通过质谱法检测雌酮的方法

专利名称：通过质谱法检测雌酮的方法
技术领域：
本发明涉 及雌酮的检测。在具体的方面，本发明涉及通过质谱法检测雌酮的方法。
背景技术：
以下简单提供本发明背景的描述以有助于理解本发明，这些描述不被承认是描述 或构成本发明的现有技术。雌酮[1，3，5 (10)-雌三烯-3-醇-17-酮或3-羟基-1，3，5 (10)-雌三烯-17-酮] 或El是分子量为270. 37道尔顿的C18留类激素。雌酮主要从源自生殖腺或肾上腺皮质的 雄烯二酮产生。雌酮(或El)是三种自然生成的雌激素之一，另两种是雌二醇和雌三醇，它 们对人体是天然的。其分子式为C18H22 02。雌激素主要负责女性青春期特征的发育和月经周 期的调节。可以检测绝经期女性内的雌酮以测定其雌激素水平。还可以在可能有卵巢癌、 睾丸癌或肾上腺癌的男性或女性内检测雌激素。在绝经期前的女性中，雌酮水平一般与雌 二醇的水平相当。在绝经期后，雌酮水平增加，可能是由于从雄烯二酮到雌酮的转化增加。使用质谱法检测具体的雌酮离子的方法已被描述。例如，Nelson R等，Clinical Chem 2004,50(2) :373_84，和 Xu X 等，Nature Protocols 2007,2(6) 1350-1355 公开了 使用液相层析法和质谱法检测各种雌酮离子的方法。这些方法在用质谱法检测之前，衍生 化雌酮。通过液相层析/质谱法检测非衍生化雌酮的方法已在Diaz-Cruz S等，J Mass Spectrom2003，38 :917-923 和 Nelson R 等，Clinical Chem 2004，50 (2) :373_84 中讨论。 通过气相色谱/质谱法检测雌酮的方法公开在Nachtigall L等，Menopause J of N. Amer. Menopause Society 2000,7(4) 243—250 禾口 Dorgan J 等，Steroids 2002，67 151—158 中。发明概述本发明提供通过质谱法包括串联质谱法检测样品中雌酮的量的方法。一方面，提供测定体液样品中雌酮的量的方法。所述方法可以包括(a)通过液相 层析法纯化体液样品中的雌酮；(b)离子化体液样品中的雌酮；和(c)通过质谱法检测雌酮 离子的量并将检测到的雌酮离子的量与体液样品中雌酮的量相关联。在这方面的某些优选 的实施方式中，所述方法的定量限少于或等于500pg/mL。在其它优选的实施方式中，雌酮 不在质谱法前衍生化。在某些优选的实施方式中，雌酮离子选自质/荷比为269. 07士0. 5、 145. 03士0. 5和143. 02士0. 5的离子。在一些优选的实施方式中，所述方法包括产生一种或 多种雌酮先驱离子，其中至少一种先驱离子具有269. 07士0. 5的质/荷比。在相关的优选 实施方式中，所述方法可以包括产生一种或多种雌酮先驱离子的碎片离子，其中至少一种 碎片离子具有145. 03士0.5或143. 02士0.5的质/荷比。在一些优选的实施方式中，所述 方法可以包括向体液样品中加入足够使雌酮从可能在体液样品中存在的蛋白质中游离出 来的量的试剂。在相关的优选实施方式中，所述方法可以包括酸化体液样品；优选在离子化 前酸化；更优选在纯化前酸化；优选用甲酸酸化。在特别优选的实施方式中，所述体液样品 是血清、血浆或尿液。如本文所用，除非另作说明，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the) ”包括复 数个提及的内容。因此，例如，提及“蛋白质”包括多个蛋白质分子。
如本文所用，术语“纯化(purification)”或“纯化(purifying) ”并不指从样品 中去掉除了关注的分析物(一种或多种)之外的所有材料。相反，纯化是指，相对于样品 中可能干扰关注分析物的检测的其它组分，对一种或多种关注的分析物的量进行富集的过 程。本文通过各种方法纯化样品以去除一种或多种干扰物质，例如一种或多种可能干扰用 质谱法对所选雌酮母离子和子离子进行检测的物质。如本文所用，术语“测试样品”指任何可能含雌酮的样品。如本文所用，术语“体 液”意思是能从个体体内分离出来的任何流体。例如，“体液”可以包括血液、血浆、血清、胆 汁、唾液、尿液、眼泪、汗水等。如本文所用，术语“衍生化”意思是两个分子发生反应形成一个新分子。衍生化试
剂可以包括异硫氰酸酯基团、二硝基-氟苯基基团、硝基苯氧基羰基基团和/或苯二醛基团 和类似物。如本文所用，术语“层析”指这样的方法，其中被液体或气体携带的化学混合物在 它们流经或通过固定液相或固相时由于化学实体的差别分布而被分成组分。如本文所用，术语“液相层析”或LC意思是，当流体均一地渗过细微物质的柱子 时，或通过毛细管通道时，选择性延迟流体溶液的一种或多种组分的过程。延迟是当流体相 对于固定相移动时混合物的组分在一个或多个固定相和大量流体(即，流动相)之间分配 的结果。“液相层析”包括，例如，反相液相层析(RPLC)、高效液相层析(HPLC)和高湍流液 相层析(HTLC)。如本文所用，术语“高效液相层析”或“HPLC”指通过在压力下强制流动相通过固 定相——通常是致密填充的柱子时分离度增加的液相层析。如本文所用，术语“高湍流液相层析”或“HTLC”指层析的一种形式，它利用测定物 质通过柱填充物的湍流作为进行分离的基础。HTLC已被用于在用质谱分析之前制备包含两 种无名药品的样品。参见，例如，Zi_er等，J. Chromatogr. A 854:23-35(1999)；还参见美 国专利号 5，968，367,5, 919，368,5, 795，469和 5，772，874，其进一步解释了 HTLC0 本领域的 普通技术人员理解“湍流”。当流体流动得缓慢而平稳时，所述流被称为“层流”。例如，低流 速通过HPLC柱的流体是层流。在层流中流体粒子的运动是有序的，粒子通常是直线前进。 在更快的速度下，水的惯性克服流体的摩擦力而形成湍流。不与不规则边界接触的流体比 因摩擦力而减慢或因不平坦的表面而偏离的流体“流得更快(outrun)”。