ离子阱质谱仪(Finnigan，Bremen，德国)直接连接。根据制造商的方法，以MS-MS模式实施质谱分析。通过对swiss fasta数据库进行SEQUEST算法来鉴定肽。通过TEPITOPE进行潜在表位的计算机预测通过使用TEPITOPE算法实现潜在T细胞表位的预测。应用下列检索标准阈值(对于最佳分值为1-3％，对于中等分值天然配体为4-6％)、肽长度(15个氨基酸残基)和混杂性(预测结合9个等位基因中的至少6个)。为了确定混杂性程度，选择下列9个在高加索人群中频繁出现的等位基因HLA-DRB1*0101、*0301、*0401、*0701、*0801、*1101、*1305、*1501和DRB5*0101。在表位检索中不包括跨膜结构域和信号肽。
T细胞活化分析使用来自Miltenyi Biotech(Auburn，CA，美国)的CD4+T细胞分离试剂盒通过阴性选择从新鲜PBMC制备CD4+T细胞。T细胞群体纯度＞75％并且通过台盼蓝染色(Sigma-Aldrich)判断存活率＞95％。T细胞以2×106细胞/ml重悬浮于AIM V培养基(Gibco BRL，Rockville，MD)。如所述从PBMC中分化出树突状细胞(DC)，并在完全的Macrophage-SFM培养基(Gibco BRL，Rockville，MD)中培养。在第4天，用10μg/ml的LPS(Sigma-Aldrich)刺激未成熟的DC。在第6天，将成熟DC洗涤，并以2×105细胞/ml重悬于AIMV培养基。对于共培养，将AIMV培养基中0.1ml的CD4+T细胞(2×105)和0.1ml的自体DC(2×104)在圆底96孔板中混合。分别以20μg/ml和1μg/ml的终浓度加入OKT3mAb和Inflexal V。加入合成肽至20μM终浓度。每一抗原以一式三份进行测定。在共培养的第5天，每孔加入10μM的5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)(Roche，Basel，瑞士)。孵育24小时后，收集培养物并根据制造商的方法进行处理。未添加抗原的培养物中T细胞增殖作为参照，将其平均刺激指数(SI)设为1。
为了重刺激T细胞，将未成熟的DC(2-3×106/ml)于50％AB血清(Sigma-Aldrich)、40％RPMI和10％DMSO(Sigma-Aldrich)中在-70℃下冷冻。在重刺激的时间点，将DC解冻、洗涤并在10μg/ml LPS存在下培养两天。在DC/T细胞共培养的第5天(第1次重刺激)或第10天(第2次重刺激)，在将0.1ml ATM V中的解冻成熟DC(2×104)与新鲜蛋白质或肽抗原共培养之前，从每个样品孔取出0.1ml AIM V培养基。以终浓度100U/ml加入IL-2(Pharmingen，San Diego，CA)。
实施例1OKT3是第一个治疗性抗体。它在1986年得到FDA批准。它是CD3特异的小鼠IgG2a抗体，并作为移植(L.Chatenaud，2003)、I型糖尿病(E.Masteller和J.Bluestone，2002)和银屑病(T.Udset等，2002)中的免疫抑制药物广泛用于临床。尽管OKT-3诱导的免疫抑制反应是深远的，但出现对异种蛋白质的抗OKT3反应是早期临床试验中主要缺陷之一，其促进OKT-3的快速清除和中和(G.Goldstein，1987)。据报道在涉及OKT3治疗个体研究中，免疫原性的发生频率粗略计算为85％(C.Pendley等，2003)。
图1中描述的策略用于鉴定由HLA-DR基因型为HLA-DRB1*0401/1302的树突状细胞递呈的OKT3的肽表位。
为了鉴定HLA-DRB1*0401/1302限制性OKT3表位，将表达HLA-DRB1*0401/1302基因型的树突状细胞从外周血单核细胞中分化，并以0.5×106细胞/ml的浓度进行培养。将5×106个树突状细胞暴露于20μg/ml浓度的抗体OKT3中。同时，通过加入TNFα(10ng/ml)诱导树突状细胞成熟。作为对照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情况下培养相同量的树突状细胞。孵育24小时后，两组树突状细胞在去污剂TX-100中裂解，并用固定于琼脂糖凝胶珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR结合肽用0.1％TFA洗脱并通过2D-LS/MS-MS分析。
对HLA-DRB1*0401/1302结合配体的序列分析揭示了OKT3来源表位，其表现为来自OKT3的7个肽序列(表1)。两个表位源自κ轻链，一个表位位于重链。在至少2个独立试验中发现了与单体型DRB1*0401/1302相关的三个表位。
表位#1呈现为15-mer和16-mer的肽，其中15-mer肽是源自轻链恒定区99-113(表1)。表位#1包含DRB1*1302相关共显性DRB3等位基因DRB3*0301的锚定基序(F.Verreck等，1996)作为P1锚的L-103，作为P4锚的N-106，作为P6锚的A-108和作为P9锚的A-111。如TEPITOPE算法所示，相同的锚定残基具有结合DRB1*0401的性能(图2)。通过诱导CD4+T细胞增殖的潜能证实表位#1是T细胞表位在基因型为DRB1*0401/*0701(图3B)和DRB1*0301/*1501(图3C)的树突状细胞环境中表位#1是刺激性的。
表位#2呈现为4种长度变体13-mer、14-mer、15-mer和16-mer的肽。该表位也源自轻链亚基的恒定区(表1)。通过TEPITOPE算法预测出在DRB1*0401情况下的表位#2(图2)，表位#2含有下列锚定基序作为P1锚的W-147、作为P4锚的D-150、作为P6锚的S-152。在T细胞活化分析中，表位#2在基因型DRB1*0401/*0701(图3B)和DRB1*0301/*1501(图3C)的情况下刺激T细胞的增殖。然而，它在基因型DRB1*1001/*1201的情况下不刺激T细胞增殖。在从EBV转化的B细胞系(Friede等，1996)中得到的DRB1*0401等位基因的情况下描述表位#2的同源的人序列。
表位#3仅呈现为一种长度变体源自OKT3重链恒定区194-210的17-mer(表1)。与表位#1类似，表位#3含有DRB3等位基因DRB3*0301的锚定基序作为P1锚的I-199、作为P4锚的N-202、作为P6锚的A-204和作为P9锚的A-207。尽管TEPITOPE算法没有预测出对于DRB1*0301、*0401、*0701或*1101的表位#3(图2)，但表位#3在所测试的全部3种DRB1基因型的情况下能活化T细胞(图3)。已有描述，相同表位与鼠MHC II类分子H2-A(s)结合(Rudensky等，1992)。
当应用TEPITOPE算法预测基因型为DRB1*0401/1302情况下OKT3κ轻链的表位时，仅能对DRB1*0401进行一种预测，因为该算法没有包括其它等位基因(图2)。TEPITOPE在κ轻链中预测出11个表位，然而它们当中仅有两个是天然加工的肽表位，表现为表位#1和#2(图2)。同样，TEPITOPE在OKT3重链中预测出13个表位，然而它们当中没有一个包含表位#3(图2)。
实施例2图1中略述的策略也用于鉴定由HLA-DR基因型为HLA-DRB1*0701/1601的树突状细胞所递呈的OKT3肽表位。
为了鉴定HLA-DRB1*0701/1601限制性OKT3表位，将表达HLA-DRB1*0701/1601基因型的树突状细胞从外周血单核细胞中分化，并以0.5×106细胞/ml的浓度进行培养。将5×106个树突状细胞暴露于20μg/ml浓度的抗体OKT3中。同时，通过加入TNFα(10ng/ml)诱导树突状细胞成熟。作为对照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情况下培养相同量的树突状细胞。孵育24小时后，两组树突状细胞在去污剂TX-100中裂解，并用固定于琼脂糖凝胶珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR结合肽用0.1％TFA洗脱，并通过2D-LS/MS-MS分析。
对HLA-DRB1*0701/1601结合配体的序列分析揭示一个OKT3来源的表位，其表现为源自OKT3的10个肽序列(表2)。表位#4源自κ轻链，并在至少2个独立试验中被发现。
