用于监测患者对vegf拮抗剂的响应的生物学标志物的制作方法

专利名称：用于监测患者对vegf拮抗剂的响应的生物学标志物的制作方法
技术领域：
本申请致力于用于鉴定哪些患者会最多地受益于VEGF拮抗剂疗法治疗及对患者监测他们对VEGF拮抗剂疗法治疗的敏感性和响应性的方法。
背景技术：
测量生物标志物(例如血浆中的分泌型蛋白质)的表达水平可以是鉴定会响应特定疗法(包括例如VEGF拮抗剂治疗)的患者和患者群的一种有效手段。然而，至今，尚未鉴定出可用于鉴定此类患者和患者群的生物标志物综合组。如此，需要更有效的手段来确定哪些患者会响应哪种治疗及将如此确定的治疗掺入VEGF拮抗剂疗法对患者的更有效的治疗方案，无论将它们用作单一药剂或是与其它药剂组合。发明概述本发明提供用于鉴定会响应VEGF拮抗剂治疗的患者的方法和组合物。响应VEGF拮抗剂疗法的患者基于表1-3任一所列基因的表达水平来鉴定。因而，本发明的一个实施方案提供用于监测接受至少一剂VEGF拮抗剂的患者是否会响应VEGF拮抗剂的方法，该方法包括(a)检测施用至少一剂VEGF拮抗剂之后自患者获得的生物学样品中至少一种表1-3任一所列基因的表达；并(b)将该至少一种基因的表达水平与对该患者施用该VEGF拮抗剂之前自该患者获得的生物学样品中该至少一种基因的表达水平比较，其中施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中该至少一种基因的表达水平的降低鉴定出会响应VEGF拮抗剂治疗的患者。在一些实施方案中，该至少一种基因的表达通过测量mRNA来检测。在一些实施方案中，该至少一种基因的表达通过测量血浆蛋白质水平来检测。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测来自该患者的生物学样品中至少第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种、第十种、第十一种、第十二种、第十三种、第十四种、第十五种、第十六种、第十七种、第十八种、第十九种、第二十种、第二十一种、第二十二种、第二十三种、第二十四种、第二十五种、第二十六种、第二十七种、第二十八种、第二十九种、第三十种、第三十一种、第三十二种、第三十三种、第三十四种、第三十五种、第三十六种、第三十七种、第三十八种、第三十九种、第四十种、第四十一种、第四十二种、第四十三种、第四十四种、第四十五种、第四十六种、第四十七种、第四十八种、第四十九种、第五十种、第五十一种、第五十二种、第五十三种、第五十四种、第五十五种、第五十六种、第五十七种、第五十八种、或第五十九种表1-3任一所列基因的表达，并比较对该患者施用该VEGF拮抗剂之前来自该患者的生物学样品中该第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种、第十种、第十一种、第十二种、第十三种、第十四种、第十五种、第十六种、第十七种、第十八种、第十九种、第二十种、第二十一种、第二十二种、第二十三种、第二十四种、第二十五种、第二十六种、第二十七种、第二十八种、第二十九种、第三十种、第三十一种、第三十二种、第三十三种、第三十四种、第三十五种、第三十六种、第三十七种、第三十八种、第三十九种、第四十种、第四十一种、第四十二种、第四十三种、第四十四种、第四十五种、第四十六种、第四十七种、第四十八种、第四十九种、第五十种、第五十一种、第五十二种、第五十三种、第五十四种、第五十五种、第五十六种、第五十七种、第五十八种、或第五十九种基因的表达水平，其中所述第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种、第十种、第十一种、第十二种、第十三种、第十四种、第十五种、第十六种、第十七种、第十八种、第十九种、第二十种、第二十一种、第二十二种、第二十三种、第二十四种、第二十五种、第二十六种、第二十七种、第二十八种、第二十九种、第三十种、第三十一种、第三十二种、第三十三种、第三十四种、第三十五种、第三十六种、第三十七种、第三十八种、第三十九种、第四十种、第四十一种、第四十二种、第四十三种、第四十四种、第四十五种、第四十六种、第四十七种、第四十八种、第四十九种、第五十种、第五十一种、第五十二种、第五十三种、第五十四种、第五十五种、第五十六种、第五十七种、第五十八种、或第五十九种基因的表达水平的降低鉴定出会响应VEGF拮抗剂治疗的患者。在一些实施方案中，该至少一种基因选自ABCC9 ；AFAP1L1 ；CD93 ；CTLA2A ；CTLA2B ；CNTNAP2 ；C0L18A1 ；C0L4A1 ；C0L4A2 ；EGFL7 ；ELTDl ；ESMl ；FAM38B ；FAM167B ；GIMAPl ；GIMAP5 ；GIMAP6 ；GNGll ；GPRl 16 ；HBB ； ICAM2 ；KCNE3 ；KDR ；MCAM ；MEST ；MMRN2 ；MYCTl ；MYL9 ；NIDl ；NID2 ；N0S3 ；N0TCH4 ；0LFML2A ；PCDH17 ；PDE6D ；PODXL ；PRND ；RAPGEF3 ；RASGRP3 ；RBP7 ；SPARCL1 ； SPRY4 ；TAGLN ；TMEM88 和 TSPAN18。在一些实施方案中，该 VEGF 拮抗剂是抗VEGF抗体，包括例如贝伐单抗(bevacizumab)。在一些实施方案中，该患者具有血管发生性病症。在一些实施方案中，该血管发生性病症是选自下组的癌症结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，成胶质细胞瘤，及其组合。 本发明的又一个实施方案提供监测接受至少一剂VEGF拮抗剂的患者是否会响应VEGF拮抗剂治疗的方法，该方法包括(a)检测施用至少一剂VEGF拮抗剂之后自患者获得的生物学样品中至少一种表1-3任一所列基因的表达；并(b)将该至少一种基因的表达水平与对该患者施用该VEGF拮抗剂之前自该患者获得的生物学样品中该至少一种基因的表达水平比较，其中施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中该至少一种基因的表达水平的降低鉴定出受益于VEGF拮抗剂的可能性升高的患者。在一些实施方案中，该至少一种基因的表达通过测量mRNA来检测。在一些实施方案中，该至少一种基因的表达通过测量血浆蛋白质水平来检测。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测来自该患者的生物学样品中至少第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种、第十种、第十一种、第十二种、第十三种、第十四种、第十五种、第十六种、第十七种、第十八种、第十九种、第二十种、第二十一种、第二十二种、第二十三种、第二十四种、第二十五种、第二十六种、第二十七种、第二十八种、第二十九种、第三十种、第三十一种、第三十二种、第三十三种、第三十四种、第三十五种、第三十六种、第三十七种、第三十八种、第三十九种、第四十种、第四十一种、第四十二种、第四十三种、第四十四种、第四十五种、第四十六种、第四十七种、第四十八种、第四十九种、第五十种、第五十一种、第五十二种、第五十三种、第五十四种、第五十五种、第五十六种、第五十七种、第五十八种、或第五十九种表1-3任一所列基因的表达，并比较对该患者施用该VEGF拮抗剂之前来自该患者的生物学样品中该第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种、第十种、第十一种、第十二种、第十三种、第十四种、第十五种、第十六种、第十七种、第十八种、第十九种、第二十种、第二十一种、第二十二种、第二十三种、第二十四种、第二十五种、第二十六种、第二十七种、第二十八种、第二十九种、第三十种、第三十一种、第三十二种、第三十三种、第三十四种、第三十五种、第三十六种、第三十七种、第三十八种、第三十九种、第四十种、第四十一种、第四十二种、第四十三种、第四十四种、第四十五种、第四十六种、第四十七种、第四十八种、第四十九种、第五十种、第五十一种、第五十二种、第五十三种、第五十四种、第五十五种、第五十六种、第五十七种、第五十八种、或第五十九种基因的表达水平，其中该第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种、第十种、第十一种、第十二种、第十三种、第十四种、第十五种、第十六种、第十七种、第十八种、第十九种、第二十种、第二十一种、第二十二种、第二十三种、第二十四种、第二十五种、第二十六种、第二十七种、第二十八种、第二十九种、第三十种、第三十一种、第三十二种、第三十三种、第三十四种、第三十五种、第三十六种、第三十七种、第三十八种、第三十九种、第四十种、第四十一种、第四十二种、第四十三种、第四十四种、第四十五种、第四十六种、第四十七种、第四十八种、第四十九种、第五十种、第五十一种、第五十二种、第五十三种、第五十四种、第五十五种、第五十六种、第五十七种、第五十八种、或第五十九种基因表达水平的降低鉴定出会响应VEGF拮抗剂治疗的患者。在一些实施方案中，该至少一种基因选自ABCC9 ；AFAP1L1 ；CD93 ；CTLA2A ；CTLA2B ；CNTNAP2 ；C0L18A1 ；C0L4A1 ；C0L4A2 ；EGFL7 ；ELTDl ；ESMl ；FAM38B ；FAM167B ；GIMAPl ；GIMAP5 ；GIMAP6 ；GNGll ；GPRl 16 ；HBB ；ICAM2 ；KCNE3 ；KDR ；MCAM ；MEST ；MMRN2 ；MYCTl ；MYL9 ；NIDl ；NID2 ；N0S3 ；N0TCH4 ；0LFML2A ；PCDH17 ；PDE6D ；PODXL ；PRND ；RAPGEF3 ；RASGRP3 ；RBP7 ；SPARCL1 ；SPRY4 ；TAGLN ；TMEM88 和 TSPAN18。在一些实施方案中，该 VEGF 拮抗剂是抗 VEGF抗体，包括例如贝伐单抗。在一些实施方案中，该患者具有血管发生性病症。在一些实施方案中，该血管发生性病症是选自结肠直肠癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤、及其组合的癌症。
