一种转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法

专利名称：：一种转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法
技术领域：
：-本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法。
背景技术：
：三苯基甲垸类染料是仅次于偶氮染料的一大类染料，应用广泛，由于其具有生物毒性及致癌、致畸、致突变的"三致"作用已严重威胁到人类健康及生态平衡。其中的孔雀石绿更是由于曾被广泛用作水产养殖的防霉剂导致在水体及鱼体中残留而引起世人的广泛关注。近年对印染废水的物理、化学及生物处理方法进行了多方面的研究，己取得一定的进展。物理、化学方法主要包括以无机和有机高分子絮凝剂为主的絮凝法，以臭氧、H2Cb和Fenton试剂、Cl20为主的氧化法，利用氧化还原、电凝聚及电气浮等作用的电化学法，利用光催化氧化法的光化学法，利用吸附剂的吸附法和利用超滤或反渗透技术的膜分离法等。这些方法均有成本高和造成二次污染等缺点。嗜水气单胞菌^era附omw/^c/rop/H'/flsubsp.DN322是从印染废水处理厂的活性污泥中分离到的一株对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿等多种三苯基甲烷类染料具有高效脱色能力的嗜水气单胞菌。从该菌中分离到一种新的三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD基因，三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD蛋白分子量为58.8kDa，等电点为5.6。酶蛋白是由两个相同分亍量的亚基组成的二聚体，每个亚基的分子量为29.4kDa。该酶能够催化结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀石绿等多种三苯基甲垸类染料脱色降解，对底物具有结构专一性。脱色酶TpmD催化的脱色反应依赖于分子氧和辅酶NADH或NADPH的存在，属于NADH/NADPH依赖型的氧化酶类。酶的分子结构中含有血红素卟啉环，催化活性受细胞色素P450特异性抑制剂的强烈抑制，催化反应中有自由基的参与，这三方面特性与P450单加氧酶十分相似，但光谱特征上却没有典型P450单加氧酶在450nm处所特有的特征吸收峰("细菌脱色酶TpmD对三苯基甲垸类染料脱色的酶学特性研究"，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国萍微生物学报，第46巻第3期，第385389页，2006年4月)
发明内容-为了充分发挥嗜水气单胞菌DN322三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD在三苯基甲烷染料染料治理中的作用，实现该酶的大规模产业化应用，首先要实现该酶的大量、稳定表达，并可分泌到胞外。但是嗜水气单胞菌对鱼类、蛙类具有潜在的致病性从而限制了该菌株在环境生物修复中的广泛应用。而毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效的真核表达系统，它具有表达量高、稳定性好、酶活性高、能分泌至胞外、便于工业化生产等优点，因而可用于酶制剂的产业化发酵生产。基于上述发明构思，本发明的目的是提供了一种能胞外分泌三苯基甲垸类染料脱色酶，裂解三苯基甲烷类染料骨架结构，进行氧化脱色的转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法。本发明通过下述方案予以实现的本发明所述的转基因毕赤酵母基因工程菌株，是将嗜水气单胞菌DN322中的三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因，其DNA序列如SEQ1所示，编码的蛋白序列三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD如SEQ2所示，与表达载体连接后导入毕赤酵母i^&a戸Wo^X-33，构建而成的转基因工程菌，该菌能胞外分泌三苯基甲烷类染料脱色酶。所述转基因毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其步骤如下a)从嗜水气单胞菌DN322克隆三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD基因；b)将三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD基因与表达载体pPICZaA载体连接，构建质粒pPICZaA國tpmD;c)将构建的质粒pPICZaA-tpmD酶切线性化后，导入毕赤酵母菌尸/c/^X-33中；d)测定三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因转化进入了毕赤酵母菌尸/c//a;7a^0&X-33中，从而得到转基因毕赤酵母基因工程菌株。本发明所构建的工程菌的活性测定是通过将工程菌经甲醇诱导表达后，通过对三苯基甲烷类染料的脱色来测定的。