表位#4呈现为10种长度变体(15-22-mer)肽，其中15-mer源自轻链恒定区168-182(表2)。表位#4包含DRB1*0701等位基因的锚定基序作为P1锚的Y-172、作为P4锚的S-175、作为P6锚的T-177和作为P9锚的L-180。如TEPITOPE算法所示，相同的锚定残基具有结合DRB1*0401和DRB1*1101的性能(表2)。通过诱导CD4+T细胞增殖的潜能证实表位#1是T细胞表位在基因型为DRB1*0401/*0701(图3B)和DRB1*0301/*1501(图3C)的树突状细胞情况下表位#4是刺激性的。然而，在基因型DRB1*1001/*1201的情况下它不能活化T细胞。
最近在牛系统中报道了表位#4，所述牛系统为从血液单个核细胞得到的且表现为牛等位基因DRB3*2703(Sharif等，2002)。
当应用TEPITOPE算法预测基因型DRB1*0701/*1601情况下OKT3κ轻链的表位时，仅针对DRB1*0701进行预测，因为该算法不包括DRB1*1601等位基因(图2)。TEPITOPE在κ轻链中预测出5个表位，然而仅仅一个是天然加工肽表位，表现为表位#4(图2)。同样，TEPITOPE在OKT3重链中预测出8个表位，然而经过对天然存在肽进行分析，它们当中没有一个得到支持(图2)。
实施例3图1中略述的策略用于鉴定OKT3中被HLA-DR基因型HLA-DRB1*1101/1202限制性T细胞所识别的肽表位。
为了鉴定HLA-DRB1*1101/1202限制性OKT3表位，将表达基因型HLA-DRB1*1101/1202的树突状细胞从外周血单核细胞中分化，并以0.5×106细胞/ml的浓度进行培养。将5×106个树突状细胞暴露于20μg/ml浓度的抗体OKT3中。同时，通过加入TNFα(10ng/ml)诱导树突状细胞成熟。作为对照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情况下培养相同量的树突状细胞。孵育24小时后，两组树突状细胞在去污剂TX-100中裂解，并用固定于琼脂糖凝胶珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR结合肽用0.1％TFA洗脱，并通过2D-LS/MS-MS分析。
对HLA-DRB1*1101/1202结合配体的序列分析揭示了2个OKT3来源的表位，#1和#3，表现为来自OKT3的6个肽序列(表3)。一个表位源自κ轻链，另一个表位位于重链。在至少2个独立试验中，发现了与单体型DRB1*1101/1202相关的两个表位。
表位#1呈现为与上述基因型DRB1*0401/*1302情况下相同的15-mer和16-mer肽(参照表1和3)。表位#1包含DRB1*1101等位基因的锚定基序作为P1锚的L-103、作为P6锚的A-108和作为P9锚的A-111。通过诱导CD4+T细胞增殖的潜能证实表位#1是T细胞表位在基因型为DRB1*0401/*0701(图3B)和DRB1*0301/*1501(图3C)的树突状细胞情况下表位#1是刺激性的。然而，在基因型DRB1*1001/*1201的情况下它不能活化T细胞。
来自OKT3重链恒定区的表位#3(表1、3)呈现为4种长度变体194-207的14-mer、194-208的15-mer、194-210的17-mer和194-211的18-mer (表3)。尽管TEPITOPE算法针对DRB1*1101或1202没有预测出表位#3(图2)，但表位#3在测试的全部3种DRB1基因型情况下可活化T细胞(图3)。
当应用TEPITOPE算法预测基因型为DRB1*1101/1202情况下OKT3κ轻链的表位时，仅针对DRB1*1101进行预测，因为该算法不包括其它等位基因(图2)。TEPITOPE在κ轻链中预测出6个表位，然而仅仅一个表位是天然加工肽表位，表现为表位#1(图2)。同样，TEPITOPE在OKT3重链中预测出9个表位，然而它们当中没有一个包括表位#3(图2)。
实施例4图1中略述的策略也用于鉴定OKT3中由HLA-DR基因型为HLA-DRB1*0301/0401的树突状细胞递呈的肽表位。
为了鉴定HLA-DRB1*0301/0401限制性OKT3表位，将表达基因型HLA-DRB1*0301/0401的树突状细胞从外周血单核细胞中分化，并以0.5×106细胞/ml的浓度进行培养。将5×106个树突状细胞暴露于20μg/ml浓度的抗体OKT3中。同时，通过加入TNFα(10ng/ml)诱导树突状细胞成熟。作为对照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情况下培养相同量的树突状细胞。孵育24小时后，两组树突状细胞在去污剂TX-100中裂解，并用固定于琼脂糖凝胶珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR结合肽用0.1％TFA洗脱，并通过2D-LS/MS-MS分析。
对HLA-DRB1*0301/0401结合配体的序列分析揭示了一个OKT3源的表位，呈现为源自OKT3的1个肽序列(表4)。表位#2来自κ轻链并在至少2个独立试验中被发现。
表位#2呈现为源自轻链恒定区143-159的17-mer肽(表4)。如上所述(实施例1)，表位#2包含DRB1*0401等位基因的锚定基序作为P1锚的W-147、作为P4锚的D-150、作为P6锚的S-152。如TEPITOPE算法所示，相同锚定残基具有结合DRB1*0301的性能(图2)。通过诱导CD4+T细胞增殖的潜能证实表位#2是T细胞表位在基因型为DRB1*0401/*0701(图3B)和DRB1*0301/*1501(图3C)的树突状细胞情况下表位#2是刺激性的。然而，在基因型DRB1*1001/*1201的情况下表位#2不能活化T细胞。
应用TEPITOPE算法在基因型为DRB1*0301/*0401的情况下预测OKT3κ轻链的表位(图2)。TEPITOPE在κ轻链中预测出12个表位，然而它们当中仅仅一个是在天然加工肽表位，表现为表位#2(图2)。同样，TEPITOPE在OKT3重链中预测出18个表位，然而经过对天然存在肽进行分析，它们当中没有一个得到支持(图2)。
实施例5目前干扰素-β(IFN-β)是治疗多发性硬化的首要疗法(Deisenhammer等2000)。目前有三种不同的IFN-β制剂投放市场Avonex、Rebif(二种均为IFN-β-1a)和Betaseron(IFN-β-1b)。其中Betaseron是第一个投放市场的，由FDA根据加速批准程序于1993年批准。与Avonex和Rebif相比，Betaseron具有异常免疫原性。用Betaseron治疗后，多达28-47％的病人产生抗IFN-β的中和抗体，然而在Avonex治疗的病人中仅2-6％产生中和性抗药物抗体(Deisenhammer等，2000；Bertolotto等，2004)。在该情况中，应当指出Avonex和Rebif是在中国仓鼠卵巢细胞中表达的，其为具有天然氨基酸序列的糖基化蛋白质，然而Betaseron是在大肠杆菌(E.Coli)中表达的，其为具有Met-1缺失和第17位由Cys变成Ser的点突变的非糖基化形式(Mark等，1984；Holliday和Benfield，1997)。迄今为止不清楚这些差异是否是造成免疫原性不同的原因。
图1中略述的策略用于鉴定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型为HLA-DRB1*0101/0701的树突状细胞所递呈的表位。
为了鉴定HLA-DRB1*0101/0701限制性IFN-β-1b表位，将表达基因型HLA-DRB1*0101/0701的树突状细胞从外周血单核细胞中分化，并以0.5×106细胞/ml的浓度进行培养。将5×106个树突状细胞暴露于20μg/ml浓度的IFN-β-1b中。同时，通过加入1μg/ml浓度的脂多糖(LPS)诱导树突状细胞成熟。作为对照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情况下培养相同量的树突状细胞。孵育24小时后，两组树突状细胞在去污剂TX-100中裂解，并用固定于琼脂糖凝胶珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR结合肽用0.1％TFA洗脱，并通过2D-LS/MS-MS分析。