本发明的另一个实施方案提供用于为接受至少一剂VEGF拮抗剂的患者(例如诊断有血管发生性病症的患者，包括但不限于结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、或成胶质细胞瘤)选择疗法的方法，包括(a)检测施用VEGF拮抗剂之后自患者获得的生物学样品中至少一种表1-3任一所列基因的表达；(b)将该至少一种基因的表达水平与对该患者施用该VEGF拮抗剂之前自该患者获得的生物学样品中该至少一种基因的表达水平比较；并(c)如果在施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中检测到该至少一种基因的表达水平的降低的话，选择VEGF拮抗剂作为疗法；或(d)如果在施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中没有检测到该至少一种基因的表达水平的降低的话，选择不是VEGF拮抗剂的疗法。在一些实施方案中，(c)的疗法包括施用选自下组的药剂抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，及其组合。在一些实施方案中，(d)的疗法包括施用选自下组的药剂抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，及其组合物。在一些实施方案中，该至少一种基因选自ABCC9;AFAPILl ；CD93 ；CTLA2A ；CTLA2B ；CNTNAP2 ；C0L18A1 ；C0L4A1 ；C0L4A2 ；EGFL7 ；ELTDl ；ESMl ；FAM38B ；FAM167B ；GIMAPl ；GIMAP5 ；GIMAP6 ；GNGll ；GPRl 16 ；HBB ；ICAM2 ；KCNE3 ；KDR ；MCAM ；MEST ；MMRN2 ；MYCTl ；MYL9 ；NIDl ；NID2 ；N0S3 ；N0TCH4 ；0LFML2A ；PCDH17 ；PDE6D ；PODXL ；PRND ；RAPGEF3 ；RASGRP3 ；RBP7 ； SPARCL1 ； SPRY4 ；TAGLN ；TMEM88 和 TSPAN18。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测来自该患者的生物学样品中至少第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、第七种、第八种、第九种、第十种、第十一种、第十二种、第十三种、第十四种、第十五种、第十六种、第十七种、第十八种、第十九种、第二十种、第二十一种、第二十二种、第二十三种、第二十四种、第二十五种、第二十六种、第二十七种、第二十八种、第二十九种、第三十种、第三十一种、第三十二种、第三十三种、第三十四种、第三十五种、第三十六种、第三十七种、第三十八种、第三十九种、第四十种、第四十一种、第四十二种、第四十三种、第四十四种、第四十五种、第四十六种、第四十七种、第四十八种、第四十九种、第五十种、第五十一种、第五十二种、第五十三种、第五十四种、第五十五种、第五十六种、第五十七种、第五十八种、或第五十九种表1-3任一所列基因的表达。在一些实施方案中，该方法进一步包括(e)如果在施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中检测到该至少一种基因的表达的降低的话，对该患者施用有效量的VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，该VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体(例如贝伐单抗)。在一些实施方案中，该方法进一步包括(f)施用有效量的至少第二种药剂，包括例如选自下组的药剂抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，及其组合。本发明的又一个实施方案提供鉴定用于监测对VEGF拮抗剂的响应的生物标志物的方法，该方法包括(a)检测自接受至少一剂VEGF拮抗剂的患者获得的生物学样品中候选生物标志物的表达；并(b)将该候选生物标志物的表达水平与参照样品中该候选生物标志物的表达水平比较，其中在施用该VEGF拮抗剂之后获得的生物学样品以低至少1. 5倍、
1.6 倍、1. 7 倍、1. 8 倍、1. 9 倍、1. 95 倍、1. 99 倍、2 倍、2. 1 倍、2. 2 倍、2. 3 倍、2. 4 倍、2. 5 倍、
2.6 倍、2. 7 倍、2. 8 倍、2. 9 倍、3 倍、3. 1 倍、3. 2 倍、3. 3 倍、3. 4 倍、3. 5 倍、3. 6 倍、3. 7 倍、3. 8倍、3. 9倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍的水平表达的候选生物标志物鉴定为可用于监测对VEGF拮抗剂的响应的生物标志物。在一些实施方案中，该参照样品是在对该患者施用该VEGF拮抗剂之前自该患者获得的生物学样品。在一些实施方案中，该VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体，包括例如贝伐单抗。附图简述

图1图示数据，证明某些基因在VEGF拮抗剂治疗后7天时下调。阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达。空心和划线圆圈代表在VEGF拮抗剂治疗后7天时下调的基因。空心圆圈代表LOD得分>0的基因。划线圆圈代表LOD得分>2的基因。图2图示数据，证明某些基因在VEGF拮抗剂治疗后14天时下调。阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达。空心和划线圆圈代表在VEGF拮抗剂治疗后14天时下调的基因。空心圆圈代表LOD得分>0的基因。划线圆圈代表LOD得分>2的基因。图3图示在VEGF拮抗剂治疗后7天和14天时下调的基因之间的交叠。图3A 阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达；空心圆圈代表在7天时以LOD得分> 0下调的基因；加号代表在14天时以LOD得分>0下调的基因；划线圆圈代表在7和14天时以LOD得分> 0下调的基因。图:3B 阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达；空心圆圈代表在7天时以LOD得分> 0下调的基因；加号代表在14天时以LOD得分> 0下调的基因；划线圆圈代表在7和14天时以LOD得分>0下调的基因。图4图示数据，证明下文实施例1和2中描述的基因签名中的基因在结肠直肠腺癌肿瘤异种移植物模型的基质中响应VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体)下调。4A :阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达；空心圆圈代表以LOD得分> 2下调的基因(ρ值5. 3e-82)。4B 阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达；空心圆圈代表以LOD得分>0下调的基因(P值4.8e-74)。图5图示数据，证明下文实施例1和2中描述的基因签名中的基因在转移性乳腺癌异种移植物模型的基质中响应VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体)下调。5A:阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达；空心圆圈代表以LOD得分> 2下调的基因(ρ值1. 6e-159)。5Β 阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达；空心圆圈代表以LOD得分> 0下调的基因(ρ值7. Oe-266)。图6图示数据，证明下文实施例1和2中描述的基因签名中的基因在结肠腺癌异种移植物模型的基质中响应VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体)下调。6A 阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达；空心圆圈代表以LOD得分> 2下调的基因(ρ值5. 6e-18)。6B 阴影圆圈代表VEGF拮抗剂治疗之前的基因表达；空心圆圈代表以LOD得分> 0下调的基因(P 值 3. 4e-43)。发明详述I.导言本发明提供用于监测和/或鉴定对VEGF拮抗剂治疗敏感或响应的患者的方法和组合物。本发明基于如下发现，即至少一次VEGF拮抗剂治疗之前和之后至少1，2，3，4，5，6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59或更多种表1-3任一所列基因的表达水平可用于监测患者对VEGF拮抗剂治疗的响应性或敏感性及鉴定对VEGF拮抗剂治疗敏感或响应的患者。II.定义术语“生物标志物，，和“标志物”在本文中可互换使用，指基于DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、或糖脂的生物标志物，它们在受试者的或患者的样品中的表达或存在可通过标准方法(或本文中所公开的方法)来检测，而且可用于监测哺乳动物受试者对VEGF拮抗剂的响应性或敏感性。此类生物标志物包括但不限于表1-3中所列基因。此类生物标志物的表达可测得出在患者接受至少一剂VEGF拮抗剂之后自对VEGF拮抗剂敏感或响应的患者获得的样品中的比对照样品(包括例如在VEGF拮抗剂处理之前自同一患者获得的样品、自一名或多名未用VEGF拮抗剂治疗的无关个体获得的样品)中的低。较低的表达通常指比对照样品中的表达低例如1. 5倍、1. 6倍、1. 7倍、1. 8倍、1. 9倍、1. 95倍、1. 99倍、2倍、2. 1倍、2. 2 倍、2. 3 倍、2. 4 倍、2. 5 倍、2. 6 倍、2. 7 倍、2. 8 倍、2. 9 倍、3 倍、3. 1 倍、3. 2 倍、3. 3 倍、3. 4倍、3. 5倍、3. 6倍、3. 7倍、3. 8倍、3. 9倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍或更多的表达水平。较低的表达也指平均log比相对于测量的所有基因的表达水平均值降低至少约-2、-3、-4、-5、或-6个标准偏差。术语“样品，，和“生物学样品，，可互换使用，指任何自个体获得的生物学样品，包括体液、身体组织、细胞、或其它来源。体液是例如淋巴、血清、新鲜全血、外周血单个核细胞、冷冻的全血、血浆(包括新鲜的或冷冻的)、尿液、唾液、精液、滑液和脊髓液。样品还包括乳房组织、肾组织、结肠组织、脑组织、肌肉组织、滑膜组织、皮肤、毛囊、骨髓、和肿瘤组织。用于自哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域公知的。患者对VEGF拮抗剂治疗的“有效响应”(effective response)或患者对VEGF拮抗剂治疗的“响应性” (responsiveness)或“敏感性”(sensitivity)指源自用VEGF拮抗剂 (诸如VEGF抗体)进行的治疗或作为该治疗的结果，给予患者(有血管发生性病症风险或患有血管发生性病症)的临床或治疗受益。此类受益包括细胞或生物学应答、完全响应、部分响应、稳定的病情(没有进展或复发)、或源自用该拮抗剂进行的治疗或作为该治疗的结果的患者响应及稍后复发。例如，有效响应可以是诊断为表达表1-3任一所列一种或多种生物标志物的患者中与不表达一种或多种所述生物标志物的患者相比缩小的肿瘤尺寸或延长的无进展存活。遗传生物标志物的表达有效预示，或以高灵敏度预示此类有效响应。如本文中使用的，“拮抗剂”指抑制或降低它们所结合的分子的生物学活性的化合物或药剂。拮抗剂包括结合VEGF的抗体、合成或天然序列肽、免疫粘附素、和小分子拮抗剂，任选偶联有或融合至另一分子。“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低它所结合的抗原的生物学活性的抗体。如本文中使用的，“激动性抗体”指部分或完全模拟感兴趣多肽的至少一种功能活性的抗体。术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如 Lowry法的测定，抗体重量超过95%，而在有些实施方案中，重量超过99%，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或C3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约 150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(Vh)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VJ，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均勻分布于抗体的整个可变域。 它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR —起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见 Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, H 5 fiji, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))。 