当流体汹涌地流 动时，它以漩涡和旋转(或涡旋)的方式流动，比流体是层流时更“拖后(drag)”。很多参 考文献可以用来帮助确定何时流体流动是层流或湍流(例如，Turbulent Flow Analysis Measurement and Prediction, P. S. Bernard & J.M.Wallace, John Wiley &Sons, Inc., (2000) ；An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu &Julian Scott, Cambridge University Press (2001))。如本文所用，术语“气相层析”或“GC”指这样的层析样品混合物被气化并被注射 入载气流中(氮气或氦气)，该载气流移动通过含有由液体或微粒固体组成的固定相的柱 子，并根据化合物对固定相的亲合力而被分离成其组分化合物。
如本文所用，术语“大颗粒柱”或“提取柱(extraction column) ”，指包含的平均 颗粒直径大于大约35 μ m的层析柱。如本上下文所用，术语“大约”意思是指士 10%。在优 选的实施方式中，柱子含直径为大约60 μ m的颗粒。
如本文所用的，术语“分析柱”是指这样的层析柱，其具有足够的层析塔板，以实现 从柱子中洗脱的样品中物质的充分分离，足以允许确定分析物的存在或数量。这样的柱子 常常区别于“提取柱”，提取柱的通常目的是从非保留的物质中分离或提取保留的物质，以 得到纯化样品做进一步分析。如本上下文所用，术语“大约”意思是指士 10%。在优选的实 施方式中，分析柱含直径为大约4 μ m的颗粒。如本文所用，术语“在线(on-line)”或“线上(inline) ”，例如用于“在线自动化 方式”或“在线提取”中，是指在不需要操作者干预的情况进行的方法。相反，本文所用的术 语“离线”是指要求操作者手动干预的方法。因此，如果样品发生沉淀，并且上清液然后被 手动载入自动取样器中，则沉淀和载入步骤是与随后的步骤离线的。在所述方法的各实施 方式中，可以以在线自动化方式进行一个或多个步骤。如本文所用，术语“质谱法”或“MS”是指通过其质量鉴别化合物的分析技术。MS指 基于离子的质/荷比或“m/z”来过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般包括(1)电离 化化合物以形成带电荷的化合物；和(2)检测带电荷化合物的分子量并计算质/荷比。所述 化合物可以通过任何适合的方式电离和检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。一 般来说，一个或多个关注的分子被电离，随后离子被引入质谱仪，在其中，由于磁场和电场 的结合，离子遵循由质量(“m”)和电荷(“ζ”)决定的空间路径。参见，例如，美国专利号 6，204，500，名称为"MassSpectrometry From Surfaces，，;6，107，623，名称为"Methods and Apparatusfor Tandem Mass Spectrometry" ；6, 268, 144,"DNA DiagnosticsBased On Mass Spectrometry，，；6, 124，137,名禾尔为 “Surface-EnhancedPhotolabile Attachment And Release For Desorption And Detection OfAnalytes"；Wright 等，Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2 264-76(1999)；以及 Merchant 禾口 Weinberger， Electrophoresis 21 1164-67(2000)。如本文所用，术语“以阴离子模式操作”是指那些产生和检测阴离子的质谱方法。 类似地，本文所用术语“以阳离子模式操作”是指那些产生和检测阳离子的质谱方法。如本文所用，术语“电离”或“离子化”是指产生具有等于一个或多个电子单位的 净电荷的分析物离子的过程。阴离子是那些具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子， 而阳离子是那些具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。如本文所用，术语“电子电离”或“EI”是指这样的方法，其中气态的或蒸汽相的关 注分析物与电子流相互作用。电子与分析物的碰撞产生分析物离子，然后其可用于质谱技 术。如本文所用，术语“化学电离，，或“Cl，，是指这样的方法，其中试剂气体(例如氨) 经受电子碰撞，通过试剂气体离子与分析物分子的相互作用形成分析物离子。如本文所用，术语“快速原子轰击”或“FAB”是指这样的方法，其中高能原子束(通 常为Xe或Ar)碰撞非挥发性样品，使样品中包含的分子解吸并电离。测试样品被溶解在粘 性液体基质中，诸如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、环丁砜、二 乙醇胺和三乙醇胺。化合物或样品的合适基质的选择是根据经验的方法。如本文所用，术语“基质辅助激光解吸电离，，或“MALDI，，是指这样的方法，其中非 挥发性样品被暴露于激光照射，其通过包括光致电离、质子化作用、去质子化作用和群集衰 变(cluster decay)在内的多种电离方式解吸并电离样品中的分析物。对于MALDI，样品与