对HLA-DRB1*0101/0701结合配体的序列分析揭示了一个IFN-β-1b来源的表位，表位#5，其表现为源自IFN-β-1b的3个肽序列(表5)。在基因型DRB1*0101/1401的环境下也发现与基因型DRB1*0101/0701相关的表位#5(参照表8)。
表位#5呈现为13-mer、16-mer和17-mer的肽，其中13-mer源自蛋白质区44-60(表5)。表位#5包含下列锚定基序作为P1锚的F-49、作为P4锚的E-52、作为P6锚的A-54和作为P9锚的T-57。与此相一致，在体外结合分析中证明包含表位#5的15-mer的肽对HLA等位基因DRB1*0101具有强结合能力(Tangri等，2005)。
实施例6图1中略述的策略用于鉴定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型为HLA-DRB1*0101/1404的树突状细胞递呈的表位。
为了鉴定HLA-DRB1*0101/1404限制性IFN-β-1b表位，将表达基因型HLA-DRB1*0101/1404的树突状细胞从外周血单核细胞中分化，并以0.5×106细胞/ml的浓度进行培养。将5×106个树突状细胞暴露于20μg/ml浓度的IFN-β-1b中。同时，通过加入1μg/ml浓度的脂多糖(LPS)诱导树突状细胞成熟。作为对照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情况下培养相同量的树突状细胞。孵育24小时后，两组树突状细胞在去污剂TX-100中裂解，并用固定于琼脂糖凝胶珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR结合肽用0.1％TFA洗脱，并通过2D-LS/MS-MS分析。
对HLA-DRB1*0101/1404结合配体的序列分析揭示了2个IFN-β-1b来源的表位，#6和#7，其表现为源自IFN-β-1b的24个肽序列(表6)。在基因型DRB1*0801的情况下也发现了表位#6(表7)。在基因型DRB1*0801(表7)、DRB1*0101/1401(表8)和DRB1*1303/1501(表9)的情况下也发现了表位#7。
表位#6呈现为22种长度变体(11-19-mer)，其中11-mer源自蛋白质区89-99(表6)。表位#6包含下列锚定基序作为P1锚的Y-91、作为P4锚的I-94、作为P6锚的H-96和作为P9锚的T-99。如TEPITOPE算法预测，这些锚定残基具有结合HLA等位基因DRB1*1101和DRB1*0801的能力。尽管已经显示包含表位#6的15-mer肽能够结合DRB1*0701，但没有证据证明在该HLA情况下能够使T细胞活化(Barbosa等，2005)。
表位#7呈现为13-mer和15-mer肽，其中13-mer源自蛋白质区149-161(表6)。表位#7包含下列锚定基序作为P1锚的F-153、作为P4锚的I-156、作为P6锚的R-158和作为P9锚的G-161。也已经显示包含表位#7的15-mer肽是对HLA等位基因DRB1*0101、DRB1*1101和DRB1*1501具有强结合能力的不加选择的结合物(Tangri等，2005)。此外，已经描述包含表位#7的肽库在DRB1*0701背景下诱导T细胞活化(Barbosa等，2005)。
实施例7图1中略述的策略用于鉴定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型HLA-DRB1*0801/0801的树突状细胞递呈的表位。
为了鉴定HLA-DRB1*0801/0801限制性IFN-β-1b表位，将表达基因型HLA-DRB1*0801/0801的树突状细胞从外周血单核细胞中分化，并以0.5×106细胞/ml的浓度进行培养。将5×106个树突状细胞暴露于20μg/ml浓度的IFN-β-1b中。同时，通过加入1μg/ml浓度的脂多糖(LPS)诱导树突状细胞成熟。作为对照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情况下培养相同量的树突状细胞。孵育24小时后，两组树突状细胞在去污剂TX-100中裂解，并用固定于琼脂糖凝胶珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR结合肽用0.1％TFA洗脱，并通过2D-LS/MS-MS分析。
对HLA-DRB1*0801/0801结合配体的序列分析揭示了2个IFN-β-1b来源的表位，其表现为源自IFN-β-1b的22个肽序列(表7)。在至少2个独立试验中发现与基因型DRB1*0801/0801相关的两个表位。
表位#6呈现为17种长度变体(11-18-mer)，其中11-mer源自蛋白质区89-99(表7)。如上所述，对于DRB1*1101/1404表位#6包含下列锚定基序作为P1锚的Y-91、作为P4锚的I-94、作为P6锚的H-96和作为P9锚的T-99。如TEPITOPE算法所预测，这些锚定残基具有结合HLA等位基因DRB1*1101和DRB1*0801的能力。
表位#7呈现为下列5种长度变体151-161的11-mer、149-161的13-mer、149-162的14-mer、148-161的14-mer和147-161的15-mer(表7)。表位#7包含下列锚定基序作为P1锚的F-153、作为P4锚的I-156、作为P6锚的R-158和作为P9锚的G-161。
实施例8图1中略述的策略用于鉴定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型为HLA-DRB1*0101/1401的树突状细胞递呈的表位。
为了鉴定HLA-DRB1*0101/1401限制性IFN-β-1b表位，将表达基因型HLA-DRB1*0101/1401的树突状细胞从外周血单核细胞中分化，并以0.5×106细胞/ml的浓度进行培养。将5×106个树突状细胞暴露于20μg/ml浓度的IFN-β-1b中。同时，通过加入1μg/ml浓度的脂多糖(LPS)诱导树突状细胞成熟。作为对照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情况下培养相同量的树突状细胞。孵育24小时后，两组树突状细胞在去污剂TX-100中裂解，并用固定于琼脂糖凝胶珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR结合肽用0.1％TFA洗脱，并通过2D-LS/MS-MS分析。
对HLA-DRB1*0101/1401结合配体的序列分析揭示了2个IFN-β-1b来源的表位，其表现为源自IFN-β-1b的9个肽序列(表8)。在至少2个独立试验中发现了与基因型DRB1*0101/1401结合的两个表位。
表位#5呈现为7种长度变体46-60的15-mer、45-60的16-mer、44-60的17-mer、43-60的18-mer、43-61的19-mer、42-60的19-mer和39-60的22-mer(表8)。表位#5包含下列锚定基序作为P1锚的F-49、作为P4锚的E-52、作为P6锚的A-54和作为P9锚的T-57。
表位#7呈现为13-mer和15-mer肽，其中13-mer源自蛋白质区149-161(表8)。表位#7包含下列锚定基序作为P1锚的F-153、作为P4锚的I-156、作为P6锚的R-158和作为P9锚的G-161。
实施例9图1中略述的策略用于鉴定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型为HLA-DRB1*1303/1501的树突状细胞递呈的表位。