11 : ^^ 接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、 δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性描述于例如 Abbas et al.，Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co.，2000)。 抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。“裸抗体(裸露的抗体)”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fe”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F (ab' )2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(SCFV) 种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和重链可以在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，每个可变域的三个HVR相互作用而在二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR —起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个 HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域 (CHl)0Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基， 包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab' -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab' ) 2抗体片段最初是作为在Fab ‘片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在Vh与八结构域之间进一步包含多肽接头， 其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Plilckthim，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 编， Springer-Verlag, New York, 1994，第 269—315 页。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多肽链 (Vh-Vl)中包含相连的重链可变域(Vh)和轻链可变域(\)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如 EP 404, 097 ；WO 1993/01161 ；Hudson et al.，Nat. Med. 9 129-134 (2003)；及Hollinger et al.，PNAS USA 90 :6444-6448 (1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于 Hudson et al. , Nat. Med. 9 129-134 (2003) 术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此， 修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解， 所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如 Kohler and Milstein, Nature, 256 :495-97 (1975) ；Hongo et al. , Hybridoma,14(3) :253-260 (1995), Harlow et al. , Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版 1988) ；Hammerling et al., 于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y. , 1981)) > 重组DNA法(参见例如美国专利No. 4，816，567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al. , Nature 352:624-628(1991) ；Marks et al. , J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1992)； Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338(2) :299-310(2004) ；Lee et al. , J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093(2004) ；Fellouse, PNAS USA 101 (34) :12467-12472(2004) ；Lee et al.， J. Immunol. Methods 284(1-2) :119-132 (2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如 WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ；WO 1991/10741 Jakobovits et al. , PNAS USA 90:2551 (1993) Jakobovits et al.，Nature362 :255-258 (1993)； Bruggemann et al.，Year in Immuno. 7 :33 (1993)；美国专利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ； 5, 569, 825 ；5, 625, 126 ；5, 633, 425 ；禾口 5，661，016 ;Marks et al. , Bio/Technology 10: 779-783(1992) ；Lonberg et al. , Nature 368:856-859(1994) ；Morrison, Nature 368 812-813(1994) ；Fishwild et al. , Nature Biotechnol. 14 :845-851(1996) ；Neuberger,Nature Biotechnol. 14 :826 (1996) ；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(例如美国专利No. 4，816，567 ；Morrison et al. ,PNAS USA81 =6851-6855 (1984)) 0嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。非人(例如鼠)抗体的“人源化式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔、或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。 可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al., Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann et al. ,Nature 332 :323-329(1988) ；^P Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。还可参见例如 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma&Immunol.1 105-115 (1998) ；Harris, Biochem. Soc. Transactions23 1035-1038(1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428-433(1994)；及美国专利 No. 6，982，321 和 7，087，409。“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 :381 (1991) ；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581 (1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ；Boerner et al.，J. Immunol. 147(1) :86-95 (1991)。还可参见 van Dijk and van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol.，5 :368-74 (2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6，075，181和6，150，584，关于XEN0M0USE 技术)。还可参见例如Li et al. , PNAS USA，103 :3557-3562 Q006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和 /或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al. Immunity 13 :37-45 (2000) Johnson and Wu 于Methods in Molecular Biology 248 :1-25 (Lo， ed.，Human Press, Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.，Nature 363 446-448(1993)；及 Sheriff et al. , Nature Struct. Biol. 3 :733-736 (1996)。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。作为Kabat互补决定区(OTR)的HVR是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917(1987)) ο AbM HVR 代表 Kabat CDR 与 Chothia 结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每-
-个的残基。
环
Kabat
AbM
Chothia
接触
Ll L2 L3 Hl
Hl
H2 H3
L24-L34 L50-L56 L89-L97
L24-L34 L50-L56 L89-L97
L26-L32 L50-L52 L91-L96
L30-L36 L46-L55 L89-L96
H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat编号)
H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia编号)
H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H95-H102
H95-H102
H96-H101
