专利名称：一种基于时间分辨荧光法和dna杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法
技术领域：
本发明属于微生物检测领域，涉及一种基于双探针串联DNA杂交模型与时间分辨 荧光法结合的检测金黄色葡萄菌的方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，空气、水体、灰尘及人和动物的排泄物中都 可以找到。金黄色葡萄球菌是一种重要的致病微生物，它能产生较多的毒素和酶等毒力因 子，且毒力强，由金黄色葡萄球菌感染可引起多种疾病，包括食物中毒、假膜性肠炎、烫伤皮 肤综合症、毒素休克综合症、化脓性炎症和败血症等，给人类造成了极大的威胁和损失，弓丨 起了人们的广泛关注。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第 二位，仅次于大肠杆菌，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性的卫生难题，在美国由金黄色葡 萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大达45%，我国每年 发生的此类中毒事件也非常多。目前，金黄色葡萄球菌的检测方法大致包括传统的细菌培养方法及生化鉴定、免 疫学方法、荧光定量PCR法、荧光原位杂交法(FISH，Fluorescent in situ hybridization) 以及基因芯片法等，这些检测方法均有各自的优势但同时也存在不同层次上的不足，比如 FISH法能够直接运用到复杂样品的检测中，且无需提取样品的DNA，直接保留了样品DNA的 完整性；但样品中某些菌体本身的自体荧光、荧光探针信号的衰减、固定的微生物细胞过少 等因素均可能导致实验产生假阴性结果；基因芯片法是近年来迅速发展起来的核酸检测技 术，其快速、方便简单等优势成为该技术的亮点，但由于该技术需要昂贵的先进检测设备和 运行成本，使其难以推广应用。将具有长寿命发光性能的荧光物质与生物探针技术相结合，利用时间分辨的方法 可有效消除样品中荧光背景和固定基质背景光的干扰，能够有效提高检测的灵敏度。本发 明采用本团队研究合成的长寿命荧光稀土铕配合物Eu(TTA)3Phen作为标识DNA探针的荧 光物质，将两条双功能探针串联与目标特异性DNA片段形成杂交体系的检测技术，初步建 立了对金黄色葡萄球菌检测的一种通用性好、高灵敏度和精确度的检验方法及其检测条 件。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的 检测方法。该检测方法用时短，反应结果直观、灵敏、准确。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。本发明基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下 步骤A、捕获探针DNA1的固定
先将玻片酸基化，再将碱基序列5，-CAC TTT TTC TTA AAT GTT GTT CTTTTTTTTTT-3，-NH2的捕获探针DNA1稀释到1 X l(T7mol/L，取40 μ L DNA1滴加到己醛基化 的玻片表面，室温反应3h ；最后洗涤并封闭剩余的醛基；B、稀土铕配合物标记识别探针DNA2(1)将2mg稀土铕配合物Eu (TTA)3Phen分散到5mL 2. 5%戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡5h，离心后用二次蒸馏水洗3次，得到醛基修饰的Eu(TTA)3Phen颗粒重新悬于4mL pH为7.2的PBS溶液中备用；(2)再将碱基序列为 NH2-5，-TTTTTTTTTT ATT TTC TCT TTT TTC GCT T-3，的识别 探针DNA2配成使用浓度15 μ g/mL,识别探针DNA2加入到稀土铕配合物颗粒悬浮的PBS溶液 中，30°C下于震荡培养箱中反应5h，反应完成后离心洗涤；再分散于2mLPBS缓冲液中备用。