为了鉴定HLA-DRB1*1303/1501限制性IFN-β-1b表位，将表达基因型HLA-DRB1*1303/1501的树突状细胞从外周血单核细胞中分化，并以0.5×106细胞/ml的浓度进行培养。将5×106个树突状细胞暴露于20μg/ml浓度的IFN-β-1b中。同时，通过加入1μg/ml浓度的脂多糖(LPS)诱导树突状细胞成熟。作为对照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情况下培养相同量的树突状细胞。孵育24小时后，两组树突状细胞在去污剂TX-100中裂解，并用固定于琼脂糖凝胶珠的抗HLA-DR mAb L243沉淀HLA-DR分子。HLA-DR结合肽用0.1％TFA洗脱，并通过2D-LS/MS-MS分析。
对HLA-DRB1*1303/1501结合配体的序列分析揭示了1个IFN-β-1b来源的表位，其表现为源自IFN-β-1b的3个肽序列(表9)。在至少2个独立试验中发现了与基因型DRB1*1303/1501相关的两个表位。
表位#7呈现为149-161的13-mer、148-161的14-mer和147-161的15-mer(表9)。表位#7包含下列锚定基序作为P1锚的F-153、作为P4锚的I-156、作为P6锚的R-158和作为P9锚的G-161。
表1.与基因型HLA-DRB1*0401/*1302相关的OKT-3(Orthoclone)表位
表2.与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT-3(Orthoclone)表位
表3.与基因型HLA-DRB1*1101/*1202相关的OKT-3(Orthoclone)表位
表4.与基因型HLA-DRB1*0301/*0401相关的OKT-3(Orthoclone)表位
表5.与基因型HLA-DRB1*0101/*0701相关的干扰素-β-1b表位
表6.与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-β-1b表位
表7.与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-β-1b表位
表8.与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-β-1b表位
表9.与基因型HLA-DRB1*1303/*1501相关的干扰素-β-1b表位
序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>鉴定生物药物中与免疫原性相关表位的方法<130>23097<160>87<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>213<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>OKT3轻链(κ)<222>(1)..(213)<400>1Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr85 90 95Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro100 105 110Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly115 120 125Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn145 150 155 160Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr180 185 190Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Asn Glu Cys210<210>2<211>449<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>OKT3重链(IgG2a)<222>(1)..(449)<400>2Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr115 120 125Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu130 135 140Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp145 150 155 160Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu165 170 175Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser180 185 190Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser195 200 205Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys210 215 220Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro225 230 235 240Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser245 250 255Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp260 265 270Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr275 280 285Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val290 295 300Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu305 310 315 320Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val340 345 350Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr355 360 365Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr370 375 380Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu385 390 395 400Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys405 410 415Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu420 425 430Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly435 440 445Lys<210>3<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#1<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0401/*1302相关的OKT-3表位<400>3Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15<210>4<211>16<212>PRT<213>小家鼠
<220>
<221>表位#1<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*0401/*1302相关的OKT-3表位<400>4Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15<210>5<211>13<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*0401/*1302相关的OKT-3表位<400>5Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly1 5 10<210>6<211>14<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*0401/*1302相关的OKT-3表位<400>6Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly1 5 10<210>7<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0401/*1302相关的OKT-3表位<400>7
