树枝状聚合物纳米技术用于将生物分子投递入植物细胞中的用途的制作方法

专利名称：：树枝状聚合物纳米技术用于将生物分子投递入植物细胞中的用途的制作方法树枝状聚合物纳米技术用于将生物分子投递入植物细胞中的用途优先权要求本申请要求2009年10月16日提交的关于“USEOFDENDRIMERNANOTECHNOLOGYFORDELIVERYOFBI0M0LECULESINTOPLANTCELLS”的美国临时专利申请流水号61/252,607的权益。
背景技术：
：纳米颗粒具有的独特性质已经被利用于将DNA投递至细胞。金属纳米颗粒，诸如金(Au)纳米颗粒由于其低细胞毒性和容易用各种有生物学意义的配体官能化而已经用于DNA投递。在金属纳米颗粒外,还已经使用大小范围3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如量子点)(“QD”)作为载体来将分子投递到细胞中。DNA和蛋白质可以连接到附接于QD表面的配体(见例如F.Patolsky等，J.Am.Chem.Soc.125，13918(2003))。已经使用纳米颗粒来将质粒DNA投递到多种动物细胞。已经发现了，在将经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收纳米颗粒，并开始表达DNA上编码的任何基因。然而，由于植物细胞壁的存在，当前的植物基因投递是挑战性的，这导致对用于植物遗传转化的侵入性投递手段的常见依赖。在期望对通常具有细胞壁的细胞进行纳米颗粒介导的投递的情况中，在将颗粒添加至植物原生质体前将细胞壁剥离(见F.Torney等，NatureNanotechnol.2,(2007))。在植物细胞中，细胞壁作为投递外源施用的分子的障碍。已经采用许多侵入性方法，如基因枪(生物射弹)、显微注射、电穿孔、和土壤杆菌来实现向这些有壁的植物细胞中的基因和小分子投递，但是仅仅通过显微注射实现了蛋白质投递。在存在植物细胞壁的情况中投递小分子和蛋白质仍是未经探索的，并且为了开发要应用于完整的植物细胞/组织或器官以进行体外和体内操作的使能技术其会是有利的。细胞穿透肽(CPP)是一类新的且快速增长的短肽，已知其在将一大批包含蛋白质和DNA的货物复合物易位穿过哺乳动物和人细胞系的生物膜时发挥重要的作用。J.Schwartz和S.Zhang(2000)，PeptideMediatedCellularDelivery,Curr.Opin.Mol.Ther.2:162-167;Langel(2002)，Prefacein:CellPenetratingPeptides;ProcessesandApplications,·Langel,Editor,CRCPress,BocaRaton;E.Vives和B.Lebleu(2002),TheTatDerivedCellPenetratingPeptidein:CellPenetratingPeptides;ProcessesandApplications,U.Langel,Editor,CRCPress,BocaRaton:第3页-第22页。虽然已经显示了CPP有助于哺乳动物细胞中的货物投递，但是在植物细胞中使用CPP以进行转染的研究受限于许多因素。使此技术适合于植物的主要障碍在于，与动物细胞不同，植物细胞给CPP及其货物的内在化呈现出双重屏障系统(细胞壁和质膜)。因此，为了有效易位CPP必须克服这两种屏障。CPP已经在植物细胞中使用，但是通常依赖于与使用CPP—起的透化剂和技术的使用以实现对植物细胞投递货物投递。HIVITAT蛋白质转导域(PTD)是得到最充分研究的易位肽之一。最近的报告已经显示了TATPTD及其寡聚物用于质粒投递的潜力，其通过与哺乳动物细胞中带负电荷的DNA形成复合物来实现。I.Ignatovich,E.Dizhe,A.Pavlotskaya,B.Akifiev,S.Burov,S.Orlov和A.Perevozchikov(2003)，ComplexesofPlasmidDNAwithBasicDomain4757oftheHIVITatProteinAreTransferredtoMammalianCellsbyEndocytosismediatedPathways,J.Biol.Chem.278:4262542636;C.Rudolph,C.Plank,J.Lausier,U.SchillingerjR.H.MiillerjandJ.Rosenecker(2003)，OligomersoftheArginineRichMotifoftheHIVITATProteinareCapableofTransferringPlasmidDNAintoCells,J.Biol.Chem.278:11411-11418;Z.SiprashvilijF.Scholl,S.Oliver,A.Adams,C.ContagjP.WenderjandP.Khavari(2003),GeneTransferviaReversiblePlasmidCondensationwithCysteineFlanked,InternallySpacedArginineRichPeptides,Hum.Gene.Ther.14(13):122533;I.HellgrenjJ.Gorman,andC.Sylven(2004),FactorsControllingtheEfficiencyofTatmediatedPlasmidDNATransfer,J.Drug.Target.12(I):3947。树枝状聚合物(dendrimer)是具有独特的核心-壳大分子结构的“级联分子”。树枝状聚合物在1979年由DonaldTomalia在实验室中首先创建(D.A.Tomalia等，Preprintsofthe1stSPSJIntJIPolymerconference,SocietyofPolymerScience,Japan,Kyoto,1984,第65页；还可见美国专利No.6,316,694)。已经使用树枝状聚合物来将DNA和其它生物分子投递入动物细胞中。然而，植物细胞壁的存在对植物中的基因投递提出了挑战。另外，尚未在植物中报告或证明使用基于树枝状聚合物的投递实现的转基因的稳定基因组整合。如此，仍需要经由使用基于树枝状聚合物的投递来在植物中稳定掺入基因和其它感兴趣分子的方法。发明概述以下结合系统、工具和方法来描述各实施方案，所述系统、工具和方法意为例示性和说明性，而非对范围的限制。本发明涉及使用树枝状聚合物和任选地一种或多种CPP来将分子物质非侵入性投递入具有细胞壁的细胞中以在其中稳定掺入所述分子物质的方法。本发明的一个实施方案包括将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中以实现植物和种子的稳定转化的方法。该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞，并将树枝状聚合物和任选地一种或多种CPP与感兴趣的分子相互作用以形成活化的树枝状聚合物结构。将所述细胞和活化的树枝状聚合物结构在允许其被摄取入所述具有细胞壁的细胞中的条件下置于相互接触中。本发明的另一个实施方案包括稳定表达基因的方法。该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞，并将树枝状聚合物和任选地一种或多种CPP与基因相互作用以形成活化的树枝状聚合物结构。将所述具有细胞壁的植物细胞和活化的树枝状聚合物结构置于相互接触中，并将所述树枝状聚合物和所述基因置于允许其被摄取入所述具有细胞壁的植物细胞中的条件下。然后，表达在具有所述植物细胞的植物的后代中的所述基因。本发明的又一个实施方案包括用于将分子物质转移入植物细胞中的方法。该方法包括将树枝状聚合物和任选地一种或多种CPP与质粒DNA相互作用以形成活化的树枝状聚合物结构。将所述活化的树枝状聚合物结构在允许所述树枝状聚合物和来自质粒DNA的基因被摄取入植物细胞中的条件下置于与携带完整壁的植物细胞的接触中。在上文所描述的例示性方面和实施方案外，其它方面和实施方案会因以下描述而变得显而易见。附图简述图I显示了质粒pDAB3831。图2显示了质粒pDAB7331。图3是经溴化乙锭染色的凝胶图像,其显示了来自拟南芥(Arabidopsis)转基因植物的基因组DNA的PATPCR扩增100DNA梯(PromegaInc)I;来自SUPERFECT及PDAB3831处理的拟南芥转基因系2;质粒DNApDAB3831作为阳性对照；星号标示了PATPCR扩增子。