6能量吸收基质混合，所述能量吸收基质促进分析物分子的解吸。如本文所用，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”是指另一种方法，其中非 挥发性样品被暴露于激光照射，其通过包括光致电离、质子化作用、去质子化作用和群集衰 变在内的多种电离方式解吸并电离样品中的分析物。对于SELDI，样品通常结合至优先保留 一种或多种关注分析物的表面。如同在MALDI中，该方法也可以使用能量吸收材料以促进 罔子化ο如本文所用，术语“电雾化电离”或“ESI”是指这样的方法，其中溶液沿着短长度 毛细管通过，达到被施加了高的正或负电势的所述毛细管末端。达到管末端的溶液被蒸发 (雾化)成溶剂蒸汽中非常小溶液滴的喷射或喷雾。这种雾滴流动通过汽化室，汽化室被轻 微加热以防止冷凝并使溶剂挥发。当液滴变得更小时，电学表面电荷密度增加，直至相同电 荷之间的自然排斥引起离子及中性分子被释放时。如本文所用，术语“大气压化学电离”或“APCI”是指与ESI相似的质谱法；但是， APCI通过在大气压下发生在等离子体中的离子-分子反应产生离子。等离子体通过喷射毛 细管与对电极之间的放电维持。然后，离子通常通过使用一组差动泵抽的撇去器(skimmer) 阶段被提取至质量分析仪。干燥并预热的N2气的反流可用于提高溶剂的去除。APCI中的 气相电离可以比ESI更有效地用于分析更小极性的种类。如本文所用，术语“大气压光致电离”或“APPI”是指这种形式的质谱法，其中分子 M光致电离的机理是光子吸收和电子射出以形成分子的离子M+。由于光子能量通常恰在电 离电压之上，所以分子的离子解离的可能性较小。在许多情况下，可能的是在不需进行层析 的情况下分析样品，从而节省了许多时间和费用。在水蒸汽或质子溶剂存在的情况下，分子 的离子可吸取H以形成MH+。如果M具有高质子亲合力，这往往发生。这不影响量化精确 度，原因在于M+与MH+的总数是恒定的。质子溶剂中的药物化合物通常被观察为MH+，而非 极性化合物诸如萘或睾酮通常形成M+。Robb, D. B.，Covey, Τ. R.和Bruins，Α. P. (2000) 参见例如，Robb 等，Atmospheric pressure phtoionization Anionization method for liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 72(15) :3653_3659。如本文所用，术语“感应耦合等离子体”或“ICP”是指这样的方法，其中样品与部 分电离的气体在足够高的温度下相互作用以使大部分元素原子化和离子化。如本文所用，术语“场解吸”是指这样的方法，其中非挥发性测试样品被置于电离 表面上，并且强电场被用于产生分析物离子。如本文所用，术语“解吸”是指将分析物从表面去除和/或分析物进入气相。如本文所用，术语“定量限(limitof quantification)，，、“量化限(limitof quantitation) ”或“L0Q”是指测量变得在数量上有意义的点。在该LOQ的分析物响应是可 以确认的、离散的以及可重复的，精密度为20%以及精确度为80%至120%。如本文所用，术语“检测限(limit of detection)”或“L0D”是测量值大于与之相 关的不确定性的点。LOD被任意地定义为零浓度的2倍标准差(SD)。如本文所用，体液样品中雌酮的“量”一般指反映大量体液中可检测的雌酮的质量 的绝对值。但是，也考虑与另一雌酮量相比的相对量。例如，体液中雌酮的量可以是大于一 般存在的雌酮的对比量或常规水平的量。在第二个方面，提供了通过串联质谱法测定体液样品中雌酮的量的方法，其包括(a)用液相层析法纯化体液样品中的雌酮；(b)产生具有269. 07士0. 5质/荷比的雌酮 的先驱离子；(c)产生所述先驱离子的一个或多个碎片离子，其中至少一个碎片离子具有 143. 02士0. 5的质/荷比；和(d)检测在步骤(b)或步骤(c)或二者中产生的一个或多个 所述离子的量，并将检测到的离子与所述体液样品中雌酮的量相关联。在一些优选的实施 方式中，所述方法的定量限少于或等于500pg/mL。在其它优选的实施方式中，雌酮不在质谱 法前衍生化。在某些优选的实施方式中，所述方法可以进一步包括产生雌酮先驱离子的一 个或多个碎片离子，其中至少一个碎片离子具有145. 03士0. 5的质/荷比。在一些优选的 实施方式中，所述方法可以包括向体液样品中加入足够使雌酮从可能在体液样品中存在的 蛋白质中游离出来的量的试剂。在相关的优选实施方式中，所述方法可以包括酸化体液样 品；优选在离子化前酸化；更优选在纯化前酸化；优选用甲酸酸化。在特别优选的实施方式 中，所述体液样品是血清、血浆或尿液。在第三方面，提供了测定体液样品中雌酮量的方法，其包括(a)用足以使雌酮从 可能在体液样品中存在的蛋白质中游离出来的量的试剂酸化体液样品；(b)用液相层析法 纯化体液样品中的雌酮；(c)电离体液样品中的雌酮以产生可用串联质谱法检测的一种或 多种离子；和(d)通过阴离子模式下的串联质谱法检测雌酮离子的量，并将检测到的雌酮 离子的量与所述体液样品中雌酮的量相关联。在一些优选的实施方式中，所述方法的定量 限少于或等于500pg/mL。在其它优选的实施方式中，雌酮不在质谱法前衍生化。在某些优 选的实施方式中，雌酮离子选自具有269. 07士0. 5,145. 03士0. 5和143. 02士0. 5的质/荷 比的离子。在一些优选的实施方式中，所述方法包括产生雌酮的一个或多个先驱离子，其中 至少一个先驱离子具有269. 07 士 0. 5的质/荷比。在相关的优选实施方式中，所述方法可以 包括产生雌酮先驱离子的一个或多个碎片离子，其中至少一个碎片离子具有145. 03士0. 5 或143. 02士0. 5的质/荷比。在一些优选的实施方式中，所述方法可以包括在离子化前酸 化体液样品；更优选在纯化前酸化；优选用甲酸酸化。在特别优选的实施方式中，所述体液 样品是血清、血浆或尿液。在一些优选的实施方式中，可以在质谱法前衍生化雌酮，但是，在某些优选实施方 式中，样品制备排除使用衍生化。 在上述方面的某些优选的实施方式中，使用HTLC和HPLC进行液相层析法，优选结 合HPLC使用HTLC，但是也可使用其它方法，包括例如，蛋白质沉淀以及纯化与HPLC结合。优选实施方式利用高效液相层析(HPLC)，单独使用或与一种或多种纯化方法结合 使用，例如HTLC或蛋白质沉淀，以纯化样品中的雌酮。