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly1 5 10 15<210>8<211>16<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*0401/*1302相关的OKT-3表位<400>8Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val1 5 10 15<210>9<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*0401/*1302相关的OKT-3表位<400>9Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser1 5 10 15Thr<210>10<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT3表位<400>10Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys1 5 10 15
<210>11<211>16<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT3表位<400>11Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp1 5 10 15<210>12<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT3表位<400>12Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp1 5 10 15Glu<210>13<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT3表位<400>13Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys1 5 10 15Asp
<210>14<211>18<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(18)<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT-3表位<400>14Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys1 5 10 15Asp Glu<210>15<211>18<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(18)<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT-3表位<400>15Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr1 5 10 15Lys Asp<210>16<211>19<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(19)<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT-3表位<400>16Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
1 5 10 15Lys Asp Glu<210>17<211>20<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(20)<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT-3表位<400>17Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr1 5 10 15Leu Thr Lys Asp20<210>18<211>21<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(21)<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT-3表位<400>18Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr1 5 10 15Leu Thr Lys Asp Glu20<210>19<211>22<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#4<222>(1)..(22)
<223>与基因型HLA-DRB1*0701/*1601相关的OKT-3表位<400>19Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu1 5 10 15Thr Leu Thr Lys Asp Glu20<210>20<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#1<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1202相关的OKT-3表位<400>20Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15<210>21<211>16<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#1<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1202相关的OKT-3表位<400>21Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15<210>22<211>14<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1202相关的OKT-3表位<400>22
Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala1 5 10<210>23<211>15<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1202相关的OKT-3表位<400>23Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser1 5 10 15<210>24<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1202相关的OKT-3表位<400>24Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser1 5 10 15Thr<210>25<211>18<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#3<222>(1)..(18)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1202相关的OKT-3表位<400>25Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser1 5 10 15
Thr Lys<210>26<211>17<212>PRT<213>小家鼠<220>