图4是显示来自拟南芥转基因植物的基因组DNA的YFPPCR扩增的凝胶图像100DNA梯(PromegaInc)I;来自SUPERFECT及pDAB3831处理的的拟南芥转基因系2;质粒DNApDAB3831作为阳性对照；星号标示了YFPPCR扩增子。·图5显示了来自树枝状聚合物介导的(SUPERFECT)经转化的拟南芥植物的叶组织的PAT蛋白质表达水平；使用商业ELISA试剂盒，在树枝状聚合物介导的转基因植物中检出PAT蛋白，并将其与经由根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化的植物相比。发明详述在以下的描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括此类术语给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了以下定义回交。回交可以是育种人员将杂种后代往回与亲本之一，例如第一代杂种F1与F1杂种的亲本基因型之一重复杂交的方法。胚。胚可以是成熟的种子内含有的小植物。树枝状聚合物。树枝状聚合物是通过反复顺序的反应获得的三维的、高分枝的、单分散纳米级大分子(threedimensional,hyperbranched,monodispersenanometricmacromolecule)。树枝状聚合物以可调的“纳米结构”常规合成,所述纳米结构可以进行设计并作为其大小、形状、表面化学和内部空隙空间的函数调节。树枝状聚合物可以用与传统生物大分子，诸如DNNPNA或蛋白质的结构控制接近的结构控制获得，并根据其精确的纳米级支架和纳米容器特性进行区别。树枝状聚合物是具有至少一个纳米级尺寸，通常小于IOOnm的微观颗粒。适合于在本发明中使用的树枝状聚合物可以具有lnm-0.4um的大小。对草甘膦的抗性。对一定剂量的草甘膦的抗性指植物幸免于(即植物可以不被杀死)所述剂量的草甘膦的能力。在一些情况中，耐受性植物可以暂时变黄或者在其它方面展现出一些草甘膦诱导的损伤(例如，过度分蘖和/或生长抑制)，但是能恢复。稳定化的。稳定化的指从同一品种的近交植物的一个世代可再现地(reproducibly)传递给下一世代的植物特征。摄取。摄取指颗粒,诸如树枝状聚合物穿过细胞壁或细胞膜的易位,其中所述易位不仅仅由于除摄取颗粒的细胞外的某物对颗粒赋予的动量而发生。仅由于对颗粒赋予的动量而引起颗粒穿过细胞壁或细胞膜的易位的装置或方法的非限制性例子是生物射弹、基因枪、显微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技术。在一个具体的实施方案中，本发明涉及应用树枝状聚合物作为形成有效载荷的纳米工程的选项以使材料适合于在小分子、生物分子投递、基因投递、成像、和各种生物技术诊断学和感测功能中应用。树枝状聚合物结构提供许多区别性的特性，这些特性将它们与其它聚合物和纳米颗粒区别，诸如逐渐的逐步合成方法，其可以提供充分限定的大小和具有相当低的多分散性指数的结构。另外，树枝状聚合物化学可以是可改编的，并且如此，便于合成一大批具有不同功能性的分子。依照本发明的特定方法的树枝状聚合物的使用经由使用高密度的末端基团而便于生物分子和基因投递。在本发明的其它实施方案中，可以在树枝状聚合物上在各种和/或多个位点处工程化改造“添加”或“访客”分子的多个附接位点或填充。此特性可以例如在细胞内的分子位点的特异性靶向和编辑中采用，用于诸如生物模拟物、靶向投递等领域，用于非遗传修饰生物体选项，及在性状和疾病抗性选项方面在多种树或蔬菜作物中的瞬时转化选项(Thispropertycanbeemployed,forexample,inspecifictargetingandeditingofmolecularsiteswithincellsforareassuchasbiomimetics，targeteddeliveries,fornongeneticallymodifiedorganismoptions,andtransienttransformationoptionsinavarietyoftreeorvegetablecropsfortraitanddiseaseresistanceoptions)。也可以采用本发明的实施方案来开发合适的生物传感器。另外，可以与本发明的方法一起采用人工染色体(ACES)作为目前的真核载体的备选，用于精确靶向和同源重组选项。依照本发明的实施方案，可以提供一种将感兴趣的分子导入包含细胞壁的植物中的方法，该方法包括将含有感兴趣的分子的树枝状聚合物置于与植物细胞的接触中，并允许所述树枝状聚合物被摄取穿过植物细胞壁。在本发明的特定方面，所述树枝状聚合物可以是任何树枝状聚合物，并且可以可逆地或不可逆地含有所述感兴趣的分子，可以与所述感兴趣的分子相互作用，或者以其它方式结合和/或携带所述感兴趣的分子。在某些实施方案中，可以在与具有细胞壁的植物细胞接触前或在将所述树枝状聚合物导入具有细胞壁的植物细胞的同时将所述感兴趣的分子引入树枝状聚合物。依照本发明的实施方案，具有细胞壁的植物细胞可以是包含完整且全部细胞壁的任何植物细胞。具有细胞壁的细胞的例子包括但不限于藻类、烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽、棉花、棕榈、花生、大豆、甘鹿、稻属物种(Oryzasp.)、拟南芥属物种(Arabidopsissp.)、和蓖麻属物种(Ricinussp.),优选地烟草、胡萝卜、玉米、棉花、芸苔、大豆和甘蔗；更优选地烟草和胡萝卜。本发明的实施方案可以包括来自任何组织或它们存在的任何地方的包含细胞壁的细胞，包括但不限于在胚、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果、茎和组织培养物中。在本发明的实施方案中，感兴趣的分子可以是可以投递到依照本发明的植物细胞的任何分子。感兴趣的分子或感兴趣分子的组分可以包含但不限于核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、质粒、粘粒、YAC、BAC、植物人工染色体、植物微型染色体、植物工程性状基因座DNA;多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信号传导肽、抗体、维生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、药物、除草剂、杀真菌剂、抗生素、和/或其组合。本发明的实施方案包括用于预防或治疗疾病的方法。非限制性的例示性实施方案包括使用本发明的方法对有此需要的细胞投递杀真菌剂、抗生素、和/或其它药物。在本发明的方面，树枝状聚合物可以被摄取入细胞的各个部分中。可以摄取树枝状聚合物的位置的例子包括但不限于胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。在本发明的其它实施方案中，可以经由共质体或质外体途径发生包含细胞壁的细胞对树枝状聚合物的摄取。本发明的其它实施方案包括经遗传修饰的植物细胞及其生成方法，其中植物细胞具有经由本发明的方法导入其中的一种或多种核酸。在实施方案的一个例子中，可以经由依照本发明的树枝状聚合物将包含感兴趣的基因和选择标志的质粒导入具有细胞壁的植物细胞中。在其它实施方案中，可以选择已经稳定地整合了感兴趣的基因和/或选择标志的稳定转化体。在备选的实施方案中，可以增殖现在包含感兴趣的基因的植物细胞以生成包含感兴趣的分子的其它细胞。在其它实施方案中，现在包含感兴趣的分子的植物细胞可以是可再生细胞，其可以用于再生包含感兴趣的分子的全植物。在另一方面，本发明提供了创建在组织培养中使用的包含感兴趣分子的可再生植物细胞的方法。优选地，组织培养将能够再生与所述可再生细胞具有基本上相同的基因型的植物。此类组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果或茎。更进一步，本发明的实施方案提供了自本发明的组织培养物再生的植物。或者，本发明提供了将期望的性状导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其中该方法包括将树枝状聚合物和能够为植物细胞提供期望的性状的感兴趣分子置于与细胞的接触中，并允许所述树枝状聚合物被摄取穿过细胞壁。期望性状的例子包括但不限于选自下组的性状雄性不育、除草剂抗性、昆虫抗性、和对细菌性疾病、真菌性疾病、和/或病毒性疾病的抗性。本发明的其它方面提供了生成包含期望的性状或感兴趣分子的稳定化植物系的方法，其中可以首先通过穿过植物细胞壁摄取树枝状聚合物来导入期望的性状或感兴趣的分子。生成稳定化的植物系的方法是本领域普通技术人员公知的，并且可以包括如下的技术，诸如但不限于自交、回交、杂种生成、群体杂交等。