在本文公开的方法的某些优选实施方式中，在负离子模式下操作质谱。在某些优 选实施方式中，使用APCI或ESI在负离子模式下检测雌酮。在上述方面的优选实施方式中，在体液样品中存在的葡糖苷酸化的和非葡糖苷酸 化的雌酮都被检测和测量。在优选实施方式中，可在质谱仪中检测的雌酮离子选自具有质/荷比(m/z)为 269. 07士0. 5,145. 03士0. 5和143. 02士0. 5的离子；后两者是前驱离子的碎片离子。在特 别优选的实施方式中，先驱离子具有269. 07士0. 5的质/荷比，碎片离子具有143. 02士0. 5 的质/荷比。在优选实施方式中，可分离检测的雌酮内标被提供在样品中，它在样品中的量也被测定。在这些实施方式中，在样品中存在的内源雌酮和内标的全部或部分被离子化，以在 质谱仪中产生多个可检测离子，并且通过质谱法检测一个或多个由各自产生的离子。优选的雌酮内标是2，4，16，16-d4雌酮。在优选的实施方式中，在质谱仪中可检测 的雌酮内标离子选自具有273. 06士0. 5,147. 07士0. 5和145. 04士0. 5的质/荷比的离子。 在特别优选的实施方式中，雌酮内标的先驱离子具有273. 06士0.5的质/荷比；一个或多个 碎片离子选自具有147. 07士0.5和145. 04士0. 5的质/荷比的离子。在优选的实施方式中，通过与参照物如2，4，16，16-d4雌酮的比较，使雌酮离子的 存在或量与测试样品中雌酮的存在或量相关联。在一个实施方式中，所述方法包括液相层析法与质谱法的组合。在优选的实施方 式中，液相层析法是HPLC。优选的实施方式单独利用HPLC或与一种或多种纯化方法例如 HTLC或蛋白质沉淀结合，以纯化样品中的雌酮。在另一个优选的实施方式中，质谱法是串联 质谱法(MS/MS)。在本文公开方面的某些优选的实施方式中，测试样品中雌酮的量化限(LOQ)小于 或等于500pg/mL ；优选地小于或等于400pg/mL ；优选地小于或等于300pg/mL ；优选地小于 或等于200pg/mL ；优选地小于或等于175pg/mL ；优选地小于或等于150pg/mL ；优选地小于 或等于125pg/mL ；优选地小于或等于100pg/mL ；优选地小于或等于75pg/mL ；优选地小于 或等于50pg/mL ；优选地小于或等于25pg/mL ；优选地小于或等于20pg/mL ；优选地小于或 等于15pg/mL ；优选地小于或等于14pg/mL ；优选地小于或等于13pg/mL ；优选地小于或等 于12pg/mL ；优选地小于或等于llpg/mL ；优选地10pg/mL。如本文所用，术语“约”在提及不包括离子质量测量的定量测量时，是指所指值加 上或减去10%。质谱仪在测定给定分析物的质量方面可以稍微变化。术语“约”在离子质 量或离子质/荷比的上下文中是指+/-0. 5原子质量单位。上述的发明概述是非限制性的，并且本发明的其他特征和优势将从以下具体的本 发明描述和权利要求书中显而易见。附图简述

图1显示了使用LC-MS/MS分析，在连续稀释的储存样品中雌酮定量的线性。在实 施例6中进行详细描述。发明详述检测和量化测试样品中雌酮的方法被描述。所述方法采用液相层析法(LC)——最 优选为HTLC与HPLC结合——来进行所选分析物的最初纯化，并且将该纯化与质谱法(MS) 的独特方法组合，由此提供高通过量测试系统，用于检测并量化测试样品中的雌酮。优选的 实施方式特别适于大的临床实验室应用。雌酮方法被提供，其具有提高的特异性并且以比 其它雌酮测试所需的更少的时间和更少的样品制备完成。在优选的实施方式中，测试样品中雌酮的检测限(LOD)小于或等于75pg/mL ；优选 地小于或等于50pg/mL ；优选地小于或等于25pg/mL ；优选地小于或等于10pg/mL ；优选地 小于或等于5pg/mL ；优选地小于或等于4. 5pg/mL ；优选地小于或等于4pg/mL ；优选地小于 或等于3. 5pg/mL ；优选地小于或等于3pg/mL ；优选地小于或等于2. 5pg/mL ；优选地2pg/
mLo合适的测试样品包括可包含关注分析物的任何测试样品。例如，在制备合成雌酮期间获得的样品可以被分析以测定组成和该制备方法的产率。在一些优选的实施方式中， 样品是生物学样品；即，从任何生物来源诸如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。 在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物诸如狗、猫、马等获得。特别优选的哺乳动物是 灵长类，最优选男性人类或女性人类。特别优选的样品包括血液、血浆、血清、头发、肌肉、尿 液、唾液、泪液、脑脊髓液或其它组织样品。这样的样品可从例如患者——即有生命的人，男 性或女性，其将自己置于临床环境中以诊断、预防或治疗疾病或病症——中得到。测试样品 优选地从患者中得到，例如血清。质谱法的样品制备可用于以相对于样品中的其它组分(例如蛋白质)富集雌酮的方法包括例如过 滤、离心、薄层层析(TLC)、包括毛细管电泳在内的电泳、包括免疫亲合分离在内的亲合分 离、包括乙酸乙酯提取和甲醇提取在内的提取法以及离液剂的应用或上述方法的任何组合 或类似方法。多种方法可用于在层析和/或MS样品分析前破坏雌酮与蛋白质之间的相互作用， 以使分析可涉及样品中雌酮的总量(例如游离的雌酮和结合蛋白质的雌酮)。蛋白质沉 淀是制备测试样品，特别是生物学测试样品诸如血清或血浆的一种优选的方法。这样的蛋 白质纯化方法在本领域中是熟知的，例如，Poison等，Journal of Chromatography B785 263-275(2003)描述了适合用于所述方法的蛋白质沉淀技术。蛋白质沉淀可被用于从样品 中去除大部分蛋白质，留下雌酮在上清液中。样品可被离心以将液态上清液与沉淀的蛋白 质分开。所得上清液然后可应用于液相层析和后来的质谱法分析。在某些实施方式中，蛋 白质沉淀诸如例如乙腈蛋白质沉淀的应用消除了在HPLC和质谱法之前对高湍流液相层析 (HTLC)或其他在线提取的需要。