H93-H101HVR 可包括如下“延伸的 HVR" :VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)、46-56 或 50-56 (L2) 和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102 (H3)。对于这些延伸的HVR定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。表述“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变体指Kabat et al.，见上文中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域 FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照 Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和 82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准” Kabat编号序列对比同源区来确定。“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案， 亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。例如，Marks et al. ,Bio/Technology 10:779-783(1992) 记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了 HVR和/或框架残基的随机诱变例如 Barbas et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813(1994) ；Schier et al.，Gene 169 :147-155(1995) ；Yelton et al.，J.Immunol. 155 :1994-2004(1995)； Jackson et al.，J. Immunol. 154(7) :3310-9(1995) ；Hawkins et al.，J. Mol. Biol. 226 889-896(1992)。“生长抑制性”抗体指那些阻止或降低表达抗体所结合之抗原的细胞增殖的抗体。“诱导凋亡”的抗体指那些根据标准凋亡测定法的测定，诱导程序性细胞死亡的抗体，所述测定法诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)形成。抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体 Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。术语“Fe区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包括天然序列Fc 区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自其或ftx)230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸 (残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一 K447残基被消除的抗体群、或者混合了有K447残基的抗体和没有K447 残基的抗体的抗体群。除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat et al.，见上文中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgGlEU抗体的残基编号方式。“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括Clq结合；⑶C ；Fc受体结合；ADCC ；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文定义中所公开的。“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgGl Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区；及其天然存在变体。“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰(优选一处或多处氨基酸替代)而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc 区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80%的同源性，最优选与它们具有至少约90%的同源性，更优选与它们具有至少约95%的同源性。“含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除，例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改造编码抗体的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、消除了所有K447的抗体、或具有与没有K447残基的抗体的混合物。“Fe受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR( γ受体)，包括属于Fc γ RI、 FcyRII和Fc γ RIII亚类的受体，包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA( “活化受体”)和Fc y RIIB ( “抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体Fc y RIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fc γ RIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如 Da e ron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234(1997)) FcR 的综述参见例如 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457-492(1991) ；Capel et al. , Immunomethods 4:25-34(1994)；及 de Haas et al. , J. Lab. Clin. Med. 126 330-341(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。术语“Fe受体”或“FcR”还包括新生儿受体，Fcfoi，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J. Immunol. 117 :587(1976)禾口 Kim et al.，J. Immunol. 24 2429-249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对Fcfoi的结合的方法是已知的(参见例如(^hetie 1997，Hinton 2004)。测量对Fcfoi的结合的方法是已知的(参见例如 Ghetie and Ward·， Immunology Today 18(12) :592-8(1997) ；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7) :637-40(1997) ；Hinton et al. , J. Biol. Chem. 279(8) 6213-6(2004) ；WO 2004/92219(Hinton et al·))。可测定人Fcfoi高亲和力结合多肽与人Fcfoi的体内结合和血清半衰期，例如在表达人Fcfoi的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO 00/42072 (Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例如 Shields et al. , J. Biol. Chem. 9 (2) :6591-6604(2001) “人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达Fc YRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞 (例如NK细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达Fc γ RIII，而单核细胞表达Fc YRI、 Fc YRII 禾口 Fc yRIII。 Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92(1991)第 464 页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC 测定法，诸如美国专利No. 5，500，362或5，821，337或美国专利No. 6，737，056 (Presta) 中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95 652-656(1998)中所披露的。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合抗体(适宜亚类的)起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如feizzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods 202 :163 (1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的Clq结合能力的多肽变体记载于例如美国专利 No. 6，194，551B1 和 WO 1999/51642。还可参见例如 Idusogie et al.，J. Immunol. 164 4178-4184(2000)。“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1 1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离， 而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的、示例性和例示性的、用于测量结合亲和力的实施方案。在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab 型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen，et al.，J Mol Biol 293 :865-881 (1999))。为了确定测定条件，用 50mM 碳酸钠(pH 9.6)中的 5μ g/ml 捕捉用抗 Fab 抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(DYNEX Technologies, Inc.) 过夜，随后用PBS中的2% (w/v)牛血清清蛋白在室温(约23°C)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将IOOpM或^pM[125I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与 Presta et al.