<221>表位#2<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*0301/*0401相关的OKT-3表位<400>26Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val1 5 10 15Leu<210>27<211>13<212>PRT<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<221>表位#5<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*0701相关的干扰素-γ-1b表位<400>27Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu1 5 10<210>28<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*0701相关的干扰素-γ-1b表位<400>28Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu
1 5 10 15<210>29<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*0701相关的干扰素-γ-1b表位<400>29Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr1 5 10 15Glu<210>30<211>11<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(11)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>30Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>31<211>12<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(12)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>31Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10
<210>32<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>32Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10<210>33<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>33Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10<210>34<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>34Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 15<210>35<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>35Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys1 5 10 15<210>36<211>12<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(12)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>36Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>37<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>37Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10<210>38<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>38Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu
1 5 10<210>39<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>39Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15<210>40<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>40Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 15<210>41<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>41Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 15Lys
<210>42<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>42Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10<210>43<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>43Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15<210>44<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>44Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15<210>45<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>45Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15Glu<210>46<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>46Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15<210>47<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>47Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu<210>48<211>18<212>PRT<213>智人
<220>
<221>表位#6<222>(1)..(18)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>48Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu Glu<210>49<211>19<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(19)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>49Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu Glu Lys<210>50<211>18<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(18)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>50Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10 15Leu Glu
<210>51<211>19<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(19)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>51Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10 15Leu Glu Glu<210>52<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>52Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>53<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*1101/*1404相关的干扰素-γ-1b表位<400>53Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 15<210>54<211>11<212>PRT
<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(11)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>54Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>55<211>12<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(12)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>55Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10<210>56<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>56Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10<210>57<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位
<400>57Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10<210>58<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>58Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 15<210>59<211>12<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(12)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>59Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>60<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>60Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10
<210>61<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>61Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10<210>62<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>62Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15<210>63<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>63Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10<210>64<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>64Leu Ala Asn Val Tyr His G1n Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10<210>65<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>65Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15<210>66<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>66Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15<210>67<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>67Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr
1 5 10<210>68<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>68Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu<210>69<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>69Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10 15<210>70<211>18<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#6<222>(1)..(18)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>70Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10 15
Leu Glu<210>71<211>11<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(11)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>71Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>72<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>72Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>73<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>73Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr1 5 10<210>74<211>14<212>PRT
<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>74Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>75<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0801/*0801相关的干扰素-γ-1b表位<400>75Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 15<210>76<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-γ-1b表位<400>76Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu1 5 10 15<210>77<211>16<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(16)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-γ-1b表位