包含首先通过穿过细胞壁摄取树枝状聚合物来导入植物细胞(或其祖先)中的期望的性状或感兴趣分子的所有植物和植物细胞在本发明范围内。有利地，包含首先通过穿过细胞壁摄取树枝状聚合物来导入植物或细胞(或其祖先)中的期望的性状或感兴趣分子的植物细胞可以用于与其它不同植物细胞杂交以生成具有卓越特征的第一代(F1)杂种细胞、种子、和/或植物。在感兴趣的分子包含一种或多种基因的实施方案中，基因可以是显性或隐性等位基因。举例而言，所述基因会赋予的性状诸如除草剂抗性、抗虫性、细菌抗性、真菌抗性、病毒疾病抗性、雄性能育、雄性不育、提高的营养质量、和工业用途。随着使分离和表征编码特定蛋白质或RNA产物(例如RNAi)的基因成为可能的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家对以下方面形成了强烈的兴趣，即工程化改造细胞的基因组以含有和表达外来基因，或者另外的或经修饰型式的天然或内源基因(可能由不同启动子驱动)，以便以特定的方式改变细胞的性状。此类外来的另外的和/或经修饰的基因在本文中统称为“转基因”。在过去15至20年里，已经开发了数种用于产生转基因细胞的方法，并且在具体的实施方案中，本发明涉及转化型式的细胞及其生成方法，其通过经由穿过细胞壁摄取树枝状聚合物将转基因导入具有细胞壁的细胞来进行。在本发明的实施方案中，转基因可以包含在表达载体中。细胞转化可以牵涉构建会在特定细胞中发挥功能的表达载体。此类载体可以包含包括在调节元件(例如启动子)控制下的或者与调节元件(例如启动子)可操作连接的基因的DNA。表达载体可以含有一种或多种此类可操作连接的基因/调节元件组合。载体可以是质粒形式，而且可以单独或者与其它质粒联合使用，以如下文所描述的那样使用转化方法提供经转化的细胞，从而将转基因掺入包含细胞壁的植物细胞的遗传物质中。在本发明的具体的实施方案中，多用途S1ARBURSTPAMAM(聚酰胺胺(polyamidoamine))树枝状聚合物原型展现出以下的特性,其适合于用作(i)祀向性、诊断MRI(磁共振成像)INIR(近IR)造影剂，(ii)和/或用于癌症疗法的受控投递。它们之中，引导候选物是(核心1，4二氨基丁烷(diaminobotane);G(代)[PAMAM(C02Na)64J。此树枝状纳米结构(即，-5.Onm直径)是基于非常有利的生物相容性概况(profile)进行选择的(纳米技术表征实验室(NanotechnologyCharacterizationLaboratory,NCL),即国家癌症研究所(NationalCancerinstitute,NCI)的一个分支机构已经完成了关于引导化合物的广泛体外研究，并且已经发现了它是非常良性的且高度生物相容的，预期是它会展现出合意的哺乳动物肾排泄特性，并且表明靶向特征。与本发明的方法一起使用的树枝状聚合物代表具有高度分子一致性和低多分散性的一类以其充分限定的结构为特征的聚合物。另外，已经显示了这些树枝状聚合物能够绕过流出转运体。依照本发明方法的树枝状聚合物的使用已经生成了稳定转化的植物，并且以表型表明了稳定转化的除草剂基因的表达，在所述表型中赋予了转基因Tl植物高除草剂耐受性。显示了此植物是能育的，因为它生成了T2种子。在一个具体的实施方案中，使用SUPERFECT转染试剂。此试剂是一种具有限定形状和直径的聚阳离子物质(polycation)，作为特定设计的活化树枝状聚合物的溶液可作为Qiagen的SUPERFECT试剂(Qiagen产品目录编号#301307)购得。树枝状聚合物是具有自中心核心辐射并在带电荷的氨基基团处终止的分枝的球状聚酰胺胺分子。化学活化促进真核细胞高效摄取DNA。虽然不限于特定的理论，认为此试剂将DNA装配成紧凑的结构，由此优化DNA进入细胞中。为了在其转运到细胞核期间稳定化SUPERFECTDNA复合物，将SUPERFECT试剂设计为在与内体融合后缓冲溶酶体，导致对溶酶体核酸酶的pH抑制。用于经由树枝状聚合物摄取的表达载体标志物基因表达载体可以包括至少一种与调节元件(例如启动子)可操作连接的遗传标志，其容许通过负选择(即抑制不含该选择标志基因的细胞生长)或者通过正选择(即筛选由该遗传标志编码的产物)回收含有所述标志的经转化细胞。许多用于转化的选择标志基因是转化领域中公知的，包括例如编码在代谢上使可以作为抗生素或除草剂的选择性化学剂解毒的酶的基因，或者编码可对抑制剂不敏感的改变了的靶物的基因。几种正选择方法也是本领域中已知的。一种通常适合于植物转化的选择标志基因可以包括在植物调节信号控制下的新霉素磷酸转移酶II(nptll)基因，其赋予对卡那霉素的抗性。参见例如Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:4803(1983)。另一种常用的选择标志基因可以是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性。参见例如VandenElzen等，PlantMol.Biol.,5:299(1985)。赋予对抗生素抗性的细菌起源的另外的选择标志基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3’-腺苷酰转移酶(adenyltransferase)和博来霉素抗性决定子。参见Hayford等，PlantPhysiol.86:1216(1988);Jones等，Mol.Gen.Genet.,210:86(1987)；Svab等,PlantMol.Biol.14:197(1990)；Hille等,PlantMol.Biol.7:171(1986)。其它选择标志基因赋予对除草剂诸如草甘膦、草铵膦(glufosinate)或溴苯臆(bromoxynil)的抗性。参见Comai等，Nature317:741-744(1985)；GordonKamm等，PlantCell2:603-618(1990);和Stalker等，Science242:419-423(1988)。其它适合于植物转化的选择标志基因不是细菌起源的。这些基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶和植物乙酸乳酸合酶。参见Eichholtz等，SomaticCellMol.Genet.13:67(1987);Shah等，Science233:478(1986);Charest等，PlantCellRep.8:643(1990)。另一类适合于植物转化的标志基因需要筛选据推测经转化的植物细胞，而不对经转化的细胞直接遗传选择对毒性物质诸如抗生素的抗性。这些基因特别可用于量化或显现基因在特定组织中表达的空间样式，并且通常称为报告基因，因为它们可以与基因或基因调节序列融合以调查基因表达。通常用于筛选经转化的细胞的基因包括葡糖醛酸糖苷酶(OTS)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。参见R.A.，Jefferson,PlantMol.Biol.Rep.5:387(1987);Teeri等，EMBOJ.8:343(1989);Koncz等，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.84:131(1987);DeBlock等，EMBOJ.3:1681(1984)。最近，已经可获得用于显现⑶S活性的体内方法，其不需要破坏植物组织。MolecularProbespublication2908,Imagene,GreenTM,第I页-第4页(1993)；和Naleway等，J.CellBiol.115:151a(1991)。然而，还没有证明这些用于显现⑶S活性的体内方法对于回收经转化的细胞是有用的，这是由于低灵敏度、高荧光背景和与使用萤光素酶基因作为选择标志有关的限制。新近，已经利用编码荧光蛋白(例如，GFP、EGFP,EBFP,ECFPjPYFP)的基因作为原核和真核细胞中基因表达的标志物。参见Chalfie等，Science263:802(1994)。荧光蛋白和荧光蛋白突变体可以作为可筛选标志物使用。用于经由树枝状聚合物摄取的表达载体启动子表达载体中包含的基因必须由包含调节元件(例如启动子)的核苷酸序列驱动。数种类型的启动子现在是转化领域中公知的，可以单独使用或者与启动子联合使用的其它调节元件也是如此。如本文中所使用的，“启动子”包括提及如下的DNA区域，其可以在转录起始的上游，而且可以牵涉识别和结合RNA聚合酶和其它蛋白质以启动转录。“植物启动子”可以是能够在植物细胞中启动转录的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞、或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子称为“组织优选性的”。