用于本发明的嗜水气单胞菌DN322,已经在文献中公开记载(参考文献"细菌脱色酶TpmD对三苯基甲烷类染料脱色的酶学特性研究"，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国萍微生物学报，第46巻第3期，第385389页，2006年4月；"细菌脱色酶TmpD的酶学特性研究"，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国萍微生物学报，第46巻第5期，第823826页，2006年10月)，上述微生物本申请人也持有，并且保证可以在本发明申请日起20年内向公众提供。本发明成功的构建了转基因毕赤酵母基因工程菌株，实验证明该工程菌能在胞外分泌三苯基甲烷类染料脱色酶，并具有较高的活性。本工程菌的成功构建实现了安全的将苯基甲垸类染料脱色酶大量胞外分泌表达，该脱色酶可与酶制剂载体混合制成可用于印染废水治理和水产养殖水体净化的酶制剂，用于环境的生物修复。工程菌的构建成功为该酶的大规模产业化应用于三苯基甲烷染料治理中奠定了基础。图1是三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因的PCR扩增结果电泳图，其中泳道M为DNAMarker(DL2000)，1为三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因扩增产物。图2是重组质粒pMD18-T-tpmD的酶切鉴定结果电泳图，其中M为DNAMarker(DL2000);泳道1为pMD18-T-tpmD用EcoRI和NotI双酶切的结果。图3是重组表达载体pPICZaA-tpmD的酶切鉴定结果电泳图，泳道M为DNAMarker(DL5000);泳道1为重组表达载体pPICZaA-tpmD用EcoRI和NotI双酶切鉴定结果。图4是重组表达载体pPICZaA-tpmD的SacI线性化结果电泳图，泳道M为DNAMarker(DL5000);泳道1为重组表达载体pPICZaA-tpmD用SacI酶切线性化结果。具体实施例方式以下实施例是对本发明的具体说明，不是对本发明的限制。实施例1:(O扩增引物合成根据已获得的TpmD基因序列和穿梭质粒载体pPICzaA(从lnvitrogen公司购买)的克隆位点设计PCR扩增引物。上游引物长34个碱基N-EcoRI:5，-AGACTGAATTCATGTCAATTGCGGTTACAGGTGC-3，(下划线处为内切酶EcoRI位点)，下游引物长33个碱基C-NotI:5，-TATCAGCGGCCGCCATTTTCAGGGCTTGTTTTA-3，(下划线处为内切酶NotI位点)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。(2)目的基因TpmD的PCR扩增以嗜水气单胞菌DN322总DNA为模板，以N-EcoRI和C-Notl为引物进行PCR扩增。反应体系为200ul，反应组分为灭菌双蒸水165ul;lOxpfoTaqBuffer20ul;10mMdNTP4ul;N誦EcoRI4ul;C國Notl4ul;DN322总DNAlul;pftiTaq酶2ul。其反应参数为94。C预变性5min;94。C变性45s;54。C退火45s;72。C延伸2min，30个循环;72"C再延伸10min。1%琼脂糖检测PCR结果，电泳结果如图l所示，结果表明克隆到了目的基因TpmD，测序，其序列如SEQ1所示。(3)PCR产物经胶回收并克隆至T载体按照上海生工生物工程公司PCR产物胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段TpmD，回收产物克隆于pMD18simple-T(TaKaRa公司)载体中得到重组载体pMD18-T-tpmD，将该重组载体转入大肠杆菌DH5a中，双酶切电泳鉴定(图2)表明目的基因片段TpmD成功与pMD18simple-T载体连接，并转化到大肠杆菌DH5a中。(4)穿梭表达质粒的构建提取重组载体pMD18-T-tpmD，用￡coiI和MfI双酶切以得到目的片段TpmD;同样双酶切质粒pPICZaA，并将二者进行切胶回收。将回收的TpmD基因片段和空载体pPICZaA在T4DNA连接酶的作用下16'C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，在Zeocin=25mg/L的YPD平板上筛选阳性克隆，并进行酶切验证，酶切产物经1%琼脂糖检测，结果如图3所示，表明已成功构建TpmD基因与pPICZaA的连接产物。(5)电转化毕赤酵母X-33(a)毕赤酵母X-33电转感受态的制备(方法参考Invitrogen公司表达载体说明书)挑取毕赤酵母X-33单菌落接种于5mLYPD培养基中，3(tc培养过夜；接禾中0.1-0.5ml菌液于500ml新鲜YPD培养基中过夜培养，至OD60。=1.3-1.5;在离心力为1500g的条件下，4'C离心细胞5min，以500mL(TC无菌水中重悬菌体；在相同条件下再次离心菌体，以250mL(tc无菌水重悬细胞；在相同条件下第三次离心菌体，以20mL(tc的1M山梨醇重悬细胞；在相同条件下最后一次离心菌体后，以lmLO。C的1M山梨醇混匀后置于冰上备用。(b)质粒pPICZaA-tpmD的转化提取重组质粒pPICZaA-tpmD，用SacI进行酶切线性化，电泳检测结果如图4所示，以同样酶切空质粒pPICZaA作为对照。取80ul上述感受态细胞，与线性化的重组质粒混匀，并加到经冰浴后的0.20111电转杯中；将电转杯继续冰浴5-10min;放入电转仪(Eppendorf)中，1500V-2000V电压，5ms进行电击转化；后将混合液加入lmL1M山梨醇中，3(TC静置2h;取出100ul菌液涂布于Zeocin终浓度为100mg/L的YPDS平板上，30。