C、金黄色葡萄球菌DNA提取D、杂交(1)杂交反应前，将提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA通过高温解链使其变性成 为单链；(2)将标记上稀土铕配合物的识别探针DNA2与提取的待测单链DNA在固定了 DNA1 的玻璃片上杂交9h。杂交体系中的组分为10 μ L提取的单链DNA，10 μ L标记了稀土铕配合 物的DNA2,10 μ L 12 X SSC溶液；保持杂交温度为53°C ；(3)杂交后，将玻片依次在以下3种洗涤液中清洗，洗涤液I (1 X SSC/0. 03 % SDS)、 洗液II (0. 2 X SSC)和洗液III (0. 05 X SSC)，总洗涤时间为4. 5分钟，每次1. 5分钟，洗涤温 度为53°C ；E、杂交后信号检测杂交清洗后带有稀土铕配合物标记的识别DNA2、捕获DNA1和目标DNA探针形成的 杂交体，在激发和发射狭缝均为8. Onm，延迟时间0. Ims,门时间1. Oms ；激发波长为368nm 的检测条件下产生一个发射波长为612nm光信号，检测出玻片上的稀土长寿命发光配合物 的光信号，从而根据检测的光信号检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌DNA。本发明的有益效果1、本发明中使用的探针是从金黄色葡萄球菌的16S rRNA的保守区域中筛选，再通 过GenBank数据库中的序列比对得到的特异性片段目标DNA序列，与目标序列互补的另一 条DNA序列经过Primer Premier 5软件分析将其切断为两段，分段的依据是两段的Tm值 大体一致。其中一段作为捕获探针DNA1,另一段作为识别探针DNA2，捕获探针DNA1固定标 记在玻璃片上；识别探针DNA2联接长寿命发光稀土配合物。其中DNA1的3’端与DNA2的5’ 端连接10个T，减少探针与连接物间的位阻，使DNA1与DNA2串联时能够与目标DNA(即待 测生物的DNA)更加有效的发生碱基互补的杂交反应。将杂交反应中非特异性吸附排除，得 到可信的荧光信号，对金黄色葡萄球菌进行定性和定量的检验。2、首次将提取的原始基因组DNA直接用于本发明模型的杂交反应，解决了微生物 检测中遇到的实际问题，该DNA在杂交过程中为长链杂交形式，为基于时间分辨荧光法和 DNA杂交方法的实践应用打下了坚实的基础。此外，提取的DNA无需纯化和PCR扩增等步 骤，降低了 DNA降解的几率，减少实验中引进的污染物，这几点都大大简化了实验过程。3、已有技术中是应用稀土铕配合物制成的纳米颗粒标记DNA，本发明直接运用稀土铕配合物单分子标记在DNA上，完全能满足荧光检测的需要，而且还能省去制备纳米颗 粒的繁琐过程，节约了成本，简化了检测步骤。4、杂交反应时间和洗涤时间是杂交反应的重要影响因素，反应的质量和效率直接 关系到检测结果的准确性。本发明通过严格控制杂交条件与洗涤条件等措施，尤其是在杂 交和洗涤时间上做了大量的工作。经过反复试验，最终摸索出一套适合于金黄色葡萄球菌 杂交检测的最佳条件，尤其在捕获探针浓度、杂交温度、时间、洗涤时间等方面，克服了实践 检测中的诸多困难，找到了最适合的条件。 5、首次将捕获探针DNA1与识别探针DNA2串联形式，与目标DNA碱基序列的互补杂 交方式应用到金黄色葡萄球菌的检测，大大提高了杂交反应的特异性，其检测方法用时短， 传统的菌落总数测定方法需要24小时以上才能得到结果，本发明得到检测结果只需要12 小时，而且反应灵敏、结果准确，能够很直观的得到检测结果，具有十分显著的优点。6、将长寿命发光的稀土铕配合物作为杂交反应的标记物，利用时间分辨荧光的方 法能有效消除生物体内源荧光背景和固体基质背景荧光的干扰，增强了荧光信号强度，提 高了检测的灵敏度。本发明是基于时间分辨荧光检测与双探针串联的DNA杂交模型的基础上建立的 检测方法。对于一个特定的杂交体系而言，杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的 准确性。本发明通过严格控制杂交实验因素与洗涤条件等措施，经过大量、反复的实验研 究，得到了该杂交体系的最佳检测条件，并获得了满意的特异性和灵敏度，为金黄色葡萄球 菌的检验方法提供了科学系统的参考条件。