仅在某些组织中启动转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如根或叶中的维管细胞)中驱动表达。“诱导型”启动子可以是可在环境控制下的启动子。可招致诱导型启动子转录的环境条件的例子包括缺氧条件或光的存在。组织特异性的、组织优选性的、细胞类型特异性的、和诱导型启动子构成“非组成性”启动子类。“组成性”启动子可以是可在大多数环境条件下有活性的启动子。A.诱导型启动子可以将诱导型启动子与细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将诱导型启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。通过诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而升高。可以在本发明中使用任何诱导型启动子。参见Ward等，PlantMol.Biol.22:361-366(1993)。例示性诱导型启动子包括但不限于那些响应铜的ACEI系统的启动子(Mett等，PNAS90:4567-4571(1993));响应苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因(Hershey等，Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991);和Gatz等，Mol.Gen.Genetics243:32-38(1994));和来自TnlO的Tet阻抑物(Gatz等，Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991))。特别有用的诱导型启动子可以是响应植物正常不响应的诱导剂的启动子。例示性诱导型启动子可以是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可以受糖皮质激素诱导。Schena等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:0421(1991)。B.组成性启动子将组成性启动子与细胞中表达的基因可操作连接，或者可以将组成性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。可以在本发明中利用不同的组成性启动子。例示性的组成性启动子包括但不限于来自植物病毒的启动子，诸如来自CaMV的35S启动子(Odell等，Nature313:810-812(1985));来自稻肌动蛋白基因的启动子(McElroy等，PlantCell2:163-171(1990))；来自泛素的启动子(Christensen等，PlantMol.Biol.12:619-632(1989)，和Christensen等,PlantMol.Biol.18:675-689(1992))；来自pEMU的启动子(Last等，Theor.Appl.Genet.81:581-588(1991));来自MAS的启动子(Velten等，EMB0J.3:2723-2730(1984));和来自玉米H3组蛋白的启动子(Lepetit等，Mol.Gen.Genetics231:276-285(1992),和Atanassova等，PlantJournal2(3):291-300(1992))oALS启动子，即欧洲油菜(Brassicanapus)ALS3结构基因5’的Xbal/Ncol片段(或与所述Xbal/Ncol片段相似的核苷酸序列)代表一种特别有用的组成性启动子。参见PCT申请WO96/30530。C.组织特异性或组织优选性启动子可以将组织特异性启动子与用于在细胞中表达的基因可操作连接。任选地，可以将组织特异性启动子与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列可以与用于在细胞中表达的基因可操作连接。用与组织特异性启动子可操作连接的感兴趣基因转化的植物可以专门或优先在特定组织中生成转基因的蛋白质产物。可以在本发明中利用任何组织特异性或组织优选性启动子。例示性组织特异性或组织优选性启动子包括但不限于根优选性启动子，诸如来自菜豆蛋白基因的启动子(Murai等,Science23:476-482(1983)，和SenguptaGopalan等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3320-3324(1985))；叶特异性和光诱导型启动子，诸如来自cab或1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)的启动子(Simpson等，EMBOJ.4(11):2723-2729(1985)，和Timko等，Nature318:579-582(1985));花药特异性启动子，诸如来自LAT52的启动子(Twell等，Mol.Gen.Genetics217:240-245(1989));花粉特异性启动子，诸如来自Zml3的启动子(Guerrero等，Mol.Gen.Genetics244:161-168(1993))或小孢子优选性启动子，诸如来自apg的启动子(Twell等，Sex.PlantReprod.6:217-224(1993))。可以通过将编码信号序列的核苷酸序列可操作连接至编码感兴趣蛋白质的基因的5’和/或3’区域的手段来实现由转基因生成的蛋白质向亚细胞区室诸如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体的转运或者分泌入质外体中。可以在蛋白质合成和加工过程中测定在结构基因的5’和/或3’端的靶向序列，其中编码的蛋白质最后可以被区室化(compartmentalized)。或者,可以将此类亚细胞区室祀向性蛋白质与树枝状聚合物直接连接以将用感兴趣的分子包被的树枝状聚合物引导至期望的亚细胞区室。信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室，或者分泌至质外体。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如Becker等，PlantMol.Biol.20:49(1992)；P.S.Close,Master’sThesis,IowaStateUniversity(1993)；C.Knox等,“StructureandOrganizationofTwoDivergentAlpha-AmylaseGenesfromBarley,，，PlantMol.Biol.9:3-17(1987)；Lerner等，PlantPhysiol.91:124-129(1989)；Fontes等，PlantCell3:483-496(1991)；Matsuoka等，Proc.NatlAcadSci.88:834(1991)；Gould等，J.Cell.Biol.108:1657(1989);Creissen等，PlantJ.2:129(1991)；Kalderon等,Ashortaminoacidsequenceabletospecifynuclearlocation,CelI39:499-509(1984);Steifel等，Expressionofamaizecellwallhydroxyproline-richglycoproteingeneinearlyleafandrootvasculardifferentiation,PlantCell2:785-793(1990)。外来蛋白质基因和农艺学基因通过根据本发明的转基因植物，可以以商业量生产外来蛋白质。如此，用于选择和繁殖经转化植物的技术(它们是本领域中充分了解的)产生多种转基因植物，它们以常规方式收获，然后可以从感兴趣的组织或总生物量提取外来蛋白质。可以通过由例如Heney和Orr,Anal.Biochem.114:92-6(1981)所讨论的已知方法来实现从植物生物量的蛋白质提取。在本发明的各方面，为商业生产外来蛋白质提供的转基因植物可以是细胞或植物。在其它方面，感兴趣的生物量可以是种子。对于相对少数的显示较高表达水平的转基因植物，可以主要经由常规的RFLP、PCR和SSR分析(其鉴定整合DNA分子的近似染色体位置)来产生遗传图谱。关于这方面的例示性方法，参见Glick和Thompson,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,CRCPress,BocaRaton269:284(1993)。