因此，在这样的实施方式中，所述方法包括(1)进行所关 注样品的蛋白质沉淀；和(2)在没有使用在线提取或高湍流液相层析(HTLC)的情况下将上 清液直接加样到HPLC-质谱仪上。在其他优选的实施方式中，雌酮可从该蛋白质中释放而不必沉淀蛋白质。例如，可 以添加适合破坏蛋白质和雌酮之间相互作用的量的酸、盐或醇。示例性的这样的试剂包括 甲酸、NaCl或乙醇。在一些优选的实施方式中，HTLC，单独地或与一种或多种纯化方法组合，可被用于 在质谱法之前纯化雌酮。在这样的实施方式中，样品可采用捕获分析物的HTLC萃取柱柱体 进行提取，然后在离子化之前在第二 HTLC柱或分析用HPLC柱上洗脱并层析。因为包含在 这些层析方法中的步骤可以自动方式连接，所以对分析物纯化期间操作者参与的需求可最 小化。该特征可节约时间和费用并排除操作者失误的可能性。应当认为，湍流——诸如HTLC柱和方法提供的——可增强传质速率，改进分离特 征。HTLC柱以高层析流速的方式通过含有硬颗粒的填充柱分离组分。通过应用高流速(例 如3-5mL/min)，在柱中发生湍流，其引起固定相和所关注分析物(一种或多种)之间几乎 完全的相互作用。使用HTLC柱的优势是，由于高分子量的种类在湍流条件下不被保留，避 免了与生物流体基质相关的大分子聚集。将多个分离组合在一个步骤的HTLC方法减小了 对过多样品制备的需要并且以明显更高的速度运行。这些方法还获得优于层流(HPLC)层 析的分离性能。HTLC允许生物样品(血浆、尿液等)的直接注射。直接注射在传统层析形 式中很难获得，原因在于变性的蛋白质和其他生物碎片迅速堵塞分离柱。HTLC也允许小于ImL的极低的样品体积，优选地小于0. 5mL，优选地小于0. 2mL，优选地0. lmL。在质谱法分析前应用于样品制备的HTLC的实例已在别处描述。参见例如Zimmer 等，J. Chromatogr. A 854 :23_35 (1999)；也可参见美国专利号 5，968，367,5, 919，368、 5，795，469和5，772，874。在所述方法的某些实施方式中，样品在加样至HTLC柱前经历如 上所述的蛋白质沉淀；在可选的优选实施方式中，样品可直接加样至HTLC而不经历蛋白质 沉淀。优选地，HTLC与HPLC结合使用以提取并纯化雌酮而使样品不经历蛋白质沉淀。在 相关优选的实施方式中，纯化步骤包括(i)将样品应用至HTLC提取柱，(ii)在雌酮被柱保 留的条件下洗涤HTLC提取柱，(iii)从HTLC提取柱上洗脱保留的雌酮，(iv)将保留的物 质应用至分析柱，以及(ν)从分析柱上洗脱纯化的雌酮。HTLC提取柱优选地是大颗粒柱。 在多种实施方式中，所述方法的一个或多个步骤可以在线自动方式进行。例如，在一个实施 方式中，步骤(i)-(v)以在线自动方式进行。在另一个实施方式中，电离和检测步骤在步骤 (i)-(v)后在线进行。包括高效液相层析(HPLC)在内的液相层析(LC)依赖于相对慢的层流技术。传统 的HPLC分析依赖于柱填充，其中样品穿过柱的层流是将所关注分析物从样品中分离的基 础。本领域普通技术人员会理解这种柱中的分离是扩散过程。HPLC已经成功地用于生物 学样品中化合物的分离；但是，在分离和随后的用质谱仪(MS)分析之前需要大量的样品制 备，使得该技术是密集型劳动。此外，大部分HPLC系统没有尽其最大可能地利用质谱仪，使 得仅仅一个HPLC系统连接到单一的MS仪器，导致进行大量测定需要过长的时间。已经描述了各种方法，其使用HPLC用于质谱法分析之前的样品清理(clean-up)。 参见例如 Taylor 等，Therapeutic Drug Monitoring22 :608_12 (2000)；和 Salm 等，Clin. Therapeutics 22 Supl. B :B71_B85(2000)。本领域普通技术人员可以选择适合雌酮使用的HPLC仪器和柱。层析柱通常包括 便于分离化学物部分(即分馏)的介质(即填充物质)。介质可包括微小颗粒。颗粒包括 结合表面，其与各种化学物部分(chemicalmoieties)相互作用以促进化学物部分的分离。 一个合适的结合表面是疏水性结合表面诸如烷基结合表面。烷基结合表面可包括C-4、C-8、 C-12或C-18结合烷基基团，优选地是C-18结合基团。层析柱包括接收样品的入口和排出 包括分馏的样品的流出物的出口。在一个实施方式中，样品(或预先纯化的样品)在入口处 被施加到柱，用溶剂或溶剂混合物进行洗脱，并且在出口处排出。可选择不同的溶剂模式用 于洗脱所关注的分析物(一种或多种)。例如，液相层析可采用梯度模式、等度模式或多型 (即混合)模式进行。在层析期间，物质的分离受到变量诸如洗脱液(也称为“流动相”)、 洗脱模式、梯度条件、温度等选择的影响。在某些实施方式中，分析物可在所关注分析物被柱填充物质可逆地保留而一种或 多种其它物质没有被保留的条件下通过将样品施加到柱中进行纯化。在这些实施方式中， 可应用第一流动相条件，其中所关注分析物被柱保留，并且一旦未保留的物质被洗涤穿过， 随后可应用第二流动相条件以从柱中去除保留的物质。可选地，分析物可在相比一种或多 种其它物质所关注分析物以不同的速度洗脱的流动相条件下，通过将样品施加到柱中进行 纯化。这种方法可相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种所关注分析物的量。在一个优选的实施方式中，HTLC后可在疏水柱层析系统上进行HPLC。在某些优 选的实施方式中，使用的是来自Cohesive Technologies的TurboFlow Cyclone P 聚合物基柱(60μπι粒子，50\1.0!11111柱，100入孔)。在相关优选的实施方式中，使用的是具有疏 水封端、来自Phenomenex Inc的Synergi Polar-RP 醚连接的苯基分析柱(4 μ m粒子， 150X2. Omm柱，80A孔)。在某些优选的实施方式中，使用HPLC级超纯水和100%甲醇作为 流动相进行HTLC和HPLC。