，Cancer Res. 57 :4593-4599(1997)中抗 VEGF 抗体，Fab-12 的评估一致)。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如约65个小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液， 并用含0. 1% Tween-20 表面活性剂的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150 μ 1/孔闪烁液(MICR0SCINT-20 ；I^ackard)，然后在 T0PC0UNT 伽马计数器(I^ackard)上对平板计数 10 分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用 BIACORE -2000 或BIACORE -3000 仪器(BIAcore，Inc. , Piscataway, NJ)在 25°C 使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.) 0用IOmM乙酸钠pH 4. 8将抗原稀释至5 μ g/ml (约0. 2 μ Μ)，然后以5 μ 1/分钟的流速注入至获得约十个响应单位 (RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25°C以约25 μ 1/分钟的流速注入在含0. 05% TffEEN 20 表面活性剂的PBS(PBST) 中两倍连续稀释的Fab (0. 78ηΜ至500ηΜ)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型 (BIAcore Evaluation Software version 3. 2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kj和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率k。ff/k。n计算。参见例如Chen et al.，J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过IO6M-1S-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000系列SLM-AMINCO 分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25°C的荧光发射强度(激发=295nm;发射=340nm，16nm带通)的升高或降低。0J W “^ O-M^" (on-rate, rate of association, association rate) 或"k。n” 也可如上所述使用BIACORE -2000 或BIACORE -3000 系统(BIAcore， Inc. , Piscataway, NJ)来测定。短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(例如，一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50%，小于约40%，小于约30%，小于约20%，和/或小于约10%。短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值(通常一个与某分子有关而另一个与参照/比较分子有关)之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约 10 %，大于约20 %，大于约30 %，大于约40 %，和/或大于约50 %。在某些实施方案中，本文中有用的人源化抗体进一步包含IgG Fc中的氨基酸改变且展现超出具有野生型IgG Fc的抗体升高至少60倍、至少70倍、至少80倍、更优选至少 100倍、优选至少125倍、甚至更优选至少150倍至约170倍的对人Fcfoi的结合亲和力。“病症”或“疾病”指将受益于本发明物质/分子或方法的治疗的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔的病症；及炎性、免疫学和其它血管发生性病症。术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症是血管发生。“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤 (h印atoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL) NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏 (Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病 (ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(Phakomatoses)JKW (诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。术语“抗肿瘤组合物”或“抗癌组合物”或“抗癌剂”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR) 拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib (TarcevaTM)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GleevecTM (Imatinib Mesylate))、C0X_2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与 ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR- β、BlyS、APRIL、 BCMA、VEGF或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、TRAIL/ Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生 (angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、P1GF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素)、印hrin、Del-l、酸性(aFGF)和碱性 (bFGF)成纤维细胞生长因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)Jf 细胞生长因子(HGF)/散射因子(3朽、白介素-8(11^-8)丄印^11、1^(11^1^、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子尤其是PDGF-BB或PDGFR-β、 Pleiotrophin(PTN)、Progranulin, Proliferin、转化生长因子-α (TGF- α )、转化生长因子-β (TGF-β)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)/血管通透性因子 (VPF)等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、 VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun and D' Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53 :217-39 ；Streit and Detmar (2003) Oncogene 22 :3172-3179 ；Ferrara&Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12) :1359-1364 ；Tonini 等 (2003) Oncogene 22 :6549-6556 (例如列举已知血管发生因子的表 1) ；Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8 :200_206。术语“VEGF”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等(1989) Science 246 :1306和Houck等(1991) Mol. Endocrin，5 1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF (8-109) ”、“VEGF (1-109) ”或"VEGF165”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-I受体的结合亲和力。依照一个优选的实施方案，所述VEGF是人VEGF。"VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性，包括其与 VEGF或一种或多种VEGF受体或编码它们的核酸结合的分子。优选的是，所述VEGF拮抗剂结合VEGF或VEGF受体。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、结合VEGF和VEGF 受体并阻断配体-受体相互作用的多肽(例如免疫粘附素、肽体)、抗VEGF受体抗体和VEGF 受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂、结合VEGF的适体和在严格条件下与编码VEGF或VEGF受体杂交的核酸(例如RNAi)。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂结合VEGF并抑制VEGF诱导的体外内皮细胞增殖。依照一个优选的实施方案，所述VEGF 拮抗剂以大于非VEGF或非VEGF受体的亲和力结合VEGF或VEGF受体。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于IuM和IpM之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。依照另一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂以介于500nM和IpM之间的Kd结合VEGF或VEGF受体。依照一个优选的实施方案，所述VEGF拮抗剂选自多肽诸如抗体、肽体、免疫粘附素、小分子或适体。在一个优选的实施方案中，所述抗体是抗VEGF抗体(诸如AVASTIN 抗体)或抗VEGF受体抗体(诸如抗VEGFR2或抗VEGFR3抗体)。VEGF拮抗剂的其它例子包括VEGF-Trap、Mucagen, PTK787、SUl 1248、AG-013736、Bay 439006 (sorafenib)、 ZD-6474、CP632、CP-547632、AZD-2171、CDP-171、SU-14813、CHIR-258、AEE-788、SB786034、 BAY579352、CDP-791、EG-3306、GW-786034、RWJ-417975/CT6758 和 KRN-633。“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患时用作治疗剂。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如 P1GF、PDGF或bFGF。一种优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4. 