关于染色体位置的图谱信息对于主题转基因植物的所有权保护可以是有用的。如果可以进行未经授权的繁殖和与其它种质进行杂交，则可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较以确定后者是否与主题植物具有共同亲本(parentage)。图谱比较会牵涉杂交、RFLP,PCR、SSR和测序，它们都是常规技术。同样地，可以在经转化的细胞或其后代中表达农艺学基因。更具体地，可以经由本发明的方法对植物进行遗传工程化改造以表达农艺学感兴趣的各种表型。可以在这方面使用的例示性基因包括但不限于下文进行归类的基因。I.赋予对害虫或疾病的抗性并编码下列各项的基因A)植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)产物与病原体中相应无毒力(Avr)基因产物之间的特异性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种以工程化改造对特定病原体株有抗性的植物。参见例如Jones等，Science266:789(1994)(克隆对黄枝孢霉(Cladosporiumfulvum)有抗性的番茄Cf_9基因)；Martin等,Science262:1432(1993)(对丁香假单胞菌番爺致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomato)有抗性的番爺Pto基因编码蛋白质激酶)；Mindrinos等，Cell78:1089(1994)(对丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)有抗性的拟南芥(Arabidops)RSP2基因)。B)赋予对害虫诸如大豆胞囊线虫有抗性的基因。参见例如PCT申请WO96/30517；PCT申请WO93/19181。C)苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)蛋白、其衍生物或以其为模型的合成多肽。参见例如Geiser等，Gene48:109(1986)，其披露了Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码S-内毒素基因的DNA分子可以购自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),Manassas,Va.,例如以ATCC保藏号40098、670136、31995和31998购得。D)凝集素。参见例如VanDamme等，PlantMolec.Biol.24:25(1994)的公开内容，其披露了数种君子兰(Cliviaminiata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。E)维生素结合蛋白诸如抗生物素蛋白。参见PCT申请US93/06487。该申请教导了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对虫害的杀幼虫剂的用途。F)酶抑制剂，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如Abe等，J.Biol.Chem.262:16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制剂的核苷酸序列);Huub等，PlantMolec.Biol.21:985(1993)(编码烟草蛋白水解酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani等,Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(1993)(硝抱链霉菌(Streptomycesnitrosporeus)α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)；和美国专利号5，494，813(Hepher和Atkinson,1996年2月27日公开)。G)昆虫特异性激素或信息素，诸如蜕皮类固醇或保幼激素，其变体、基于其的模拟物、或其拮抗剂或激动剂。参见例如Hammock等，Nature344:458(1990)披露的克隆的保幼激素酯酶(即一种保幼激素灭活剂)的杆状病毒表达的内容。H)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达后破坏受到影响的害虫的生理学。例如参见Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)和Pratt等,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)(可以在太平洋折翅爐(Diplopterapuntata)中鉴定出咽侧体抑制素(allostatin))的公开内容。还可参见Tomalski等的美国专利号5，266，317，其披露了编码昆虫特异性、麻痹性神经毒素的基因。I)在自然界由蛇、黄蜂(wasp)或任何其它生物体生成的昆虫特异性毒液。例如参见Pang等，Gene116:165(1992)，是关于编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达的公开内容。J)酶，其负责超积累单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯丙烷衍生物或另一具有杀昆虫活性的非蛋白质分子。K)牵涉对生物学活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、壳多糖酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的还是合成的)。参见以Scott等名义的PCT申请WO93/02197，其披露了callase基因的核苷酸序列。含有壳多糖酶编码序列的DNA分子可以例如从ATCC以保藏号39637和67152获得。还可参见Kramer等,InsectBiochem.Molec.Biol.23:691(1993)(其教导了编码烟草天蛾壳多糖酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等，PlantMolec.Biol.21:673(1993)(其提供了欧芹ubi4_2多聚泛素基因的核苷酸序列)。L)刺激信号转导的分子。例如参见Botella等，PlantMolec.Biol.24:757(1994)(关于绿豆I丐调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等,PlantPhysiol.104:1467(1994)(其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公开内容。M)疏水矩妝(hydrophobicmomentpeptide)。参见PCT申请WO95/16776(抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公开内容)和PCT申请WO95/18855(教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。N)膜通透酶、通道形成剂或通道阻断剂。例如参见Jaynes等，PlantSci.89:43(1993)公开的杀菌肽-β溶胞肽类似物(cecropin-βlyticpeptideanalog)的异源表达以使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性。0)病毒侵入蛋白或自其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在经转化植物细胞中的积累赋予对由可衍生出该外壳蛋白基因的病毒及相关病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。参见Beachy等，Ann.rev.Phytopathol.28:451(1990)。已经对经转化的植物赋予了针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀刻病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。同上。