通过仔细选择阀门和连接器管道，两个或多个层析柱可按需要连接，以使物质从 一个穿过至下一个而不需任何手动步骤。在优选的实施方式中，阀门和管道的选择通过预 编程序的计算机进行控制以进行必要步骤。最优选地，层析系统也以这种在线方式连接至 检测器系统，例如，MS系统。因此，操作者可将一盘样品置于自动取样器中，并在计算机控 制下进行剩余的操作，实现全部所选样品的纯化和分析。在某些优选的实施方式中，测试样品中存在的雌酮可在电离前被纯化。在特别优 选的实施方式中，层析不是气相层析。优选地，所述方法可在质谱分析前不将雌酮进行气相 层析而进行。通过质谱讲行检测和量化在多种实施方式中，测试样品中存在的雌酮可通过本领域普通技术人员已知的任 何方法进行电离。质谱法采用质谱仪进行，所述质谱仪包括离子源，用于电离分馏的样品 并产生带电分子用于进一步分析。例如样品的电离可通过电子电离、化学电离、电雾化电 离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光电离、大气压光电离(APPI)、快速原子轰击 (FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等 离子喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、感应耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进 行。本领域普通技术人员应理解电离方法的选择可根据要测量的分析物、样品类型、检测器 类型、正_负模式的选择等进行确定。在优选的实施方式中，雌酮通过电雾化电离(ESI)以负模式进行电离。在相关优 选的实施方式中，雌酮离子是气态并且惰性碰撞气体是氩或氮。在可选的优选实施方式中， 雌酮通过大气压化学电离(APCI)以负模式进行电离。在其它优选的实施方式中，雌酮通过 电雾化电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)以正模式进行电离。271. 17(先驱离子)以 及159. 2和133. 2 (碎片离子)的质量转变(mass transition)可以被用于以正模式进行 检测和量化。样品已经电离后，由此产生的带正电或带负电的离子可进行分析以测定质/荷 比。用于测定质/荷比的合适分析器包括四极分析器、离子阱分析器和飞行时间分析器。离 子可采用几种检测模式进行检测。例如，所选离子可以进行检测，即采用选择离子监测模式 (SIM)，或者可选地，离子可采用扫描模式例如多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)进 行检测。优选地，质/荷比采用四极分析器进行测定。例如，在“四极”或“四极离子阱”仪 器中，振荡射频场中的离子经历与电极之间施加的DC电压、RF信号的振幅和质/荷比成比 例的力。可以选择电压和振幅，以致于只有特定质/荷比的离子经过四极的长度，而所有其 它离子是偏离的。因此，四极仪器可对注入到仪器的离子起到“质量过滤器”和“质量检测 器”的作用。技术人员可通过利用“串联质谱法”或“MS/MS”提高MS技术的分辨率。在该技术 中，从所关注分子中产生的先驱离子(也称为母离子)可在MS仪器中进行过滤，并且先驱 离子随后成碎片以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)，其然后在第二
12MS程序中进行分析。通过仔细选择先驱离子，仅仅由某些分析物产生的离子通过至碎裂室， 其中与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。因为先驱离子和碎片离子都是在一组给定的电 离/破裂条件下以可重复方式产生的，所以MS/MS技术可提供极其强大的分析工具。例如， 过滤/破裂组合可被用于消除干扰物质，并且可特别用于复杂样品诸如生物学样品。质谱仪一般给用户提供离子扫描；即，在给定范围(例如100至IOOOamu)内具有 特定质/荷比(m/z)的各个离子的相对丰度。分析物测试的结果，即质谱，可通过本领域已 知的许多方法关联到原始样品中分析物的量。例如，假定对取样和分析参数进行仔细控制， 可将给定离子的相对丰度与将该相对丰度转化成原始分子的绝对量的表进行比较。可选 地，分子标准可与样品一起运行，并且基于从那些标准中产生的离子构建标准曲线。利用这 种标准曲线，给定离子的相对丰度可被转化成原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式 中，内标被用于产生计算雌酮的数量的标准曲线。产生和利用这种标准曲线的方法在本领 域中是熟知的，并且本领域普通技术人员能选择合适的内标。例如，雌酮的同位素可被用作 内标；在某些优选的实施方式中，所述标准是d4-雌酮。将离子的量与原始分子的量关联的 许多其它方法对本领域普通技术人员应是熟知的。所述方法的一个或多个步骤可采用自动仪器进行。在某些实施方式中，一个或多 个纯化步骤在线进行，并且更优选地所有纯化和质谱法步骤可以在线的方式进行。在某些实施方式中，诸如MS/MS，其中先驱离子被分离以进一步破裂，碰撞活化分 裂(CAD)通常被用于产生碎片离子以进一步检测。在CAD中，先驱离子通过与惰性气体碰 撞获得能量，并且随后通过被称为“单分子分解”的过程产生碎片。足够的能量必须储蓄在 先驱离子中以致于离子内的某些键可由于增加的振动能而断开。 在特别优选的实施方式中，雌酮如下采用MS/MS进行检测和/或量化。样品经历液 相层析，优选地是HTLC接着是HPLC，来自层析柱的液体溶剂流进入MS/MS分析仪的加热喷 雾器界面，并且溶剂/分析物混合物在界面的加热管中被转化为蒸汽。包含在雾状溶剂中 的分析物(例如雌酮)被界面的电晕放电针电离，其将大的电压施加到雾状溶剂/分析物 混合物。离子例如先驱离子穿过仪器的孔并且进入第一个四极。四极1和3(Q1和Q3)是 质量过滤器，允许根据它们的质/荷比(m/z)选择离子(即“先驱”离子和“碎片”离子)。 