专利名称：貂心dna检测试剂盒及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及中药检测技术领域，更具体地说，是一种貂心DNA检测试剂盒 及鉴定方法。
背景技术：
貂心属细贵药材，是我国中成药一 利心丸中的主药。利心丸具有补心安 神之功效，能够治疗风湿性心脏病、心动过速、心律不齐和心力衰竭等症。目 前，国家标准中尚无貂心的法定鉴别方法，国内外也未见对貂心的成分研究及 鉴别的文献报道，现有中药材鉴别方法无法区别貂心与易混动物的心脏，故给 貂心及其制剂的质量控制带来了很大困难，难以满足对中药材貂心的鉴定。
发明内容
本发明人遵循线粒体DNA (mtDNA)作为遗传信息的载体生物遗传学理论， 线粒体细胞色素b (cytb)基因具有进化速度适中，应用于种内、种间遗传多 样性及生物的分类、系统发育和遗传多样性的特征。本发明的目的是对貂心线 粒体DNA的全部基因组进行筛选，提供一种能够准确鉴别貂心与鸡心、鸭心、 鹅心和兔心的特异性，使用方便的貂心DNA检测试剂盒，并提供其简便、快速、 检测结果可靠的鉴定方法。
本发明的目的是由以下技术方案来实现的
一种貂心DNA检测试剂盒，其特征是，它包含 (a)鉴定反应体系总体系为100uL，其中含有缓冲液10 uL， 12.5mM dNTP 4-10 nL， 0.1 mM引物1和引物2中的一种1. 5 -4.0 y L， Taq DNA聚 合酶2-10 uL,待检样本DNA 2-5uL，余为双蒸馏水；(b) 阳性对照反应体系总体系为100 u L，其中含有缓冲液10 n L， 12. 5 mM dNTP4-10 u L， 0. 1 mM引物1和引物2中的一种1. 5 -4. 0 u L， Taq DNA 聚合酶2-10 uL，貂心DNA 2-5 u L，余为双蒸馏水；
(c) 阴性对照反应体系总体系均为100nL，其中含有缓冲液10 yL， 12. 5 mM dNTP 4-10 u L， 0. 1 mM引物1和引物2中的一种1. 5 -4. 0 u L， Taq DNA聚合酶2-10 yL，鸡心、鸭心、鹅心和兔心DNA按1: l混合2-5uL，余 为双蒸馏水。
貂心DNA鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤
(1) 设计貂心线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物，含有貂心DNA序列，如 下引物1和引物2中的一种
引物l
5， ATGACCMCATTCGTAAMCTC 3， 5， CAGATTCACTCTACMGACT 3， 引物2
5， GGAACCAGTCTTGTAGAGTG 3， 5， TCTTCATTTTAATAGGTTAT 3，
(2) 人工合成貂心线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通 量合成仪，固相亚磷酰胺三酯合成；
(3) 确定反应程序
分别将貂心DNA检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系 和(c)阴性对照反应体系的总体系各100uL加入反应管中，置于PCR反应仪 中按下列程序进行
引物l: 94。C预变性3-7min， 94°C 30s，退火58°C 30s， 72°C 1 min—30s,40个循环，72。C延伸5-8min， 4°C;
引物2: 94。C预变性3-7 min， 94°C 1 min-30s，退火57°C 45s， 72°C1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C; (4)结果判定
反应产物使用1.5-1.8 %琼脂糖凝胶，在DYY-III型水平电泳仪上电泳， 60-70mV电泳45min-lh，分子量100_1500bp的DNA Marker作参照，凝胶成像 分析系统观察和分析得出结果。
本发明的貂心鉴定试剂盒是利用貂心线粒体DNA与细胞色素b具有的种属 特异性，能够准确同时区别与貂心易混的多种动物心脏的特异性；鉴定方法具 有简便、快速、检测结果可靠等优点。
图l为引物1检测貂心与鸡心、鸭心、鹅心和兔心结果图。 图2为引物2检测貂心与鸡心、鸭心、鹅心和兔心结果图。
图1中l为阴性结果，2为标准分子量，3为阳性对照、为430bp， 4为待
检样本结果；
图2中5为阳性对照、为580bp， 6为标准分子量，7为待检样本结果， 8为阴性结果。
具体实施例方式
下面利用实施例对本发明作进一步描述。
一种貂心DNA检测试剂盒，它包含 (a)鉴定反应体系总体系为100uL，其中含有缓冲液10 uL， 12.5mM dNTP 4-10 uL， 0.1 mM引物l和引物2中的一种1.5 -4.0 u L， Taq DNA聚 合酶2-10 ii L，待检样本DNA 2-5nL，余为双蒸馏水补至100 u L;(b) 阳性对照反应体系总体系为100uL，其中含有缓冲液10 yL，12.5 mM dNTP 4-10 y L， 0. 1 mM引物1和引物2中的一种1. 5 -4. 0 u L， Taq DNA 聚合酶2-10 uL，貂心DNA2-5uL，余为双蒸馏水补至100 y L;
(c) 阴性对照反应体系总体系为lOOuL，其中含有缓冲液10 uL，12.5 mM dNTP 4-10 u L， 0. 1 mM引物1和引物2中的一种1. 5 -4. 0 u L， Taq DNA 聚合酶2-10 u L，鸡心、鸭心、鹅心和兔心DNA按1: 1混合构成的混合物2-5 yL，余为双蒸馏水补至100uL。
鉴定反应体系、阳性对照反应体系和阴性对照反应体系所用的缓冲液为现 有试剂，缓冲液含有500 mM KCl， 100 mM Tris-HC1 (PH8. 4), 15 mM MgCl2 ，市 场有售；12. 5 mM dNTP为12. 5 mM脱氧核苷三磷酸，市场有售；Taq DNA聚合 酶，市场有售。
貂心DNA鉴定方法，它包含下述步骤 (1)设计貂心线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，要求只含有貂心DNA 序列，不含有鸡心、鸭心、鹅心和兔心DNA序列，如下引物l和引物2中的一 种
引物l