P)昆虫特异性抗体或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆虫肠中的重要代谢功能的抗体会使受影响的酶失活，这杀死昆虫。参见Taylor等，摘要号497，SeventhInt’ISymposiumonMolecularPlant-MicrobeInteractions(Edinburgh,Scotland)(1994)(经由生成单链抗体片段进行的转基因烟草中的酶促失活)。Q)病毒特异性抗体。参见例如Tavladoraki等，Nature366:469(1993),其显示了表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免于病毒攻击。R)在自然界由病原体或寄生物生成的发育阻滞蛋白(developmental-arrestiveprotein)。例如，真菌内a-I,4_D_多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同-a-1，4-D-半乳糖醒酸酶(galacturonase)来促进真菌定殖(colonization)和植物营养物释放。参见Lamb等，Bio/Technology10:1436(1992)。编码豆内多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征可以由Toubart等，PlantJ.2:367(1992)描述。S)在自然界由植物生成的发育阻滞蛋白。例如Logemann等，Bio/Technology10:305(1992)显示了表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌疾病具有升高的抗性。2.赋予对除草剂的抗性的基因A)抑制生长点或分生组织的除草剂，诸如咪唑啉酮、磺酰胺或磺酰脲。在这类中的例示性基因编码突变的ALS和AHAS酶，如分别由例如Lee等，EMBOJ.7:1241(1988)和Miki等,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)所描述的。B)草甘膦(分别由例如突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSP)基因(经由导入重组核酸和/或天然EPSP基因的体内诱变的各种形式)、aroA基因和草甘膦乙酰基转移酶(GAT)基因赋予的抗性)、其它膦酰基化合物诸如草铵膦(glufosinate)(来自链霉菌属物种(Streptomycesspecies),包括吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomycesviridichromogenes)的草铵膦乙酰基转移酶(PAT)基因)、和卩比唳氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)，见例如Shah等的美国专利No.4，940,835和Barry等的美国专利6，248，876，其披露了可以对植物赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子可以以ATCC保藏号39256获得，并且突变体基因的核苷酸序列可以在Comai的美国专利No.4，769，061中披露。Kumada等的欧洲专利申请No.O333033和Goodman等的美国专利No.4，975，374披露了对除草剂诸如L-膦丝菌素(L-phophinothricin)赋予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列可以参见Leemans等的欧洲申请No.O242246,DeGreef等，Bio/Technology7:61(1989)描述了生成表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物。赋予对苯氧基丙酸和环己酮,诸如稀禾定(sethoxydim)和卩比氟氯禾灵(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括Marshall等，Theor.Appl.Genet.83:435(1992)描述的AcclSl、AcclS2和AcclS3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于Castle等的WO2005012515。赋予对2，4_D、苯氧基丙酸和卩比唳基氧基生长素除草剂的抗性的基因记载于归于DowAgroSciencesLLC的TO2005107437。C)抑制光合作用的除草剂，诸如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等，PlantCell3:169(1991)描述了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣滴虫(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美国专利号4，810，648，并且含有这些基因的DNA分子可以以ATCC保藏号53435、67441、和67442获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达可以由Hayes等，Biochem.J.285:173(1992)描述。3.赋予或促成增值(value-added)性状的基因,诸如A)经修饰的脂肪酸代谢，例如通过用硬脂酰-ACP去饱和酶的反义基因转化植物以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:2624(1992)。B)降低的肌醇六磷酸盐含量——I)肌醇六磷酸酶编码基因的导入会增强肌醇六磷酸盐的分解，向经转化的植物添加更多游离的磷酸盐。例如，参见VanHartingsveldt等，Gene127:87(1993),关于黑曲霉(Aspergillusniger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公开内容。2)可以导入降低肌醇六磷酸盐含量的基因。例如在玉米中，这可以如下实现，即克隆与单一等位基因有关的DNA，然后再次导入，所述单一等位基因可以负责特征为低水平肌醇六磷酸的玉米突变体。参见Raboy等，Maydica35:383(1990)。C)例如通过用编码改变淀粉分支样式的酶的基因转化植物来实现的经修饰的碳水化合物组成。参见Shiroza等，J.Bacteol.170:810(1988)(链球菌(Streptococcus)突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列),Steinmetz等，Mol.Gen.Genet.20:220(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的核苷酸序列可以是果聚糖鹿糖酶(Ievansucrase)基因)；Pen等，Bio/Technology10:292(1992)(表达地衣芽胞杆菌(Bacilluslichenifonn)α-淀粉酶的转基因植物的生成)；Elliot等，PlantMolec.Biol.21:515(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)；Sogaard等，J.Biol.Chem.268:22480(1993)(定点诱变可以是大麦α-淀粉酶基因的)JPFisher等，PlantPhysiol.102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。实施例本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例作为例示提供，而并不意图以任何方式限制本发明。实施例I树枝状聚合物/DNA复合物的制备和细胞处理I.I质粒的制备将pDAB3831质粒DNA(图I)(SEQ.ID.NO.I和2)分离，并准备好进行树枝状聚合物介导的植物转化。使用环化DNA和线性化DNA两者来测试转化实验。为了线性化PDAB3831，完成PCR反应。使用连续热循环系统(其先前已经记载于例如WO2008045288)来PCR扩增pDAB3831。与使用小管不同，连续热循环仪使用重复通过不同温度区的恒定或连续流体流来扩增DNA。将PCR反应混合物注射入与PCR反应混合物不可混合的载体流体中。然后，将载体流体通过多个温度区以便于PCR反应混合物内的DNA扩增。