四极2(Q2)为碰撞单元，其中离子被破裂。质谱仪的第一个四极(Ql)选择具有特定质/荷 比的雌酮先驱离子。具有正确质/荷比的雌酮先驱离子被允许穿到碰撞室(Q2)中，而具有 任何其它质/荷比的多余离子与四极的侧面碰撞并且被除去。进入Q2的先驱离子与中性 氩气分子碰撞并成为碎片。该过程被称为碰撞活化分裂(CAD)。所产生的碎片离子穿过到 四极3 (Q3)，其中雌酮的碎片离子被选择而其它离子被除去。所述方法可包括在正离子模式或负离子模式下进行的MS/MS。采用本领域熟知的 标准方法，本领域普通技术人员能鉴定可用于在四极3(Q3)中选择的雌酮的特定先驱离子 的一种或多种碎片离子。如果雌酮的先驱离子包括醇或胺基团，通常形成分别代表先驱离子的脱水或去氨 基的碎片离子。在包括醇基团的先驱离子的情况下，通过脱水形成的这些碎片离子通过从 先驱离子中失去一个或多个水分子而形成(即，其中先驱离子与碎片离子之间的质/荷比 差对于失去一个水分子来说是大约18，或者对于失去两个水分子来说大约36等)。在包 括胺基团的先驱离子的情况下，通过去氨基形成的这些碎片离子通过失去一个或多个氨分子而形成(即，其中先驱离子与碎片离子之间的质/荷比差对于失去一个氨分子来说是大 约17，或者对于失去两个氨分子来说大约34等)。同样，包括一个或多个醇和氨基团的先 驱离子常常形成代表失去一个或多个水分子和/或一个或多个氨分子的碎片离子(即其中 先驱离子与碎片离子之间的质/荷比差对于失去一个水分子和失去一个氨分子来说是大 约35)。一般地，代表先驱离子的脱水或去氨基的碎片离子不是对特定分析物的特定碎片离 子。因此，在本发明优选的实施方式中，进行MS/MS以检测到雌酮的至少一种碎片离子，其 不只表现为从先驱离子中失去一个或多个水分子和/或失去一个或多个氨分子。随着离子与检测器碰撞，它们产生转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被 传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图。所得到的质量层析图类似于在传统HPLC 方法中产生的层析图。测量对应于特定离子的峰下面的面积或这些峰的振幅，并且该面积 或振幅被关联到所关注分析物(雌酮)的量。在某些实施方式中，对碎片离子(一种或多 种)和/或先驱离子的曲线下面积或峰的振幅进行测量以测定雌酮的量。如上所述，给定 离子的相对丰度可采用基于内标分子诸如d4-雌酮的一种或多种离子的峰的校准标准曲线 转化成原始分析物例如雌酮的绝对量。下列实施例用于阐明本发明。这些实施例绝非意欲限制所述方法的范围。 实施例实施例1 样品和试剂制备血液收集在不含添加剂的Vacutainer中并使其在室温18°C至25°C凝结30分钟。 显示明显溶血、脂血和/或黄疸的样品被排除。制备甲醇中的lmg/mL雌酮储存标准并进一步在甲醇中稀释以制备1，000, OOOpg/ HiL的雌酮中间储存标准，其用于制备两种10，000pg/mL的雌酮工作标准，对于标准A稀释在 甲醇中或对于标准B稀释在去除的血清中(stripped serum)。氘化的甲醇(甲基-Cl1醇；Fisher目录号AC29913-1000或等同物)用于制备Img/ mL d4-雌酮储存标准(2，4，16，16-d4雌酮)，其用于制备氘化的甲醇中的l，000，000pg/mL 中间储存标准。d4-雌酮中间储存标准用于制备DI水中的5000pg/mL工作d4-雌酮内标 ImL的d4-雌酮中间储存标准在200mL容量瓶中用DI水稀释至体积。20%甲酸溶液通过将50mL的甲酸( 98%纯Aldrich目录号06440或等同物) 添加至250mL容量瓶制备，其用超纯HPLC级水稀释至体积。用于各次运行的所有校准/标准从10，000pg/mL雌酮标准的冷冻等分试样在去除 的血清中连续稀释每周新鲜制备。制备的标准从最高浓度至最低浓度，各个标准最终总体 积为10mL。实施例2 =使用液相层析从血清中提取雌酮通过吸取200 μ L的标准、对照或患者样品至96孔板，制备液相层析(LC)样品。此 外，300μ L的20%甲酸被递送至各个孔至 11% (V/V)的终浓度。最后，50yL的5000pg/ mL d4-雌酮标准被添加至各个孔。在LC前样品在室温被温育30分钟。液相层析用Cohesive Technologies Aria TX-4HTLC 系统，使用 AriaOS V 1.5 或 更新的软件进行。自动取样器洗涤溶液使用60%乙腈、30%异丙醇和10%丙酮(ν/ν)制备。HTLC系统自动注射如上制备的75 μ L样品至用大颗粒填充的TurboFlow柱(来自 Cohesive Technologies 的 50X 1. 0mm，60 μ mCyclone P 提取柱)。样品以高流速加样 (51^/1^11，加样试剂100%01水)以在提取柱内部产生湍流。该湍流确保雌酮与柱中大颗 粒的最优化结合，以及残留蛋白质和碎片通过以废弃。加样后，流动方向被倒转，样品用回路(loop)中200μ L的90%甲醇洗脱至分析 柱(Phenomenex 分析柱，Synergi Polar- RP 150 X 2. 0mm, 4 μ m 柱)。二元 HPLC 梯度被 应用至分析柱以将雌酮从样品中含有的其他分析物分离。流动相A是超纯水(HPLC级)以 及移动相B是100%甲醇。HPLC梯度起始于10%有机梯度，其在大约3. 35分钟内斜线上升 至75%然后以5%至10%的增量增加直至99%。总梯度时间为6. 58分钟。然后，分离的 样品进行MS/MS以量化雌酮。为了测定其他分子的干扰，空白血清被注入1000pg/mL下列类固醇17_β雌二 醇、雌三醇、睾酮、17-α羟基孕酮、孕酮、雄烯二酮、醛固酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮和二羟 基睾酮。样品进行LC。从这些类固醇没有观察到干扰；没有一种类固醇与雌酮共洗脱。