5， ATGACCAACATTCGTMMCTC 3， 5， CAGATTCACTCTACMGACT 3， 引物2
5' GGAACCAGTCTTGTAGAGTG 3' 5， TCTTCATTTTAATAGGTTAT 3, (2)人工合成貂心线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通 量合成仪，固相亚磷酰胺三酯合成。固相亚磷酰胺三酯由上海生物工程公司合成，为市场有售。
(3) 确定反应程序
分别将貂心DNA检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系 和(c)阴性对照反应体系的总体系各100uL加入500yL反应管中，置于PCR 反应仪中按下列程序进行
引物l: 94。C预变性3-7min， 94°C 30s，退火58。C 30s， 72°C 1 min-30s， 40个循环，72。C延伸5-8min, 4°C;
引物2: 94。C预变性3-7 min， 94。C 1 min-30s,退火57°C 45s， 72°C1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C;
(4) 结果判定
反应产物使用1.5-1.8 %琼脂糖凝胶，在DYY-m型水平电泳仪上电泳， 60-70mV电泳45min-lh，分子量100-1500bp的DNA Marker作参照，凝胶成像 分析系统观察和分析得出结果。
1. 5-1. 8 %琼脂糖凝胶为市场有售；DYY-m型水平电泳仪为北京市六一仪器 厂制造；分子量100-1500bp的DNA Marker为标准分子量，市场有售；凝胶成 像分析系统为市场有售。
参照图1，为引物1检测貂心与鸡心、鸭心、鹅心和兔心结果，只有貂心 出现阳性结果。
参照图2为引物2检测貂心与鸡心、鸭心、鹅心和兔心结果，只有貂心出 现阳性结果。
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权利要求
1. 一种貂心DNA检测试剂盒，其特征是，它包含(a)鉴定反应体系总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mMdNTP 4-10μL，0.1mM引物1和引物2的一种1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，待检样本DNA 2-5μL，余为双蒸馏水；(b)阳性对照反应体系总体系为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP4-10μL，0.1mM引物1和引物2的一种1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，貂心DNA2-5μL，余为双蒸馏水；(c)阴性对照反应体系总体系均为100μL，其中含有缓冲液10μL，12.5mM dNTP 4-10μL，0.1mM引物1和引物2的一种1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，鸡心、鸭心、鹅心和兔心DNA按11混合2-5μL，余为双蒸馏水。
2. —种貂心DNA鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤(1) 设计貂心线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，含有貂心DNA序列，如 下引物1和引物2中的一种引物15' ATGACCAACATTCGTAAAACTC 3' 5， CAGATTCACTCTACMGACT 3， 引物25' GGAACCAGTCTTGTAGAGTG 3' 5, TCTTCATTTTMTAGGTTAT 3,(2) 人工合成貂心线粒体DNA 二对特异寡核苷酸引物，采用ABI3900高通 量合成仪，固相亚磷酰胺三酯合成；(3) 确定反应程序 2分别将貂心DNA检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系 和(c)阴性对照反应体系的总体系各100uL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行引物l: 94。C预变性3-7 min， 94°C 30s，退火58。C 30s， 72°C 1 min-30s， 40个循环，72。C延伸5-8min, 4°C;引物2: 94。C预变性3-7min，94。C 1 min-30s，退火57。C 45s， 72°C1 min-30s， 35个循环，72。C延伸5-8min， 4°C; (4)结果判定反应产物使用1.5-1.8 %琼脂糖凝胶，在DYY-III型水平电泳仪上电泳， 60-70mV电泳45min-lh，分子量100_1500bp的DNA Marker作参照，凝胶成像分 析系统观察和分析得出结果。
全文摘要
本发明涉及中药检测技术领域，是一种貂心DNA检测试剂盒，它包含含有缓冲液，12.5mM dNTP，0.1mM引物1或引物2的一种，Taq DNA聚合酶，待检样本DNA，双蒸馏水的鉴定反应体系；含有缓冲液，12.5mM dNTP，0.1mM引物1和引物2的一种，Taq DNA聚合酶，貂心DNA，双蒸馏水的阳性对照反应体系；含有缓冲液，12.5mM dNTP，0.1mM引物1和引物2的一种，Taq DNA聚合酶，鸡心、鸭心、鹅心和兔心DNA按1∶1混合，双蒸馏水的阴性对照反应体系。貂心DNA鉴定方法是设计貂心线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物、人工合成貂心线粒体DNA二对特异寡核苷酸引物、确定反应程序和结果判定等步骤，能够准确同时区别与貂心易混的多种动物心脏的特异性；鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点。
文档编号C12Q1/68GK101434990SQ20081005164
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者孙红霞, 张丽华, 李明成, 王冰梅 申请人:北华大学