制备样品，其含有12%MgCI2(25mM),O.33%TaqDNA聚合酶(5个单位/μI)、2.0%dNTP(脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、8·0%模板(2μg/ml)、61·66%PluronicF108溶液(I.5%溶液)、4%正向引物、4%反向引物、和8%反应缓冲液(10Χ浓度)。为了解离、退火和延伸目的，分别将系统的相邻部分设置为于95°C、59°C和72°C的温度。以13.79N/cm2使用加压容器将PCR反应混合物泵抽通过该系统。在将反应混合物供应给温度控制体后，使用矿物油来推动样品通过管道的整个长度。用流动阀以O.25ml/分钟控制反应混合物的流速。样品中存在的特定DNA序列随着其周期性通过温度区而被扩增。在第30次循环后，收集内容物。将PCR产物在凝胶过滤柱上纯化，接着进行乙醇沉淀。将纯化产物的样品在Agilent生物分析仪及Agarose凝胶电泳上分析以确认PCR产物的大小和浓度。用于上文所描述的PCR的模板是DAS质粒pDAB3831，其含有由拟南芥属泛素10启动子(AtUbilO)驱动的PAT选择标志基因和由木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV)驱动的杯水母(Philadium)黄色荧光蛋白基因(PhiYFP)。合成正向引物SEQIDN0:3和反向引物SEQIDNO:4以扩增含有这两种基因和其启动子的4.6kbp完整表达盒(即线性化的DNA)。另外，为了便于线性dsDNA与纳米颗粒表面的缀合，使用生物素-TEG-CE-亚磷酰胺来将生物素分子与引物的磷酸根基团化学连接。此亚磷酰胺具有基于三乙二醇接头的延伸的15个原子的混合极性间隔物臂。此延伸的间隔物臂可以将生物素功能与寡聚物的剩余部分分开以有利地降低结合链霉亲合素分子期间任何可能的位阻效应。在标记正向引物时，生物素在DNA的起始处。在标记反向引物时，生物素在DNA片段的末端。因此，可以将生物素化的(两个取向)DNA片段附接于经链霉亲合素包被的纳米颗粒。使用生物素化的寡聚物和连续热循环系统，生成约20mg线性DNA片段。I.2制备DNA/树枝状聚合物复合物用于这些实验的树枝状聚合物是由表面上的伯胺和内部中的叔胺组成的球状阳离子聚酰胺胺(PAMAM)级联聚合物。树枝状聚合物在溶剂分解溶剂中通过热处理部分降解，由此导致较小的空间约束和较大的柔性。树枝状聚合物的高度正电荷便于与DNA的静电相互作用，并且柔性结构允许树枝状聚合物在结合DNA时压紧，而在自DNA释放时膨胀。转染或转化效率由于树枝状聚合物的正电荷和柔性结构特性而升高。树枝状聚合物获自Qiagen(Germantown,MD)，其以SUPERFECT转染试剂(产品目录编号301305)销售。将质粒DNA与O.6mlSUPERFECT试剂混合，并于24°C温育30分钟以形成DNA/树枝状聚合物复合物。使用不同浓度的环化质粒DNA(O.Img和O.5mg)来形成DNA/树枝状聚合物复合物。另外，使用在实施例I.I中的上述线性化DNA来形成DNA/树枝状聚合物复合物。使用O.Img和O.5mg浓度的线性DNA。在形成DNA/树枝状聚合物复合物后，将含有5%蔗糖和.02-.04%Silwet-L77的IOml体积溶液添加至DNA/树枝状聚合物反应。实施例2DNA/树枝状聚合物复合物投递和拟南芥的稳定转化2.I供植物内(inplanta)转化用的植物材料种子的同步萌发对于确保TO植物中的花发育的一致性是重要的。将拟南芥Columbia栽培种种子在O.1%琼脂溶液中悬浮，并于4°C温育48小时以完成分层。将60mg种子称重，并转移至15ml管。添加13mlO.1%琼脂溶液，并涡旋振荡，直至将种子均匀地分散。这创建4.6mg种子/Iml溶液(或约230个种子/ml)的浓度。制备6管(72ml溶液)以播种4个含有每盘中的18个(31/2英寸)盆的平台。将溶液于4°C温育48小时以完成分层。以每盆I.Oml分层种子溶液个别地播种每个盆。在播种所有盆时，将增殖罩放置在盘上以使土壤保持湿润。在播种日后5天除去罩。使种子萌发，并将植物在CONVIRON(模型CMP4030和CMP3244,ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中在长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下以120-150μmol/m2sec的光强度在恒定的温度(22°C)和湿度(40-50%)下种植。在播种植物后10至14天，用霍格兰(Hoagland)氏溶液，随后用DI水给植物烧水以使土壤保持润而不湿(moistbutnotwet)。在播种日后4周后,将花切下以产生次生花(secondaryflower)的更均勻生长。在播种后第5周中，将植物准备好进行转化过程。2.2植物内转化和筛选Tl抗性植物使用来自Clough和Bent的改良方案来完成拟南芥Columbia栽培种的树枝状聚合物介导的转化。(S.J.Clough和A.F.Bent,1998，PlantJ16:73543)。用DNA/树枝状聚合物溶液生成IOml悬浮液，并用于处理拟南芥属植物(主要为未成熟的花簇及一些已受精的长角果)。环形DNA/树枝状聚合物复合物和线性DNA/树枝状聚合物复合物两者彼此独立使用。在浸溃植物前，将浓度0.05%(250ul/500ml)-0.005%的SilwetL-77添加至DNA/树枝状聚合物溶液，并充分混合。将植物的地上部分在DNA/树枝状聚合物溶液中浸溃2-30秒，期间温和搅动。将经处理的植物在塑料罩覆盖物下于22-24°C保持16-24小时。将植物转移至CONVIRONS，并允许其生长至成熟，并生长出种子。使用选择盘(10.5”χ2Γ’χΓ’盘)来筛选来自TO植物的大量收获种子，每个盆上约10，000粒种子。使用两个对照来确保正确地完成选择喷雾=Col-O阴性转化体对照和掺入有在PAT(膦丝菌素乙酰基转移酶)选择标志方面纯合的种子的ColumbiaCol-O野生型作为阳性转化体对照。为了实现同步，将种子在播种前在0.1%琼脂溶液中分层48小时。为了提供每个选择盘10，000粒种子，将200mg种子添加至0.1%琼脂溶液，并涡旋振荡，直至将种子均匀地悬浮。然后，将分层的种、子在用Sunshine混合物LP5填充并用霍格兰氏溶液在下灌溉(sub-irrigated)的选择盘上播种。为了提高选择喷雾的效力，将40ml悬浮种子均匀地播种至选择盘上。播种后，将增殖罩在每个选择盘上放置，并种植植物以进行选择，在播种后约5天除去增殖罩。另外，完成对照实验，其中使用仅含有DNA，没有树枝状聚合物的溶液来转化拟南芥。使用先前描述的方案来转化裸DNA。线性和环形形式的DNA两者彼此独立使用。完成使用土壤杆菌属进行的拟南芥的别的对照转化。使用此转化作为基准来测定树枝状聚合物介导的转化的效率。使用来自Hanahan(1983)的改良方案来将质粒PDAB7331(图2)转化入土壤杆菌属中，使用此菌株来进行拟南芥Columbia栽培种的土壤杆菌属介导的转化。使用由Clough和Bent所描述的浸花法来转化拟南芥。使用选定的土壤杆菌菌落来接种一个或多个IOOml含有壮观霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEP培养基预培养物。将培养物于28。C在以225rpm不断摇动的情况中温育过夜。将细胞以约5000xg于室温沉淀10分钟，并弃去所得的上清液。将细胞团粒在400ml浸泡培养基中温和重悬，所述浸泡培养基含有5%(w/v)蔗糖、10yg/L6-苄基氨基嘌呤、和0.04%SilwetL-77。将约一个月龄的植物在温和搅动的情况中浸入培养基中达5-10分钟。将植物在其侧面放下，并覆盖(透明物或不透明物)2-3天，然后竖立放置。将植物于22°C以16小时光照/8小时黑暗光周期培养。浸溃后约4周，收获种子。2.3选择经转化的植物允许新鲜收获的T1种子于室温干燥7天。将T1种子在26.5x51cm萌发盘中播种，每个萌发盘接受200mg等分试样的分层T1种子(约10，000粒种子)，其先前已经在40mlO.1%琼脂糖溶液中悬浮，并于4°C贮存两天以完成休眠需要并确保同步种子萌发。将Sunshine混合物LP5用细蛭石覆盖，并用霍格兰氏溶液在下灌溉，直至潮湿，然后允许重力排水。用移液管将每个40ml等分试样的分层种子均匀地播种至蛭石上，并用湿度罩覆盖4-5天。除去罩，之后一天使用出现后草铵膦喷雾进行初始转化体选择。种植后7天(DAP)，使用每次应用投递有效速率280gae/ha草铵膦的DeVilbiss压缩空气喷雾尖端用Liberty除草剂(200gae/L草铵膦，BayerCropSciences,KansasCity,MO)的0.2%溶液以喷雾体积IOml/盘(703L/ha)在5天内将T1植物(分别为子叶和2-4-lf阶段)喷雾5次。