专利名称：一种需钠弧菌及采用该菌生产琼胶酶的方法
技术领域：
本发明涉及保藏号为CGMCC No. 2428的新微生物，保藏日 期为2008年4月1日，分类命名为弧菌(W6n'o)，后鉴定为需钠 弧菌(J^Wo"^n'ge"s)，本发明还涉及该菌株生产琼胶酶的方法。
背景技术：
琼胶是某些海藻细胞壁中的一种水溶性多糖，由琼脂糖和琼 脂胶组成。琼脂胶主要由含硫酸基、甲基等取代基团、结构复杂 的多糖链构成。琼脂糖是由(1—3)-0-P -D-半乳糖和 (1—4)-0-3， 6-内醚-a -L-半乳糖交替组成的线形链状分子。
琼胶酶是一种降解琼脂糖的糖基水解酶，产酶菌多为海洋细 菌。通过查阅资料、文献检索所知，J/teracoccus、 J/femmo"as、 5ac/〃ws 、 Cytop/zaga、 Af/crascz7/a、 Afz'cro6w/6i/^"、尸seMfi oa/teA"owoMas、 /^ew^wowas、 S/re; towycas、 Zo&〃/a等属中的某些菌株可产生琼 胶酶，中国专利200410023656.1报道了一种从我国南海海域分离 的生产琼胶酶的新菌种爿teramo"m sp. nov. SY 37-12 (CCTCC M204009)。
琼胶酶水解海藻产生的寡糖往往具有抗肿瘤、抗病毒、增强 免疫等性质，可作为手性药物拆分剂应用于生物医药领域，推动生物催化和生物转化的产业化工作。海洋中藻类含量极其丰富， 将是未来人类食品有效来源之一，琼胶酶水解海藻产生的低聚糖 用于生物质能源和食品，对于实现能源多样化，缓解能源危机， 提高已有资源的利用价值，具有重大的作用，并将对传统能源和 食品行业产生深远影响。此外，琼胶酶还可作为分子生物学的报 告基因和多糖结构测定的工具酶、海产养殖的酶制剂等。可见， 琼胶酶作为手性药物拆分剂、生物活性物质生产剂、风味改进剂， 可广泛应用于生物医药、食品化工、海产养殖等领域。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能生产具有高酶活性琼胶酶的 菌株。
本发明的菌株是从自然环境中分离出来的新菌株，以往也没
有需钠弧菌(K6n'o""m'egem或简写为生产琼胶酶 的报道。制备琼胶酶的需钠弧菌(K "^n'egera)分离自东海沉积 物，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌 种保藏号为CGMCC No. 2428。
经形态鉴定及生物学特性研究，保藏号为CGMCC No. 2428的 菌株具有以下特征
(1) 菌落形态菌落呈圆形，表面光滑，边缘平整，凸起， 乳白色。
(2) 细胞形态革兰氏阴性菌，细胞显微镜下(Olympus， BX40)呈现运动性，形态为杆状居多(2-3 [imx 0,4-0.6 pm)。
(3)生理生化特征好氧生长，氧化酶、接触酶阳性，吲哚 反应阴性，不水解淀粉、酪素、纤维素，能利用酵母膏、葡萄糖、 阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖，不能利用木聚糖、乳糖、山梨醇，对 庆大霉素、氯霉素敏感。
对保藏号为CGMCC No. 2428的菌株的16S rRNA基因进行 PCR扩增与序列测定，发现16S rRNA基因部分片断长度为532 bp， 与已知需钠弧菌(K"Wr/"em)的16S rRNA基因序列相似性为 99.4% 。菌株K ""Wegmy CGMCC No. 2428的16S rRNA序列具 体可见序列表。
因lt匕，参照《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》第二 版第二巻的内容，根据菌株的限制因子特点、形态特征和生理生 化指标，结合16SrRNA基因序列相似性，鉴定菌株CGMCC No. 2428为需钠弧菌(K "aWegera )。
本发明的另一个目的是提供一种采用CGMCC No. 2428生产 琼胶酶的方法，包括以下步骤
(1) 将需钠弧菌(CGMCC No. 2428)接种至发酵培养基中， 20 — 37t:培养5-10小时；
(2) 往发酵培养基中加入无菌琼脂糖诱导培养15-25小时；
(3) 发酵培养基经高速离心，上清液经过微孔滤膜后，旋转 蒸发至干，即得琼胶酶。
上述方法步骤(1)中，需钠弧菌可接种于pH值为6.5-8.5 (优选7.5)的发酵培养基中，在20-37。C (优选30-35"C)温度下培养 5-10小时(优选7小时)，使菌株K CGMCC No. 2428