图1为不同捕获探针浓度对杂交结果的影响；图2为不同杂交时间对杂交结果的影响；图3为不同洗涤时间对杂交结果的影响；图4为最佳条件下该杂交体系的特异性检测结果；其中NO. 1为表皮葡萄球菌；NO. 2为大肠杆菌；NO. 3为多粘类芽孢杆菌；NO. 4为金 黄色葡萄球菌；NO. 5为阳性控制；N0. 6为空白对照(无菌水)。图5为最佳条件下该杂交体系的灵敏度检测结果。
具体实施例方式以下旨在说明本发明而不是对本发明进一步限定，本发明可以按发明内容所述任 一方式实施。一、杂交前准备1、玻片的醛基化正方形玻片(边长13mm)浸入铬酸洗液中浸泡过夜，蒸馏水洗，浸入25%氨水中 过夜，二次蒸馏水水洗后，浸入2 %的氨基硅烷95%乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH至4. 5， 室温作用30min，用乙醇超声清洗，用二次蒸馏水超声清洗，室温晾干。室温下2. 5%戊二醛 (pH为7. 2的PBS溶液配制)与氨基玻片作用2h，PBS冲洗，二次蒸馏水水洗(lmin/次)， 晾干。
2、捕获探针的固定捕获探针DNAi 碱基序列5，-CAC TTT TTC TTA AAT GTT GTT CTTTTTTTTTT-3’ -NH2(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。将探针用二次 蒸馏水稀释到设定的浓度，取40 yL 滴加到己醛基化的玻片表面，室温反应3h ；最后洗 涤并封闭剩余的醛基；3、识别探针DNA2与稀土铕配合物连接(1)将 2mg稀土铕配合物 Eu(TTA)3phen 分散到 5mL 2. 5%戊二醛(pH 为 7. 2 的 PBS 缓冲溶液配制)溶液中，室温下剧烈震荡5h，离心后用二次蒸馏水洗3次，得到醛基修饰的 Eu (TTA) 3phen颗粒重新悬于pH为7. 2的PBS溶液中备用；⑵识别探针 DNA2 碱基序列为 NH2-5，-TTTTTTTTTT ATT TTC TCT TTT TTCGCT T-3’(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)配成使用浓度15i!g/mL，将识别探针 DNA2加入到稀土铕配合物颗粒悬浮的PBS溶液中，30°C下于震荡培养箱中反应5h，反应完 成后二次蒸馏水离心洗涤；将标记上DNA2的稀土铕配合物分散于PBS缓冲液中备用。4、金黄色葡萄球菌DNA提取(1)金黄色葡萄球菌菌株接种到NB培养液中震荡培养，培养温度37°C，培养时间 18h后到达细胞的对数生长期停止培养。DNA提取采用上海捷瑞生物工程有限公司的细菌 基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)编号为GK1071，根据试剂盒所提供的试剂和方案提取 金黄色葡萄球菌基因组DNA，得到原始DNA溶液。(2)将提取到的基因组DNA使用美国Bechman公司的DU 640核酸蛋白质分析仪 进行检测。将原始DNA溶液稀释10倍，测得到A260/A280的比值为1. 9，OD260的值为0. 35，初 步表明提取的DNA纯度较高，可直接用于后续实验。二、杂交体系杂交反应前，将提取的基因组DNA通过高温解链使其变性成为单链，其中解链温 度为95°C，解链时间5min。为了防止已解链的DNA在缓慢回落的温度中复性，解链结束后 迅速将其转入4°C的冰水混合物中，放置5min，得到待测的单链目标金黄色葡萄球菌DNA。将标记上稀土铕配合物的识别探针DNA2与提取的待测单链DNA在标记了 DNA:的 玻璃片上进行杂交反应。