6. 1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是依照I^resta 等，Cancer Res. 57 :4593-4599 (1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为bevacizumab (贝伐单抗；BV;Avastin )的抗体。依照另一个实施方案，可以使用的抗VEGF抗体包括但不限于WO 2005/012359中披露的抗体。依照一个实施方案，所述抗VEGF抗体包含WO 2005/012359的图24、25、26、27和四中披露的任一抗体(例如G6、 G6-23、G6-31、G6-23. 1、G6-23. 2、B20、B20-4 和 B20. 4. 1)的重链可变区和轻链可变区。在另一个优选的实施方案中，称为ranibizumab的抗VEGF抗体是为了眼病诸如糖尿病神经病变和AMD而施用的VEGF拮抗剂。抗VEGF 抗体“贝伐单抗” (bevacizumab, BV),也称为 “rhuMAb VEGF” 或 "Avastin ’’,是依照Presta et al.，Cancer Res. 57 :4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgGl框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗 hVEGF单克隆抗体A4.6. 1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgGl，而大约7 %的序列衍生自鼠抗体A4. 6. 1。贝伐单抗具有约 149，000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。其它抗VEGF抗体包括美国专利No. 6884879和 W02005/044853中披露的抗体。抗VEGF抗体Ranibizumab或Lucentis 抗体或rhuFab V2是人源化的、亲和力成熟的抗人VEGF Fab片段。Ranibizumab是通过标准重组技术在大肠杆菌表达载体和细菌发酵中生成的。Ranibizumab是未糖基化的且分子量为约48，000道尔顿。参见W098/45331 和 US20030190317。血管发生失调可导致异常血管发生，即疾病状态中的或引起疾病状态的新血管生长过度、不足、或其它方面不当(例如从医学观点看不良的血管发生位置、时间或启动)时， 即血管发生性病症。过度的、不当的或失控的血管发生发生于有促成疾病状态恶化或引起疾病状态的新血管生长时。新血管可供应患病组织，破坏正常组织，而且，在癌症的情况中， 新血管可容许肿瘤细胞逃入循环并停留在其它器官中(肿瘤转移)。牵涉异常血管发生的疾病状况(即血管发生性病症)包括非肿瘤性的和肿瘤性的疾患，包括例如癌症，尤其是血管化实体瘤和转移瘤(包括结肠癌、乳腺癌、肺癌(尤其是小细胞肺癌)、脑癌(尤其是成胶质细胞瘤)或前列腺癌)、不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病或IBD(克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、虹膜前面的新血管形成(发红)、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑脊膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、慢性炎症、肺炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignant pulmonary effusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭合性头部外伤/创伤有关的)、滑液炎症、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、 多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第三空间流体病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、子宫纤维瘤(uterinefibroids)、早产、慢性炎症诸如IBDj^ 同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长(非癌性的)、 血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osier-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(诸如与心包炎有关的)和胸腔积液。在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展。“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。本发明的物质/分子、拮抗剂或激动剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。术语“治疗有效量”指在哺乳动物(aka患者)中有效“治疗”疾病或紊乱的本发明抗体、多肽、或拮抗剂的数量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积或重量；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。在一个实施方案中，治疗有效量是生长抑制量。在另一个实施方案中，治疗有效量是延长患者存活的量。在另一个实施方案中，治疗有效量是改进患者无进展存活的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量低于治疗有效量。术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊昔(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仓(melphalan)、丝裂霄素(mitomycin)C、 苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。 杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiot印a)和CYTOXAN 环磷酰胺 (cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzod印a)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturecbpa)和乌瑞替派(ured印a)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)) ； δ -9-四氢大麻
(tetrahydrocannabinol) ( jffi i；(dronabinol)， MARINOL ) ； β -
帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康 (topotecan) ( HYCAMTIN )、CPT-Il (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR )、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)； callystatin ;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)； 多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞 ^各素(eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ；海绵^^ (spongistatin)；氣芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、 胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride) > 美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、 福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾口雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素 (calicheamicin)，尤其是加利车霉素Y II和加利车霉素ω Il (参见例如Agnew，Chem. Intl. Ed. Engl. 33 183-186 (1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括 dynemicin A ； 埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin), 氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素 C(cactinomycin) > carabicin、洋红霄素(carminomycin) ^^ ^ΜΜ (carzinophilin) 霉素(chromomycin)、方文线菌素D (dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星 (detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin) (包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、 表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霄素(nogalamycin)、撤揽霄素(olivomycin)、培洛霄素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素 (tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、 甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、 6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、 去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂， 诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酉先月安(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ； Hc 利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(印othilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼达明(Ionidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫喊达酉享 (mopidamol) ；二胺硝口丫唆(nitracrine)；喷司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)； 吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(Iosoxantrone) ；2-乙基酰胼(ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ；PSK 