C培养2-3天，直到出现单菌落。(6)筛选阳性转化子挑取阳性克隆子，以N-EcoRl和C-NotI为引物进行菌落PCR验证。具体方法为将菌落挑入50ulddH20中，IO(TC加热5min，12000rpm离心5min后，将上清作为PCR的模板。PCR反应体系为25ul，反应组分为灭菌双蒸水18.75ul;10xTaqbuffer2.5ul;dNTP0.5ul;上下游引物各0.5ul;模板2ul;Taq酶0.25ul。扩增条件为94。C4min，94°C45s，52°C45s，72'Clmin30s，30个循环，72"C延伸10min。扩增产物用1.0%琼脂糖检测其大小是否正确。(7)基因工程脱色酶TpmD蛋白的诱导表达(a)挑取阳性克隆的单菌落入到5mLYPD液体培养基(1%酵母抽提物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)中，30°C、180rpm培养过夜进行活化；(b)以0.5。/。接种量接种于100mlBMGY液体培养基中，3(TC、180rpm培养至OD600=5.0-6.0。(c)在离心力为1500g的条件下，4'C离心5min收集菌体，并将其悬浮于200mLBMMY培养基中，使起始菌体浓度为0D6qq=1.0-2.0,30°c、180rpm培养；(d)每隔12h加甲醇至终浓度0.5。/。进行诱导表达；(e)诱导72h后，在离心力为1500g的条件下，4°。离心5min后，取上清并于4'C保存。(8)基因工程脱色酶TpmD酶蛋白的活性测定和序列测定取发酵上清液，稀释10倍，于100ul体系中加入稀释后的上清液91ul，5mmd/L的孔雀石绿4ul(终浓度为0.25mmol/L)，2.5mmol/L的NADH5ul(终浓度为12.5umol/L)，马上放入分光光度计中监测OD617变化，以转入空载体的毕赤酵母X-33上清液为对照，两种毕赤酵母的OD变化如表l所示。表l不同时间的吸光度值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通过孔雀石绿的标品的浓度与吸光度的标准曲线计算出孔雀石绿的终浓度为22,5umol/L<=酶活单位(U)定义在lmin内完全降解lumol染料孔雀石绿定义为1个酶活单位。(染料起始浓度-染料终浓度)(umol/L)X测定总体积(L)发酵液酶活(U/L)=-脱色时间(min)X上清液体积(L)式(1)根据式(1)和表l结果计算表明，上述发酵液的活性可达5000U/L。由上述可见，转入三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因的毕赤酵母X-33的上清液具有脱色活性，而转入空载体的毕赤酵母X-33则没有脱色活性，因此可以看出，转入三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD基因的毕赤酵母X-33分泌了三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD到胞外的发酵液中，并且具有活性。序列表<110>广东省微生物研究所<120>—种转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法<160〉2<210>1<211>864<212>DNA<213>嗜水气单胞菌DN32204eromo"oA>^op///asubsp.DN322)<220><221>CDS<400>1ATGTCAATTGCGGTGACGGGTGGTACTGGTCCACTCGGTGGGCTTGTGATTCAACATTTG60CTCAAAAAAGTTCCCGCCAGTCAAATCATTGCCATCGTGCGTAATGTTGAAAAAGCCTCT120ACTCTTGCCGATCAAGGCGTGGAAGTTCGCCATGGCGACTATAATCAACCGGAATCTCTT180CAAAAGGCTTTTGCAGGTGTCTCCAAGCTGCTCTTTATCTCAGGTCCGCATTATGATAAT240ACGCTTCTTATCGTTCAACATGCAAATGTCGTAAAAGCTGCCAGAGATGCGGGAGTCAAA300CATATTGCTTACACAGGATATGCCTTTGCTGAGGAATCAATAATTCCCCTTGCACACGTA360CATTTAGCAACGGAATATGCCATCCGTACGACCAATATCCCGTATACTTTCCTGCGTAAT420GCCTTATATACGGACTTTTTTGTAAATGAGGGGCTGCGCGCATCCATAGAGTCTGGAGCA480ATTGTTACGAATGCGGGAAGCGGGATCGTTAATTCAGTAACACGCAATGAACTTGCTTTG540GCTGCCGCAACGGTTCTTACAGAGGAAGGGCATGAAAACAAAACGTATAACCTTGTTTCC600AATCAACCGTGGACCTTTGATGAACTTGCCCAAATTCTCTCCGAGGTTTCCGGCAAAAAA660GTCGTGCATCAGCCTGTCTCATTCGAAGAAGAGAAAAATTTCCTCGTAAACGCTGGTGTC720CCTGAGCCGTTTGCTGAAATTACGGCAGCGATCTATGACGCGATTTCCAAAGGAGAAGCG780TCCAAAACATCAGATGGTCTGCAAAAACTGATCGGATCCTTGACCCCTCTGAAGGAAACC840GTAAAACAAGCCCTGAAAATGTAA864<210>2<211>287<212>PRT<213>嗜水气单胞菌DN322(」ero附o"^y/y^rap/n'/asubsp.DN322)<400>2MetSer1VallieAlaLeuGlyValGinLysProHisValLysGlyTyrHisLeuThrPheGlyLeuGlySerAlaAlaTyrAsnGinlieValSerProGluSerLyslieGlyLysMet287lieGinValGluAlaTyrAlaAlaAlaLeuArgGlyAlaLeuLeuPheProGlySerAlaHisArgValPheAspAlaPheThrArgAlalieThrValSerGluPheGluLeuThrLeuValHisGlyThrAspGluVal5Leu20Asn35Arg50Ala65Asn80Arg95Ala110GluTyr125AsnAla140Serlie155ValAsn170ValLeu185SerAsn200GluVal215GlyGlu230AlaGlu245AlaSer260ThrPro275GlyAlaThrGlyProLeuGlyGlyLeu1015LysLysValProAlaSerGinlielie2530GluLysAlaSerThrLeuAlaAspGin4045GlyAspTyrAsnGinProGluSerLeu5560ValSerLysLeuLeuPhelieSerGly7075LeuLeulieValGinHisAlaAsnVal8590AlaGlyValLysHislieAlaHisThr100105GluSerlielieProLeuAlaHisVal115120AlalieArgThrThrAsnlieProTyr130135LeuTyrThrAspPhePheValAsnGlu145150GluSerGlyAlalieValThrAsnAla160165SerValThrArgAsnGluLeuAlaLeu175180ThrGluGluGlyHisGluAsnLysThr190195GinProTrpThrPheAspGluLeuAla205210SerGlyLysLysValValHisGinPro220225LysAsnPheLeuValAsnAlaSerVal235240ILeThrAlaAlalieTyrAspAlalie250255LysThrSerAspAspLeuGinLysLeu265270LeuLysGluThrValLysGinAlaLeu28028权利要求1.一种转基因毕赤酵母工程菌株，其特征在于所述的工程菌株是将嗜水气单胞菌AeromonashydrophilasubspDN322中的三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因与表达载体pPICZaA连接后导入毕赤酵母PichiapastorisX-33，构建而成的转基因工程菌，所述的转基因工程菌能胞外分泌三苯基甲烷类染料脱色酶，所述的TpmD基因序列如SEQ1所示，所述的三苯基甲烷类染料脱色酶的蛋白序列如SEQ2所示。2.权利要求1所述转基因毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于包括下列步骤a)从嗜水气单胞菌DN322克隆三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因；b)将三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因与表达载体pPICZaA载体连接，构建质粒pPICZaA-tpmD;c)将构建的质粒pPICZaA-tpmD酶切线性化后，导入毕赤酵母菌尸/c/u'"paWo^yX-33中；d)测定三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD基因转化进入了毕赤酵母菌尸k/^;a^0/^X-33中，从而得到转基因毕赤酵母工程菌株。全文摘要本发明公开了一种转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法，旨在提供一种安全的能将苯基甲烷类染料脱色酶大量胞外分泌表达的工程菌株。本发明的技术方案是从嗜水气单胞菌DN322克隆三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因；将三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因与表达载体pPICZaA载体连接，构建质粒pPICZaA-tpmD；将构建的质粒pPICZaA-tpmD酶切线性化后，导入毕赤酵母菌PichiapastorisX-33中；测定三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因转化进入了毕赤酵母菌PichiapastorisX-33中，从而得到转基因毕赤酵母基因工程菌株。本发明主要用于环境修复和治理中。文档编号C12N15/53GK101440353SQ20081022012公开日2009年5月27日申请日期2008年12月18日优先权日2008年12月18日发明者任随周,孙国萍,张培培,许玫英申请人:广东省微生物研究所