杂交体系中的组分为10iiL提取的单链DNA，10iiL DNA2,10uL 12XSSC。其中每个样品均做一式三份的平行对照，空白对照的目标DNA用无菌水替代。将 进行杂交反应的玻片置于铺垫棉花并用3XSSC溶液维持湿度的杂交湿盒内，在恒温培养 箱中以设计的杂交温度恒温杂交。三、杂交后洗涤及信号检测配制洗涤液I (1XSSC，0. 03% SDS)、洗液 II (0. 2XSSC)和洗液 111(0. 05XSSC)。 杂交反应结束后，将先玻片浸没在洗液中，然后缓慢提起玻片，放入，再提起，来回上下洗 涤，室温下晾干。杂交清洗后带有稀土铕配合物标记的识别DNA2、捕获DNAi和目标DNA探 针形成的杂交体，在激发和发射狭缝均为8. Onm，延迟时间0. lms,门时间1. Oms ；激发波长 为368nm的检测条件下产生一个发射波长为612nm光信号，检测出了玻片上的稀土长寿命 发光配合物的光信号，从而根据检测的光信号检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌DNA。五、捕获探针DNA:浓度的影响将碱基序列为5，-CAC TTT TTC TTA AAT GTT GTT C TTTTTTTTTT-3' _NH2 的捕
6获探针DM!按10倍稀释的方法，配成使用浓度分别为1 X 10_5，1 X 10_6，1 X 10_7，1 X 10_8， 1 X 10_9，1 X 10-10mol/L。然后，分别移取5种浓度的DNA: 40 u L，并分别滴加到己醛基化的 玻片表面，室温反应5h ；最后洗涤并封闭剩余的醛基；室温晾干备用。实验结果表明，捕获探针浓度对杂交效率的影响比较大。从图1可以看出，当捕获 探针浓度为1 X 10_7mol/L，检测到了比较强而稳定的信号，而其他浓度得到的信号均不及该 浓度。表明该探针浓度与固定在玻片表面的醛基基团的连接达到饱和，过高或者过低的浓 度均不利于杂交的效率。因此，最佳的固定捕获探针浓度为lXKTmol/L。六、杂交温度的影响选择最适杂交反应温度在杂交技术中极其重要。若杂交反应温度过低，虽然互补 链之间也可以形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多，氢键结合更弱。如果是 两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交变化10倍。因 此，对于一个特定的杂交体系，对杂交温度进行优化是非常必要的。基于设计的探针，其解链温度Tm值为63°C。实验考察了最适复性温度T ，苛刻复 性温度Ts以及非苛刻复性温度Tns对杂交效率的影响。实验结果表明，当温度为或者Tns时，样品和空白的信号均较低，并且它们之间 的差别也很小。分析其原因，可能是由于在较低的反应温度下，分子量较大的样品DNA难 以完全分散导致杂交不完全，且错配碱基对增多杂交效率降低。而当杂交温度为TS(53°C ) 时，能很好的区分样品和空白之间的信号，杂交效率比较高，该杂交温度与文献报道的结果 类似。因此，在本实验中检测金黄色葡萄球菌的杂交温度为53°C。七、杂交时间的影响杂交反应时间为核酸分子杂交实验重要的影响因素。在其他条件都满足的情况 下，杂交反应的成败取决于反应的时间。时间过短，杂交反应没完成；时间过长也无益，会引 起非特异性结合增多。理想的杂交时间与很多因素有关，例如探针的链长，序列等。因此， 在特定的杂交体系中，对杂交时间进行优化是极其必要的。分别设计杂交时间长为3、5、7、9、ll、13、15、17h的单因素优化实验。在到达设定 的时间后，将玻片从恒温杂交箱中取出，洗涤。实验结果如图2所示。结果表明当杂交时间 从3h增加到9h时，测量到玻片表面的荧光强度逐渐增强，而当杂交时间超过9h，荧光强度 反而减小。当反应时间过短，杂交将进行得不彻底，而杂交时间过长又会导致副反应的发 生。因此，最佳的杂交反应时间为9h。