达到对数生长期。所述的发酵培养基组成如下氯化钠5-10g/L， 水合氯化镁2-6g/L，氯化钾0.5-2.5 g/L，胰蛋白胨5-20 g/L，其余 为水，pH为6.5-8.5 (优选7.5)。
上述方法步骤(2)中，需加入无菌琼脂糖诱导菌株表达琼脂 酶。往培养基中加入加入无菌琼脂糖至终浓度0.05-5 g/L (优选为 lg/L)， 150-250 (优选180) rpm培养3-6 h后，转速下调至50-100 rpm (优选80rpm)再培养15-25 h (优选18 h)，得到需钠弧菌(K "afr/egera)的富集培养液。
上述方法步骤(3)中，将步骤(2)中的富集培养液高速离 心，例如5000-10000 rpm离心5-10 min，经离心获得的上清液中 含有琼胶酶。上清液通过0.22pm孔径的微孔滤膜后，旋转蒸发至 干，即为KCGMCC No. 2428琼胶酶，4"低温保藏备 用。
本发明发现的K CGMCC No. 2428生长周期短，7 h
就达对数生长期，该菌能诱导表达琼胶酶，诱导表达时间为17-22 h。通过简单的分离方法，可从培养液中收集高活性的琼胶酶。本 发明提供的琼胶酶制备工艺简单，成本低廉，大量快速，适合运 用于工业生产或医药领域，以生产琼胶低聚糖广泛应用于生物医 药、食品化工、海产养殖等领域。
图1为K "Wr/egmy CGMCC No. 2428生长曲线图； 图2为不同琼脂糖诱导条件下K m7W"my CGMCC No. 2428 琼胶酶酶活力曲线图3为不同培养时间条件下K CGMCC No. 2428琼
胶酶酶活力曲线图
具体实施例方式
实施例1:需钠弧菌CGMCC No. 2428的
分离筛选
将采自我国东海沉积物样品2 g放在50 ml含玻璃珠的过滤除 菌陈海水中，振荡打散，取上清液过滤除菌陈海水梯度稀释后涂 布筛选培养基平板，37。C培养7天左右，观察结果。菌落周围形 成凹陷的菌株挑选保藏，经卢戈氏碘液鉴定，菌落周围形成透明 圈者为产酶菌株。将筛选获得的菌株接种液体筛选培养基，测定 发酵液的琼胶酶活力，筛选出一株产琼胶酶菌株，保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 2428。菌株筛选培养基(g/L):氯化钠19.45，氯化镁8,8， 氯化钙1.8，氯化钾0.55，碳酸氢钠0.16，柠檬酸铁0.1，溴化 钾0.08，氯化锶0.034，硼酸0.022，磷酸氢钠0.008，硅酸钠 0.004，氟化钠0.0024，硝酸铵0.0016，酵母抽提物5.0，蛋白胨 1.0， pH7.4，其余为水。实施例2:需钠弧菌(K "a/n'ege/w) CGMCC No. 2428的形态 鉴定及生物学特性
K "Wn'egera CGMCC No. 2428接种于发酵培养基(DSMZ medium 308)，培养基组成如下(g/L):氯化钠5.0，水合氯化镁4.0， 氯化钾1.0，胰蛋白胨10.0， pH7.5，其余为水。制备固体培养基 可再加入20 g/L的琼脂。12rC灭菌30分钟。接种培养后，经鉴 定，该菌具有以下特征(1)菌落形态菌落呈圆形，表面光滑，
边缘平整，凸起，乳白色。(2)细胞形态革兰氏阴性菌，细胞
显微镜下(Olympus, BX40)呈现运动性，形态为杆状居多(2-3 pm x 0.4-0.6 pm)。 (3)生理生化特征好氧生长，氧化酶、接触酶阳 性，H引哚反应阴性，不水解淀粉、酪素、纤维素，能利用酵母膏、 葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖，不能利用木聚糖、乳糖、山 梨醇，对庆大霉素、氯霉素敏感。
实施例3:需钠弧菌(KCGMCC No. 2428的16S rRNA基因的PCR扩增与序列测定
K ""/;^取ra CGMCC No. 2428接种于固体发酵培养基，从斜面 中直接挑取一环菌体，加入400 无菌水混匀，IO(TC水浴5分钟， 12000rpm离心2分钟，上清直接用于PCR。扩增16SrRNA基因 的一对通用引物如下
正向引物5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3';
反向引物5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3';上述引物分别对应大肠杆菌的16SrRNA基因的8—27和1510 —1492位碱基。PCR反应体系(50juL)为10xbuffer 5 jliL， 10 mM dNTPs 1 )iL， 4 mM引物各1 (iL， ddH20 42 ^L， Taq酶0.5 ^L， 模板DNA0.5pL。 PCR反应条件为94。C变性45s; 55。C退火45 s; 72t:延伸90 s， 30个循环后72。C延伸10 min。 PCR产物纯化与 序列测定由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。完成测定的 16S rRNA基因部分片断长度为532 bp，与菌株K ATCC 14048T的相关序列相似性为99.4% 。菌株K m^/egms CGMCC No. 2428的16S rRNA序列具体可见序列表。