<400>77Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu1 5 10 15<210>78<211>17<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(17)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-γ-1b表位<400>78Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr1 5 10 15Glu<210>79<211>18<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(18)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-γ-1b表位<400>79Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile1 5 10 15Tyr Glu<210>80<211>19<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(19)
<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-γ-1b表位<400>80Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile1 5 10 15Tyr Glu Met<210>81<211>19<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(19)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-γ-1b表位<400>81Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr1 5 10 15Ile Tyr Glu<210>82<211>22<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#5<222>(1)..(22)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-γ-1b表位<400>82Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala1 5 10 15Ala Leu Thr Ile Tyr Glu20<210>83<211>13<212>PRT
<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-γ-1b表位<400>83Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>84<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*0101/*1401相关的干扰素-γ-1b表位<400>84Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 15<210>85<211>13<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(13)<223>与基因型HLA-DRB1*1303/*1501相关的干扰素-γ-1b表位<400>85Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>86<211>14<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(14)<223>与基因型HLA-DRB1*1303/*1501相关的干扰素-γ-1b表位
<400>86Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10<210>87<211>15<212>PRT<213>智人<220>
<221>表位#7<222>(1)..(15)<223>与基因型HLA-DRB1*1303/*1501相关的干扰素-γ-1b表位<400>87Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 1权利要求
1.一种鉴定与免疫原性有关的肽的方法，其包括步骤a)提供以0.1至5μg分子的量表达抗原递呈受体(APR)的细胞，b)将来自(a)的细胞与免疫原性肽源接触，c)从细胞分离APR分子-免疫原性肽复合物，d)从APR分子洗脱所结合的肽，e)鉴定免疫原性肽，f)验证被鉴定为表位的免疫原性肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中APR表达细胞是MHC II表达细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中MHC II表达细胞是树突状细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中树突状细胞在其被诱导成熟为树突状细胞的同时作为未成熟树突状细胞暴露于免疫原的潜在源。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中潜在的免疫原来源属于包括治疗性多肽在内的肽，例如细胞因子、趋化因子、生长因子、抗体、酶、结构蛋白质、激素或其片段。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中通过使用包括用去污剂溶解细胞和经免疫沉淀或免疫亲合层析分离抗原递呈受体与免疫原性肽复合物的方法，从细胞分离MHC分子与免疫原性肽的复合物。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中在洗脱肽之前，将分离的MHC分子与免疫原性肽的复合物在超滤管中用水洗涤。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中用稀酸将免疫原性肽从MHC分子上洗脱。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中将(d)的所分离免疫原性肽进行分级分离和测序。
10.根据权利要求9所述的方法，其中通过包括液相层析和质谱的方法将所分离免疫原性肽进行分级分离和测序。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中通过将从与潜在免疫原来源接触的细胞中鉴定的肽与从未接触所述来源的细胞中分离的那些肽进行比较，来鉴定所分离的免疫原性肽。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中免疫原性肽是天然加工的免疫原性肽。
13.一种降低多肽免疫原性的方法，包括a)根据权利要求1-12所述的方法鉴定多肽的免疫原性肽，b)修饰多肽的相应表位，以降低或消除抗原递呈受体的结合，c)由此产生具有降低免疫原性潜能或无免疫原性潜能的经修饰的多肽。
14.基本上如前所述、尤其是参照前述实施例所述的方法和用途。
全文摘要
本发明涉及鉴定与免疫原性有关的肽的方法，其包括步骤a)提供能以0.1至5μg分子的量表达抗原递呈受体(APR)的细胞，b)将来自(a)的细胞与免疫原性肽源接触，c)从细胞分离APR分子－免疫原性肽复合物，d)从APR分子洗脱所结合的肽，e)鉴定免疫原性肽，f)验证被鉴定为表位的免疫原性肽。
文档编号C12Q1/02GK1877336SQ20061008988
公开日2006年12月13日 申请日期2006年4月20日 优先权日2005年4月20日
发明者H·克劳勃绍佛, A·沃格特 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司