八、洗涤时间的影响采用两步严格洗涤法去除杂交反应中的非特异性结合。在低严密性洗涤阶段(低 盐浓度，高温)其目的是去除未参与杂交反应的探针。在高严密性的洗涤阶段(低盐浓度， 高温)其目的是去排除同源性的非特异杂交。高严密性的洗涤液先预热到设定的温度。洗 涤液配方为洗涤液 I(1XSSC，0. 03% SDS)、洗液 11(0. 2XSSC)和洗液 111(0. 05XSSC)。 清洗时，让玻片一直留在洗液中，缓慢从洗液中提起玻片，放入，再提起，来回上下清洗几 次。以Tm值53 °C作为洗涤的温度，设计洗涤时间长分别为1. 5，3，4. 5，6，9，15min单因 素优化实验。实验结果如附图3所示，当洗涤时间为4. 5分钟时检测到样品与空白的荧光 强度的区别最明显。当洗涤时间少于4. 5分钟，则出现空白对照的值很高，但洗涤时间大于4. 5分钟，空白对照的荧光强度基本保持不变，样品的荧光强度却减弱。由于过长时间的洗 涤可能会破坏原来已经配对的碱基，而且这种破坏是不可逆的。因此，选用最佳的洗涤时间 为4. 5分钟。九、杂交体系的特异性采用了其他3种病原微生物的基因组来考察该体系的特异性。其中表皮葡萄球菌 与金黄色葡萄球菌同属于葡萄球菌属；大肠杆菌是一种大部分污染物中和金黄色葡萄球菌 一起共存的菌；多粘类芽孢杆菌是随机选择的任意菌。杂交和洗涤条件均在最佳条件下进 行。实验结果表明，金黄色葡萄球菌样品和阳性控制实验，得到的时间分辨荧光强度 介于163-185之间，而其他3种微生物所得到荧光值与空白样品接近，如图4所示。另外， 该检测方法基本上没有假阳性结果，说明该金黄色葡萄球菌检测方法具有令人满意的特异 性。十、杂交体系的灵敏度纯培养金黄色葡萄球菌浓度是通过用无菌的PBS缓冲液进行十级逐级稀释，平板 培养计数法来检测的。通过提取每个稀释液中相应的细胞基因组DNA，应用于优化条件下的 杂交反应中，得到每种稀释液对应的荧光强度。具体步骤如下(1)金黄色葡萄球菌种子液接种于150mLNB液体培养液中，接种量为5mL，恒温培 养箱中震荡培养18h，培养条件为温度37°C，摇床振荡速度120rpm，即到达金黄色葡萄球 菌的对数生长期停止培养。(2)将PBS (pH = 7. 2)缓冲液分装成9mL/管灭菌，灭菌条件为121 °C，20min。(3)从到达对数期生长的金黄色葡萄球菌培养液中无菌移取lmL菌液至9mL的无 菌PBS缓冲液中，即为浓度为10—1的菌液。依此方法得到一系列浓度为10_2、10_3、10_4、10_5 的菌液。(4)将lmL对数生长期的金黄色葡萄球菌培养液在无菌NB琼脂培养平板中培养， 以菌落计数及报告方式CFU/mL (colony forming unit)报告检测结果，该结果作为灵敏度 检测结果的依据。培养结果为从10—1 10_5菌液浓度的菌落数为106 102CFU/mL。(5)将上述系列稀释浓度的菌液分别在离心速度为12000rpm的高速离心机中离 心lOmin，弃去上清液得菌体。菌体的DNA提取均用上海捷瑞生物工程有限公司的细菌基因 组DNA提取试剂盒(离心柱型)编号为GK1071，根据试剂盒所提供的试剂和方案提取。(6)提取到的系列DNA分别优化后的杂交条件及洗涤条件下用本方法进行杂交检 测，根据检测的荧光信号强度确定该探针的灵敏度。实验结果如图5所示，曲线5的荧光强度在所有的样品中最低。检测信号只要大 于2倍平均基线发射的标准偏差则认为是阳性结果。根据这个标准，我们得到该金黄色葡 萄球菌检测方法的检测限为8X103CFU mL—1。该检测限可以与文献中报道的运用PCR扩增 的金黄色葡萄球菌的检测方法相比。序列表<110>湖南大学<120> 一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法<130>GenBank