多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺方宠错(spirogermanium)； 细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone) ；2,2 ‘，2〃 -三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin) Α、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛 (vindesine) ( ELDISINE , FILDESIN )；达卡巴嗪(dacartazine)；甘露醇氮芥 (mannomustine) ；二漠甘露酉享(mitobronitol) ；二漠卫矛酉享(mitolactol)；喊泊漠烧 (pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C")；塞替派(thiotepa)； 类紫杉醇(taxoids)，例如 TAXOL 紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、ABRAXANE 不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒齐U 型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)禾口 TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)； 苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine) ( GEMZAR ); 6-硫鸟嘌呤 (thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；钼类似物，诸如顺钼(cisplatin)和卡钼(carboplatin)；长春碱(vinblastine) ( VELBAN );钼；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine) ( ONCOVIN );奥沙利钼(oxaliplatin)；亚叶酸(Ieucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine) ( NAVELBINE )；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)； 道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine) (XELODA );任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX (奥沙利钼(EL0XATIN )联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。别的化疗剂包括可用作抗体药物偶联物的细胞毒剂，诸如美登木生物碱(例如 DMl)和 auristatin (例如 MMAE 和 MMAF)。 “化疗剂”还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、EVISTA 雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮 (onapristone)和FARESTON 托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH) 激动剂，诸如LUPRON 和ELIGARD 醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林 (triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide) 和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4 (5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate)、AROMASIN 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、 法倔唑(fadrozole)、RIVISOR 伏罗唑(vorozole)、FEMARA 来曲唑(Ietrozole) 和ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如 BONEFOS 或OSTAC )、 DIDROCAL 依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、ZOMETA 唑来膦酸 / 唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、FOSAMAX 阿伦膦酸盐(alendronate)、 AREDIA 帕米膦酸盐(pamidronate)、SKELID 替鲁膦酸盐(tiludronate)或 ACTONEL 利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine) (1，3- 二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如I3KC-Ci、Raf, H-Ras和表皮生长因子受体 (EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE 疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；LURTOTECAN 拓扑异构酶1抑制剂； ABARELIX rmRH ；lapatinib ditosylate (ErbB-2 和 EGFR 双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞生长和/或增殖的化合物或组合物。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导Gl停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶 II抑制剂诸如蒽环类抗生素多柔比星(doxorubicin) ((8S-顺式)_10_[ (3-氨基-2，3， 6-三脱氧-α -L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢_6，8，11-三羟基_8_(羟基乙酰基)-1-甲氧基 _5，12-萘二酮，BP (8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-a -L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetra hydro-6,8,1l-trihydroxy-8-(hydr oxyacetyl) -l-methoxy-5,12-naphthacenedione)、表柔比星(epirubicin)、柔红霄素 (daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞Gl的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、 达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺钼(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara_C。更多信息可参见《The Molecular Basis of Cancer)), Mendelsohn 禾口 Israel 编，第 1 章，题 % "Cell cycle regulation, oncogenes, and antieioplastic drugs", Murakaini 等人’ WB Saunders, !Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛 (docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE , Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL , Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。 紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。如本文中所使用的，术语“患者”指想要治疗的任何单一动物，更优选哺乳动物 (包括非人动物，诸如例如犬、猫、马、家兔、动物园动物、牛、猪、绵羊、和非人灵长类)。最优选的是，本文中的患者是人。“受试者”在本文中指任何单一人类受试者，包括适于接受治疗的患者，他正经受或者已经经受血管发生性病症的一种或多种体征、症状、或其它指标。意图包括作为受试者的是参与临床研究试验且未显示疾病的任何临床体征的任何受试者，或参与流行病学研究的受试者，或曾经用作对照的受试者。所述受试者可以先前用VEGF拮抗剂治疗过，或者没有这样治疗过。受试者可以是在开始本文中的治疗时未用过所用第二药物的，即该受试者在“基线”(即在本文中治疗方法中施用第一剂拮抗剂之前的一个设定点，诸如开始治疗之前筛选受试者的日子)时可以没有用例如抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂治疗过。这样的“未接触(药物)”受试者一般认为是用所述第二药物进行治疗的候选人。表述“有效量”指药物有效治疗血管发生性病症的量。术语“药物配制剂”指其形式容许药物的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的无菌制备物。“无菌”配制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品或药物的商业包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗用产品或药物应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品联合的其它治疗用产品和/或警告等的信息。“试剂盒”指包含至少一种试剂(例如用于治疗血管发生性病症的药物，或用于特异性检测本发明的生物标志物基因或蛋白的探针)的任何制品(例如包装或容器)。所述制品优选以用于实施本发明方法的单位来宣传、分发、或销售。就对药物没有响应而言，因先前的或当前的一种或多种药物的治疗而经历“临床上不可接受的高水平毒性”的受试者经历一种或多种与该药物有关的、有经验的临床医师认为是重大的负面的副作用或不良事件，诸如例如严重感染、充血性心力衰竭、脱髓鞘(引起多发性硬化)、显著的超敏感性、神经病理性事件、高度的自身免疫、癌症(诸如子宫内膜癌、非何杰金氏淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、或黑素瘤)、结核病(TB)、等。“降低负面的副作用的风险”指将源自本文中拮抗剂治疗的副作用的风险降低至比源自用先前施用的药物治疗同一患者或另一患者所观察到的风险要低的程度。此类副作用包括上文关于毒性所列出的副作用，而且优选是感染、癌症、心力衰竭、或脱髓鞘。“关联”或“联系”指以任何方式将第一分析或方案的表现和/或结果与第二分析或方案的表现和/或结果进行比较。