专利名称：一种检测宫颈癌的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于医学领域，特别是涉及一种检测宫颈癌的试剂盒及检测方法。
背景技术：
子宫颈癌是目前唯一一种病因明确的癌症，最能被有效预防，早期发现和有效治 愈的癌症。子宫颈癌前病变和早期癌多无症状，妇科检查亦难发现，出现症状时，80%以上 已为侵润癌，难以治愈。从HPV感染到宫颈癌前病变要经历5-20年的时间，当今的宫颈癌检查第一步是 以子宫颈抹片方式，会有很多因素造成漏诊。第二步是人类乳突病毒(HPV)检测技术来检 测妇女是否感染病毒与罹患子宫颈癌，这种手法也会造成假阳性的结果。不仅如此，还很难 判定是否应该手术和手术的时期，导致治疗不利，影响治疗效果。
发明内容
鉴于以上不足，本发明的主要目的在于提供一种检测宫颈癌的试剂盒及检测方法。为了达到以上目的，本发明提供的该种检测宫颈癌的试剂盒，包括a.针对SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和ONECUT1基因的甲基化特异性和非甲基 化特异性的引物对；和/或，b.针对HPV-Ll蛋白的特异性和非特异性引物对。上述试剂盒还包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的试剂，如提取液、扩增 液、杂交液、酶、对照液等。本发明还提供一种检测宫颈癌的方法，包括以下步骤a).从宫颈刮片的组织细胞中提取DNA ；b).对基因 S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1 和 0NECUT1 进行 PCR 增殖，采用异常甲 基化检测方法(MSP)检测得出是否甲基化结果，如果得出甲基化结果，说明该病人的HPV感 染涉及到了基因水平的变化，提示病情的恶性转归，需及早治疗；c).将宫颈组织进行PCR增殖，电泳，检测是否存在HPV-L1，如果检测出HPV-L1的 阳性结果，说明该病人有向好的方向转归的提示。S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和0NECUT1基因是与宫颈癌相关的肿瘤抑制基因， 其启动子部位CpG岛甲基化是SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1基因失活的主要 机制之一。本发明是应用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)对不同宫颈 鳞癌细胞系SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和ONECUT1基因启动子CpG岛甲基化状态进行 检测，在分子水平上了解S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WTl和ONE⑶Tl甲基化与宫颈癌的相 关性，并且早期作出诊断；而HPV-Ll蛋白的存在又提示宫颈癌前病变可以转归，也就是可 以自身修复。如果两者都存在的前提下，首先要把宫颈相关的基因S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、
3WTl和ONE⑶Tl去甲基化，然后观察其预后。上述检测SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1是否甲基化的方法，对于宫 颈癌的判断准确率达到99%。本发明通过分别检测SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1是否甲基化以及 检测是否存在HPV-L1，可以很明确的判定患者是否患宫颈癌，以及提早治疗基因的甲基化， 和用HPV-Ll蛋白检测转归。这样在分子水平上很完善的评估患者的宫颈癌变和转归的实 际情况，有效的指导治疗。从而避免了现今宫颈癌治疗的误诊和过治疗，以及漏诊。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明的技术方案进一步说明，但不作对其的限定本发明提供的该种检测宫颈癌的试剂盒，包括a.针对S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和0NECUT1基因的甲基化特异性和非甲基 化特异性的引物对；和/或，b.针对HPV-Ll蛋白的特异性引物对。上述针对SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1基因的甲基化特异性和非甲 基化特异性的引物对，采用异常甲基化检测方法(MSP)，可以得到的结果是甲基化特异性 引物和非甲基化特异性引物均扩增出目的条带，呈现出甲基化杂合性状态；或甲基化特异 性引物扩增出了目的条带，非甲基化特异性引物未扩增出目的条带，表现为完全甲基化状 态。