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<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>32<212>DNA<213>Staphylococcus aureus<400>1cactttttct taaatgttgt tctttttttt tt32<210>2<211>29<212>DNA<213>Staphylococcus aureus<400>2ttttttt ttt attttctctt ttttcgctt29
权利要求
一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于A、捕获探针DNA1的固定先将玻片醛基化，再将碱基序列为5’-CAC TTT TTC TTA AAT GTT GTT CTTTTTTTTTT-3’-NH2的捕获探针DNA1稀释到1×10-7mol/L，取40μL DNA1滴加到己醛基化的玻片表面，室温反应3h；最后洗涤并封闭剩余的醛基；B、稀土铕配合物标记识别探针DNA2(1)将2mg稀土铕配合物Eu(TTA)3phen分散到5mL 2.5％戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡5h，离心后用二次蒸馏水洗3次，得到醛基修饰的Eu(TTA)3phen颗粒重新悬于4mL pH为7.2的PBS溶液中备用；(2)再将碱基序列为NH2-5’-TTTTTTTTTT ATT TTC TCT TTT TTC GCT T-3’的识别探针DNA2配成使用浓度15μg/mL，将识别探针DNA2加入到稀土铕配合物颗粒悬浮的PBS溶液中，30℃下于震荡培养箱中反应5h，反应完成后离心洗涤；再分散于2mLPBS缓冲液中备用；C、金黄色葡萄球菌DNA提取D、杂交(1)杂交反应前，将提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA通过高温解链使其变性成为单链；(2)将标记上稀土铕配合物的识别探针DNA2与提取的待测单链DNA在固定了DNA1的玻璃片上杂交9h。杂交体系中的组分为10μL提取的单链DNA，10μL标记了稀土铕配合物的DNA2和10μL 12×SSC溶液；保持杂交温度为53℃；(3)杂交后，将玻片依次在以下3种洗涤液中清洗，洗涤液I(1×SSC/0.03％SDS)、洗液II(0.2×SSC)和洗液III(0.05×SSC)，总洗涤时间为4.5分钟，每次1.5分钟，洗涤温度为53℃；E、杂交后信号检测杂交清洗后带有稀土铕配合物标记的识别DNA2、捕获DNA1和目标DNA探针形成的杂交体，在激发和发射狭缝均为8.0nm，延迟时间0.1ms，门时间1.0ms；激发波长为368nm的检测条件下产生一个发射波长为612nm光信号，检测出玻片上的稀土长寿命发光配合物的光信号，从而根据检测的光信号检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌DNA。
全文摘要
本发明公开了一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌DNA目标序列设计了捕获探针DNA1和识别探针DNA2，并构建了基于普通玻片表面两探针串联的DNA检测模型。将长寿命发光的稀土铕配合物作为识别探针DNA2的标记物，利用时间分辨荧光的方法能有效消除生物体系内源荧光和固体基质背景光的干扰。本发明通过严格控制杂交实验因素与洗涤条件等措施，经过大量、反复的实验研究，得到了该杂交体系的最佳检测条件，并获得了满意的特异性和灵敏度，为金黄色葡萄球菌的检验方法提供了科学系统的参考条件。本发明用时短，反应结果直观、灵敏、准确，具有十分显著的优点。
文档编号C12Q1/14GK101845486SQ200910227169
公开日2010年9月29日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者何慧, 曾光明, 牛承岗, 王晓钰, 秦品珠, 阮敏, 黄兢 申请人:湖南大学