实施例3 =MSZMS对雌酮的检测和量化MS/MS M Finnigan TSQ Quantum Ultra MS/MS % 统(ThermoElectron Corporation)进行。下列均来自ThermoElectron的软件程序用于本文所述的实施例中 Tune Master V 1. 2 或更新的软件、ExcaliburV 2.0 SRl 或更新的软件、TSQ Quantum 1.4 或更新的软件、LCQuan V2. 5 SURl或更新的软件以及XIteport 1. 0或更新的软件。流出分 析HPLC柱的液体溶剂/分析物流至Thermo Finnigan MS/MS分析仪的加热的雾化器界面。 溶剂/分析物混合物在界面的加热管中被转化为蒸汽。雾化溶剂中的分析物通过界面的电 晕放电针电离，该电晕放电针将电压施加到雾化溶剂/分析物混合物。离子穿过至第一个四极(Q1)，其选择具有质/荷比为269.07士0.5!11/2的离子。进 入四极2(Q2)的离子与氩气碰撞以产生离子碎片，其穿过至四极3(Q3)用于进一步选择。同 时，使用同位素稀释质谱法的相同方法用内标——4-氘化雌酮分子——进行。下列质量转 变用于在负极性确认过程中检测并量化。表1雌酮质量转变(负极性)
权利要求
测定体液样品中雌酮的量的方法，所述方法包括(a)用足以将雌酮从存在于所述体液样品中的蛋白质游离出来的量的试剂，酸化所述体液样品；(b)通过液相层析法从所述体液样品中纯化雌酮；(c)电离来自所述体液样品的所述纯化的雌酮，产生一种或多种通过串联质谱法可检测的离子；以及(d)通过串联质谱法以负离子模式检测雌酮离子的量，其中将所述雌酮离子的量与所述体液样品中雌酮的量关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法的量化限小于或等于500pg/mL。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述雌酮在质谱法之前没有进行衍生化。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述液相层析法是高效液相层析法 (HPLC)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述纯化进一步包括高湍流液相层析法 (HTLC)，之后进行高效液相层析法(HPLC)。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述酸化试剂是甲酸。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述雌酮离子包括一种或多种选自如下 的离子具有269. 07士.5、145. 03士.5禾口 143. 02士. 5的质/荷比的离子。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述电离包括产生具有269.07士. 5 的质/荷比的先驱离子，以及产生一种或多种选自如下的碎片离子具有145. 03士. 5和 143. 02士.5的质/荷比的离子。
9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述体液样品中存在的葡糖苷酸化的和 非葡糖苷酸化的雌酮通过所述方法检测并测量。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述体液样品是血清、血浆或尿液。
11.通过串联质谱法测定体液样品中雌酮的量的方法，所述方法包括(a)通过液相层析法从所述体液样品中纯化雌酮；(b)产生质/荷比为269.07士. 5的所述雌酮的先驱离子；(c)产生所述先驱离子的一种或多种碎片离子，其中所述一种或多种碎片离子的至少 一种包括具有143. 02 士. 5的质/荷比的离子碎片；以及(d)检测步骤(b)或(c)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子 与所述体液样品中所述雌酮的量关联。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法的量化限小于或等于500pg/mL。
13.根据权利要求11-12任一项所述的方法，其中所述雌酮在质谱法之前没有进行衍 生化。
14.根据权利要求11-13任一项所述的方法，其中所述液相层析法是高效液相层析法 (HPLC)。
15.根据权利要求11-14任一项所述的方法，其中所述纯化进一步包括高湍流液相层 析法(HTLC)，之后进行高效液相层析法(HPLC)。
16.根据权利要求11-15任一项所述的方法，其中所述先驱离子具有269.07 士0.5的质/荷比，以及所述一种或多种碎片离子包括具有145. 03士0. 5的质/荷比的碎片离子。
17.根据权利要求11-16任一项所述的方法，其中在所述电离步骤之前，以足以将雌酮 从存在于所述体液样品中的蛋白质游离出来的量添加试剂至所述体液样品中。
18.根据权利要求11-17任一项所述的方法，其中所述试剂以足以酸化所述体液样品 的量添加。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述试剂是甲酸。
20.根据权利要求11-19任一项所述的方法，其中所述体液样品中存在的葡糖苷酸化 的和非葡糖苷酸化的雌酮通过所述方法检测并测量。
21.根据权利要求11-20任一项所述的方法，其中所述体液样品是血清、血浆或尿液。
全文摘要
提供的是采用质谱法测定样品中雌酮的量的方法。方法一般包括电离样品中的雌酮以及检测和量化离子的量以确定样品中雌酮的量。
文档编号C12Q1/00GK101946005SQ200880126567
公开日2011年1月12日 申请日期2008年12月2日 优先权日2007年12月13日
发明者M·M·戈尔德曼, N·J·克拉克, R·E·赖茨 申请人:奎斯特诊断投资公司