在最终的喷雾后4-7天鉴定存活者(活跃生长的植物)，并个别地移植入用盆栽培养基(MetroMix360)制备的3英寸盆中。将移植的植物用湿度罩覆盖3-4天，并如先前那样在22°C生长室中放置或直接移到温室。随后，将罩除去，并将植物在温室(22±5。C，50±30%RH，14小时光照:10小时黑暗，最小值500μEAi2S1自然光+补充光)中培养。实施例3对转基因在拟南芥COLUMBIA栽培种的Tl后代中的基因组整合的分子分析3.I转基因的gDNAPCR扩增使用植物DNAZOL试剂盒依照制造商的指令自六周龄植物的总体叶材料提取来自拟南芥转基因植物的基因组DNA。设计PCR引物以检测YFP和PAT转基因。YFP引物以SEQIDN0:5和SEQIDN0:6代表。PAT引物以SEQIDN0:7和SEQIDN0:8代表。使用TaKaRaEXTAQ试剂盒(Takara,Otsu,Shiga,Japan)来完成PAT和YFP的PCR扩增反应。将基因产物在50μI的总反应体积中扩增。PCR反应含有IOOng基因组DNA模板、IXExTaq反应缓冲液、O.2mMdNTP、IOpMol每种引物、和.025个单位/μLExTaq0使用以下PCR条件于96°C持续5分钟的I个循环和下列条件的31个循环94°C达15秒，65°C达30秒，72°C达I分钟，及72°C达7分钟的最终延伸。将PCR扩增产物通过O.8%TAE琼脂糖凝胶电泳分析，并通过溴化乙锭染色显现。图5和图6显示了自这些条件获得的扩增产物。使用先进的Sanger测序技术(MWGBiotech,Huntsville,AL)使用PAT正向引物(SEQIDNO:7)和YFP反向引物(SEQIDNO:5)来对PCR片段测序。使用Sequencher软件来分析序列数据。PAT和YFPPCR扩增子的测序结果与这些基因预期的核苷酸序列匹配。这些结果指示使用SUPERFECT转染试剂将来自pDAB3831的PAT和YFP序列稳定整合入拟南芥的gDNA中。3.2PAT的ELISA筛选自六周龄转基因拟南芥植物叶提取蛋白质以经由ELISA(酶联免疫吸附测定法)来检测表达的PAT蛋白。将含有叶样品的微量离心管在液氮中冷却。使用一次性匀浆器将叶材料研磨成粉末。在冰上平衡5分钟后，添加200μI提取缓冲液(PBST;含有.05%(ν/V)TWEEN20的20mM磷酸盐缓冲液盐水)。将内容物以涡旋振荡混合，并于4°C以13，OOOxg离心10分钟。将上清液自细胞碎片萃取，并在冰上贮存，直至进一步分析。使用用于L.1BERTYLINKPAT/pat-的QUALIPLATE试剂盒(Envirologix,Portland,ME)的改良方案来实施ELISA。将ELISA板和其它试剂于室温平衡。将50μI酶缀合物添加至板的每孔。将另外的50μI提取缓冲液添加至板的每孔。将纯化的转基因拟南芥属蛋白质的连续稀释添加至孔。使用10、5、2.5、和I.25ng/ml的浓度。将其它标准品和植物提取物添加至孔作为对照。将板以200rpm摇动，并于室温温育2小时。温育后，将板在洗板仪中用提取缓冲液清洗5次。对于检测，将100μI来自试剂盒的底物添加至每孔，并将板温育30分钟。使用微板读板仪于595nm的吸光度读取并记录活性。来自标准品的ELISA信号的吸光度指示吸光度信号与每孔中存在的PAT量成正t匕。图5中描绘此数据。SUPERFECT和土壤杆菌介导的经转化的植物的样品显示来自ELISA的强烈信号。这些量比10ng/ml标准品(测定法中测试的最高标准品)高三倍。这些结果指示PAT在经由SUPERFECT介导的植物转化来转化的拟南芥属转基因植物中表达。虽然本发明已经在某些实施方案中进行了描述，但是可以在本公开内容的精神和范围内进一步修饰本发明。因此，本申请意图覆盖本发明使用其一般原理的任何变型、用途、或改编。此外，本申请意图覆盖诸如在本发明所属领域中的已知或习惯实践内和落入所附权利要求书的限定内的对本公开内容的偏离。权利要求1.一种将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞以实现对植物和种子的稳定转化的方法，该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞；将树枝状聚合物，和任选地ー种或多种CPP，与感兴趣的分子相互作用以形成活化的树枝状聚合物结构；将所述具有细胞壁的细胞和所述活化的树枝状聚合物结构置于相互接触中；并允许所述树枝状聚合物和所述感兴趣的分子摄取入所述包含细胞壁的植物细胞中。2.依照权利要求I的方法，其中将树枝状聚合物与感兴趣的分子相互作用包括将所述感兴趣的分子装配到所述树枝状聚合物的表面上。3.依照权利要求I的方法，其中将树枝状聚合物与感兴趣的分子相互作用包括将所述感兴趣的分子的带负电荷的基团与在所述树枝状聚合物末端的带电荷的氨基基团相互作用。4.依照权利要求I的方法，其进ー步包括允许所述树枝状聚合物摄取入所述包含细胞壁的植物细胞的区室中。5.依照权利要求4的方法，其中所述区室选自下组胞质溶胶、细胞核、液泡形成体、质体、黄化质体、色质体、白色体、油质体、蛋白质体、造粉体、叶绿体、和双层膜的腔。6.依照权利要求I的方法，其中所述包含细胞壁的植物细胞选自下组烟草、胡萝卜、玉米、芸苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕榈、花生、大豆、稻属物种(Oryzasp.)、拟南芥属物种(Arabidopsissp.)、蓖麻属物种(Ricinussp.)、和甘鹿细胞。7.依照权利要求I的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的组织胚、分生组织、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果和茎。8.依照权利要求I的方法，其中所述树枝状聚合物包含聚酰胺胺树枝状聚合物。9.依照权利要求I的方法，其进ー步包括衍生化所述树枝状聚合物的表面。10.依照权利要求I的方法，其中所述感兴趣的分子包括选自下组的组分核酸、DNA、RNA,RNAi分子、基因、质粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信号传导肽、抗生素、维生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、药物、除草剂、杀真菌剂、抗生素、及其组合。11.依照权利要求9的方法，其中所述感兴趣的分子包括基因。12.依照权利要求10的方法，其中所述基因是外来蛋白质基因、农学基因、或标志物基因。13.依照权利要求10的方法，其进ー步包括选择具有稳定整合的所述感兴趣分子的细胞。14.依照权利要求12的方法，其中所述选定的细胞是可再生细胞。15.依照权利要求13的方法，其进ー步包括自所述可再生细胞再生植物。16.依照权利要求I的方法，其中所述树枝状聚合物包含树枝状聚合物试剂。17.—种稳定表达基因的方法,该方法包括提供具有细胞壁的植物细胞；将树枝状聚合物，和任选地ー种或多种CPP，与基因相互作用以形成活化的树枝状聚合物结构；将所述具有细胞壁的植物细胞和所述活化的树枝状聚合物结构置于相互接触中；允许所述树枝状聚合物和所述基因摄取入所述包含细胞壁的植物细胞中；并在具有所述植物细胞的植物的后代中表达所述基因。18.依照权利要求17的方法，其中所述基因在叶绿体中表达。19.依照权利要求17的方法，其进ー步包括选择稳定表达所述基因的细胞。20.ー种用于将分子物质转移入植物细胞中的方法，包括将树枝状聚合物，和任选地ー种或多种CPP，与质粒DNA相互作用以形成活化的树枝状聚合物结构；并使所述活化的树枝状聚合物结构与携带完整壁的植物细胞在允许所述树枝状聚合物和来自所述质粒DNA的基因摄取入所述植物细胞中的条件下接触。21.权利要求20的方法，其进ー步包括在具有所述植物细胞的植物的后代中稳定表达所述基因。全文摘要提供了通过使用树枝状聚合物和任选地一种或多种CPP来将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法。提供了用于遗传或以其它方式修饰植物及用于治疗或预防包含细胞壁的植物细胞中的疾病的方法。文档编号C12N15/82GK102686733SQ201080046682公开日2012年9月19日申请日期2010年10月6日优先权日2009年10月16日发明者F.G.伯勒斯,J.P.萨缪尔,K.Y.姚,N.C.萨姆博朱,S.R.韦伯申请人:陶氏益农公司