因lt匕，参照、《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》第二 版第二巻的内容，根据菌株的限制因子特点、形态特征和生理生 化指标，结合16SrRNA基因序列相似性，鉴定菌株CGMCC No. 2428为需钠弧菌(K朋^7'egem)。
实施例4:需钠弧菌(K"afr7'egera) CGMCC No. 2428琼胶酶
发酵生产条件
K "Wn'ege似CGMCC No. 2428接种于发酵培养基(DSMZ medium 308)，其生长范围与最佳生长条件如下NaCl浓度范围为 1-100 g/L，最适为5-10g/L;生长pH值范围为6.5 — 8.5，最适为 7.5;生长温度范围为20 —37°C，最适为30 — 35。C。 K CGMCC No. 2428接种于DSMZ medium 308培养基35。C培养7小 时可至对数生长期(图1)。琼脂糖是琼胶酶的诱导剂。将不同浓度的无菌琼脂糖(0、 0.05、
0.1、 0.2、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0g/L)加入处于对数生长期的菌液中， 180rpm培养4h后，转速下调至80 rpm继续培养24 h。还原糖浓 度测定根据3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法，具体描述如下培 养液经5000 rpm离心10min，直接取200 |il上清液加入等体积的 反应底物溶液(琼脂糖2.0g/L、氯化钠5.0g/L、 Tris-HCl 50mM， pH7.5)，溶液充分混匀后55。C反应30min，再加入300 fil DNS溶 液沸水浴显色7 min。溶液2000 rpm离心5 min后取上清500 |il 稀释至2.5ml，静至lmin后测定光吸收值(OD54。)。定义酶活力 单位(U)为每分钟释放1 pmol还原糖所需要的酶量。K"a/Wege似 CGMCCNo. 2428在不同琼脂糖诱导条件下的酶活力大小见图2， 琼脂糖浓度为5 g/L条件下，K "Wn'egem CGMCC No. 2428琼胶酶 产量优于其他试验条件；琼脂糖浓度为lg/L条件下，K"Wr/egew CGMCCNo. 2428琼胶酶产量可达10.3 U/ml。
将无菌琼脂糖加入处于对数生长期的菌液中，至琼脂糖浓度为 1 g/L和5 g/L， 180 rpm培养4 h后，转速下调至80 rpm继续培养。 每隔4-8h取样，测定上清液中琼胶酶酶活大小(图3)。琼脂糖诱 导表达17-22 h， K CGMCC No. 2428琼胶酶产量即可达
到最大值，为17-20 U/ml。
实施例5:需钠弧菌冊)CGMCC No. 2428琼
胶酶制备对数生长期的K waWege似CGMCC No. 2428菌液中加入无菌 琼脂糖至终浓度1 g/L， 180 rpm培养4 h后，转速下调至80 rpm 培养18 h。溶液5000 rpm离心10 min，上清液通过0.22 ^rni孔径 的微孔滤膜后，40-45°。旋转蒸发至干，即为CGMCC No. 2428琼胶酶，4。C低温保藏备用。使用过程中，采用 Tris-HCl-NaCl溶液(氯化钠5.0 g/L、 Tris-HCl 50 mM， pH=7.5) 溶解，加至琼脂糖溶液混匀后55i:温浴12-24 h，即可产生琼胶低 聚糖。序列表
〈110>国家海洋局第二海洋研究所
<120〉 一种需钠弧菌及采用该菌生产琼胶酶的方法
〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3. 3
〈210〉 Seq ID No. 1
〈211〉 532
〈212〉 腿
〈213〉 附Wo "afn'egms 〈400〉 Seq ID No. 1
CCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCC60
AAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTG120
GTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCAC180
ACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAA240
TGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGC300
ACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGGGGTTAATAGCTGCTTTATTTGACGTTAGCGACAG360
AAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAA420
TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCG■
GGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAG540
权利要求
1、一种需钠弧菌Vibrio natriegens)，菌种保藏号为CGMCCNo.2428。
2、 根据权利要求1所述的需钠弧菌(K/Z^io /7S^^'e^/^)， 其特征在于所述需钠弧菌(h'^^'o朋triege77S)的16S rRNA 序列如SeqIDNO.l所示。
3、 一种利用权利要求1所述的需钠弧菌(Kz'^7'o朋^i塔e/w) 制备琼胶酶的方法，包括如下步骤(1) 将需钠弧菌(CGMCCNo.2428)接种至发酵培养基中， 20 — 37'C培养5-10小时；(2) 往发酵培养基中加入无菌琼脂糖诱导培养15-25小时；(3) 发酵培养基经高速离心，上清液经过微孔滤膜后，旋转 蒸发至干，即得琼胶酶。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1) 中的发酵培养基包括如下成分氯化钠5-10g/L，水合氯化镁2-6 g/L，氯化钾0.5-2.5 g/L，胰蛋白胨5-20 g/L，其余为水，pH为 6.5-8.5。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中的发酵培养基包括如下成分氯化钠5g/L，水合氯化镁4g/L， 氯化钾lg/L，胰蛋白胨10g/L，其余为水，pH为7.5。
6、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养温度为30-35°C。
7、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2) 中往发酵培养基中加入无菌琼脂糖至终浓度0.05-5 g/L 。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2) 的过程为培养基中加入无菌琼脂糖至终浓度0.05-5 g/L， 150-250 rpm培养3-6h后，转速下调至50-100 rpm，再培养15-2511，得到 需钠弧菌(KwaWegew)的富集培养液。
9、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3) 中的离心速度为5000-10000 rpm。
10、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3) 中的微孔滤膜孔径为0.22 ,。
全文摘要
本发明涉及一种能生产琼胶酶的新型微生物需钠弧菌(Vibrionatriegens)CGMCC No.2428以及该菌生产琼胶酶的方法。该菌分离自东海沉积物，属于革兰氏阴性菌，好氧生长，最适生长NaCl浓度为5-10g/L，最适生长pH值为7.5，能利用酵母膏、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等多种糖类作为能源与碳源生长，经鉴定该菌属于Vibrio natriegens。V.natriegens CGMCC No.2428生长周期短，7h就达对数生长期，该菌能诱导表达琼胶酶，通过简单的分离方法，可从培养液中收集琼胶酶。本发明提供的琼胶酶制备工艺简单，成本低廉，大量快速，可运用于工业生产或医药领域，以产生琼胶低聚糖。
文档编号C12N1/20GK101451113SQ20081012199
公开日2009年6月10日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日
发明者敏 吴, 杨俊毅, 王春生, 许学伟 申请人:国家海洋局第二海洋研究所