DNA甲基化改变不仅可以直接或间接影响基因转录，也可通过5甲基胞嘧啶脱氨基诱发 胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，引起基因异常表达，还可引起染色体结构改变，导致基因表达不稳 定，由此通过以上与宫颈癌密切相关的抑癌基因的甲基化判定宫颈癌的发生。上述针对HPV-Ll蛋白的特异性和非特异性引物对，同样用PCR增殖的形式，检测 HPV-Ll的存在，HPV Ll壳蛋白是HPV病毒的主要结构蛋白，Ll壳蛋白单体会与T细胞(⑶4/ CD8)及MHHC I/II(主要组织相容性复合体)形成免疫复合物，仅一个单一的免疫复合物即 会激活免疫连锁反应并在局部形成高浓度的免疫抗体。HPV Ll在机体中的表达往往说明机 体受到HPV感染且病毒处于复制阶段，正常情况下，Ll的表达有利于激发人体细胞免疫，清 除感染的细胞。但是当HPV病毒DNA整合到宿主基因后，HPV Ll壳蛋白表达缺失，机体无 法识别清除病变细胞，引发宫颈病变或病变的进展。因此，HPV Ll壳蛋白的存在意味着非 进展性的病变，而其缺失则是HPV相关恶性转化的分子基础。上述试剂盒还包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的试剂，如提取液、扩增 液、杂交液、酶、对照液等。本发明还提供一种检测宫颈癌的方法，包括以下步骤a).从宫颈刮片细胞中提取DNA ；b).对基因 S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1 和 0NECUT1 进行 PCR 增殖，采用异常甲 基化检测方法(MSP)检测得出是否甲基化结果，如果得出甲基化结果，说明该病人的HPV感 染涉及到了基因水平的变化，提示病情的恶性转归，需及早治疗；c)检测是否存在HPV-Ll，如果检测出HPV-Ll的阳性结果，说明该病人有向好的方 向转归的提示。S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和0NECUT1基因是与宫颈癌相关的肿瘤抑制基因，
4其启动子部位CpG岛甲基化是SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1基因失活的主要 机制之。上述SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1基因与宫颈癌的相关信息如表1 所示表 权利要求
一种检测宫颈癌的试剂盒，其特征在于，包括a.针对SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6 1、WT1和ONECUT1基因的甲基化特异性和非甲基化特异性的引物对；和/或，b.针对HPV L1蛋白的特异性和非特异性引物对。
2.根据权利要求1所述的检测宫颈癌的试剂盒，其特征在于，还包括用于提取DNA、 PCR、杂交、显色所需的试剂。
3.根据权利要求2所述的检测宫颈癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括提取液、扩 增液、杂交液、酶、对照液。
4.一种检测宫颈癌的方法，其特征在于，包括以下步骤a).从宫颈刮片中提取DNA;b).对基因S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和0NECUT1进行PCR±曾殖，采用异常甲基化 检测方法检测得出是否基化结果；c).将宫颈组织进行PCR增殖，电泳，检测是否存在HPV-Ll。
5.根据权利要求4所述的检测宫颈癌的方法，其特征在于，在步骤b)得出结果为已 甲基化，以及步骤c)得出HPV-Ll的阳性结果，进一步包括以下步骤把宫颈相关的基因 SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1去甲基化，然后观察其预后。
全文摘要
本发明属于医学领域，特别提供一种检测宫颈癌的试剂盒及检测方法。SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和ONECUT1基因是与宫颈癌相关的肿瘤抑制基因，其启动子部位CpG岛甲基化是所述基因失活的主要机制之一。本发明通过分别检测SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和ONECUT1基因启动子部位CpG岛甲基化以及检测是否存在HPV-L1，可以很明确的判定患者是否患宫颈癌，以及提早治疗基因的甲基化，和用HPV-L1蛋白检测转归。这样在分子水平上很完善的评估患者的宫颈癌变和转归的实际情况，有效的指导治疗。从而避免了现今宫颈癌治疗的误诊和过治疗，以及漏诊。
文档编号C12Q1/68GK101974645SQ20101055599
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者张秀茹 申请人:张秀茹