例如，可以将第一分析或方案的结果用于实施第二分析或方案，和/或，可以使用第一分析或方案的结果来决定是否应当实施第二分析或方案。就本发明的各个实施方案而言，可以使用分析性测定法的结果来决定是否应当实施使用VEGF 拮抗剂，诸如抗VEGF抗体的特定治疗方案。在本文中使用时，词语“标记物”指直接地或间接地偶联或融合至诸如核酸探针或抗体等试剂且便于检测与其偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。该术语意图涵盖通过将可检测物质偶联(即物理连接)至探针或抗体进行的对探针或抗体的直接标记，以及通过与直接标记的另一试剂的反应性而进行的对探针或抗体的间接标记。间接标记的例子包括用荧光标记的二抗检测一抗，和用生物素末端标记DNA探针使得它能用荧光标记的链霉亲合素来检测。术语“表达的水平”或“表达水平”可互换使用，一般指生物学样品中多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此，依照本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的、翻译得到的蛋白质的、或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自蛋白质的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(像mRNA)、然后翻译成蛋白质的基因，还有转录成RNA但不翻译成蛋白质的基因(例如转运RNA或核糖体RNA)。如本文中所使用的，术语“协变量”指与患者有关的某些变量或信息。常常在消退模型中考虑临床终点，其中终点代表因变量，而生物标志物代表主要或目标自变量(回归量)。如果考虑来自临床数据池的其它变量，那么将它们表示为(临床)协变量。术语“临床协变量”本文中用于描述关于患者的所有临床信息，这一般在基线是可得的。这些临床协变量包括人口统计信息(像性别、年龄、等)、其它病历(anamnestic)信息、并发的疾病、伴随的疗法、体检的结果、得到的公同实验室参数、血管发生性病症的已知特性、临床疾病分期、预治疗的时机和结果、疾病史、以及可能与对治疗的临床响应有关的所有类似信息。如本文中所使用的，术语“原始分析”(raw analysis)或“未调整的分析”(unadjusted analysis)指如下的回归分析，其中在所考虑的生物标志物之外，在该回归模型中不使用别的临床协变量，无论是作为独立因素还是作为分层协变量(stratifying covariate)0如本文中所使用的，术语“经过协变量调整的”指如下的回归分析，其中在所考虑的生物标志物之外，在该回归模型中使用别的临床协变量，或是作为独立因素或是作为分
层协变量。如本文中所使用的，术语“单变量(univariate)”指如下的回归模型或图示法，其中作为自变量，只有一项目标生物标志物是该模型的一部分。可以在有和没有别的临床协变量的情况中考虑这些单变量模型。如本文中所使用的，术语“多变量”指如下的回归模型或图示法，其中作为自变量， 超过一项目标生物标志物是该模型的一部分。可以在有和没有别的临床协变量的情况中考虑这些多变量模型。III.鉴定响应VEGF拮抗剂的患者的方法本发明提供一种用于鉴定和/或监测有可能响应VEGF拮抗剂疗法的患者的方法。该方法格外可用于提高对患者施用VEGF拮抗剂会有效的可能性。该方法包括检测来自患者的生物学样品中一种或多种遗传生物标志物的表达，其中一种或多种此类生物标志物的表达指示该患者是否会对VEGF拮抗剂诸如抗VEGF抗体敏感或响应。更具体地，来自患者的样品中至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59种表1_3任一所列基因的表达可用于监测该患者是否会对VEGF拮抗剂响应或敏感。在一些实施方案中，选自下组的至少一种基因的表达可用于监测患者是否会对VEGF拮抗剂响应或敏感ABCC9 ；AFAPILl ；⑶93 ；CTLA2A ；CTLA2B ； CNTNAP2 ；C0L18A1 ；C0L4A1 ；C0L4A2 ；EGFL7 ；ELTDl ；ESMl ；FAM38B ；FAM167B ；GIMAPl ； GIMAP5 ；GIMAP6 ；GNGll ；GPRl 16 ；HBB ；ICAM2 ；KCNE3 ；KDR ；MCAM ；MEST ；MMRN2 ；MYCTl ；MYL9 ； NIDl ；NID2 ；N0S3 ；N0TCH4 ；0LFML2A ；PCDH17 ；PDE6D ；PODXL ；PRND ；RAPGEF3 ；RASGRP3 ； RBP7 ； SPARCL1 ； SPRY4 ； TAGLN ；TMEM88 和 TSPAN18。所公开的方法和测定法提供方便、有效、且潜在划算的手段来获得可用于评估治疗患者的适宜或有效疗法的数据和信息。例如，患者可在VEGF拮抗剂治疗之前和之后提供血液样品，而且可通过多种体外测定法来检查样品以确定患者的细胞是否会对治疗剂(其为VEGF拮抗剂，诸如抗VEGF抗体)敏感。本发明提供用于监测患者对VEGF拮抗剂的敏感性或响应性的方法。该方法可以多种测定法形式进行，包括检测遗传或蛋白质表达的测定法(诸如PCR和酶免疫测定法) 和检测适宜活性的生物化学测定法。样品中此类生物标志物的表达或存在的确定预示提供样品的患者会对VEGF拮抗剂的生物学效应敏感。本文中申请人的发明在于来自患者的样品中至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、M、55、56、57、58、59、或更多种表1_3任一所列基因表达的降低会与观察到的VEGF 拮抗剂对此类患者的治疗功效有关联。典型地，至少一种基因的表达相对于对照样品(例如在VEGF拮抗剂处理之前自同一患者获得的样品、自一名或多名未用VEGF拮抗剂治疗的无关个体获得的样品或合并样品)中的表达至少约1. 5倍、1，6倍、1，8倍、2倍、3倍、4倍、 5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍的降低或平均log比相对于测量的所有基因的表达水平均值至少约_2、-3、-4、-5、或-6个标准偏差的降低指示患者会对VEGF拮抗剂治疗响应或敏感。在一个发明，本发明提供一种监测具有血管发生性病症的患者是否会响应VEGF 拮抗剂治疗的方法，包括作为生物标志物评估对患者施用至少一剂VEGF拮抗剂之前和之后获得的来自患者的样品中至少一种表1-3任一所列基因(例如ABCC9 ；AFAP1L1 ； CD93 ；CTLA2A ；CTLA2B ；CNTNAP2 ；C0L18A1 ；C0L4A1 ；C0L4A2 ；EGFL7 ；ELTDl ；ESMl ；FAM38B ； FAM267B ；GIMAPl ；GIMAP5 ；GIMAP6 ；GNGll ；GPRl 16 ；HBB ；ICAM2 ；KCNE3 ；KDR ；MCAM ；MEST ； MMRN2；MYCTl ；MYL9；NIDl ；NID2；N0S3；N0TCH4 ；0LFML2A ；PCDH 17 ；PDE6D ；PODXL ；PRND ； RAPGEF3 ；RASGRP3 ；RBP7 ；SPARCL 1 ；SPRY4 ；TAGLN ；TMEM88 和 TSPAN18 中至少一种)的表达。施用至少一剂VEGF拮抗剂之后至少一种表1-3任一所列基因表达的降低指示该患者会响应VEGF拮抗剂治疗。在另一个实施方案中，本发明提供一种监测患者对VEGF拮抗剂的敏感性或响应性的方法。此方法包括自患者样品评估至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、
42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或更多种表1-3 任一所列基因的表达，并预测患者对VEGF拮抗剂的敏感性或响应性，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或更多种表1-3任一所列基因表达的降低与患者对有效VEGF拮抗剂治疗的敏感性或响应性有关联。依照此方法，在施用任何VEGF拮抗剂之前和施用至少一剂VEGF拮抗剂之后自患者获得生物学样品，并进行测定法以评估样品中是否存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或更多种表 1-3 任一所列基因的表达产物。如果 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或更多种表1-3 任一所列基因的表达在施用至少一剂VEGF拮抗剂之后降低的话，确定该患者对VEGF拮抗剂治疗敏感或响应。医学领域(特别是关于诊断测试和治疗剂治疗的应用)技术人员会认识到，生物学系统有些易变，而且并非总是全然可预测的，而且因此许多好的诊断测试或治疗剂偶尔无效。如此，最终由主治内科医师的判断来为患者个体决定最适宜治疗过程，这基于测试结果、患者状况和历史、及他或她自己的经验来做出。例如，甚至会有这样的情况，即使根据来自诊断测试的或来自其它标准的数据，没有预测出患者会对VEGF拮抗剂特别敏感，内科医师也会选择用VEGF拮抗剂来治疗患者，特别是如果所有或大多数其它明显的治疗选项已经失败，或者如果与另一种治疗一起给予时预见有一些协同性。在别的表述的实施方案中，本发明提供一种预测患者对VEGF拮抗剂治疗的敏感性，或预测患者是否会有效响应VEGF拮抗剂治疗的方法，包括评估样品中表达的一种或多种本文中鉴定的遗传生物标志物的水平；并预测患者对VEGF拮抗剂的抑制作用的敏感性， 其中一种或多种这些遗传生物标志物的表达水平与患者有效响应VEGF拮抗剂治疗的高敏感性有关联。本发明进一步提供一种鉴定其表达水平预示特定患者对VEGF拮抗剂的敏感性或响应性的生物标志物的方法，包括(a)测量展示一定范围对VEGF拮抗剂的敏感性的一组细胞中候选生物标志物的表达水平，并(b)鉴定细胞中所述候选生物标志物的表达水平、 血清阳性、或存在与患者对VEGF拮抗剂的敏感性或响应性之间的关联，其中该关联指示所述生物标志物的表达水平、血清阳性、或存在预示患者对VEGF拮抗剂治疗的响应性。在此方法的一个实施方案中，该组细胞是自衍生自患者或实验动物模型的样品制备的一组样品。在另一个实施方案中，该组细胞是小鼠异种移植物中的一组细胞系，其中响应性可以例如通过监测响应性的分子标志物(例如ABCC9 ；AFAP1L1 ；CD93 ；CTLA2A ；CTLA2B ；CNTNAP2 ； C0L18A1 ；C0L4A1 ；C0L4A2 ；EGFL7 ；ELTDl ；ESMl ；FAM38B ；FAM167B ；GIMAPl ；GIMAP5 ； GIMAP6 ；GNGll ；GPRl 16 ；HBB ；ICAM2 ；KCNE3 ；KDR ；MCAM ；MEST ；MMRN2 ；MYCTl ；MYL9 ；NIDl ； NID2 ；N0S3 ；N0TCH4 ；0LFML2A ；PCDH17 ；PDE6D ；PODXL ；PRND ；RAPGEF3 ；RASGRP3 ；RBP7 ； SPARCL1 ；SPRY4 ；TAGLN ；TMEM88 和 TSPAN18 中至少一种)来确定。本发明还提供一种鉴定可用于监测对VEGF拮抗剂的敏感性或响应性的生物标志物的方法，该方法包括(a)测量在对患者施用至少一剂VEGF拮抗剂之前和之后获得的来自具有血管发生性病症的患者的样品中候选生物标志物的水平，其中候选生物标志物表达的降低指示该生物标志物对于VEGF拮抗剂更有效治疗血管发生性病症是诊断性的。在一些实施方案中，生物标志物是遗传的，而且分析其表达。样品可以取自怀疑具有或诊断具有血管发生性病症，因此有可能需要治疗的患者或没有怀疑具有任何病症的正常个体。为了评估标志物表达，可以在本发明的方法中使用患者样品(诸如那些含有细胞的，或由这些细胞生成的蛋白质或核酸)。在本发明的方法中，生物标志物的水平可通过评估样品中标志物的量(例如绝对量或浓度)来确定，优选在含有可检测水平的生物标志物的体液或分泌物中评估的。可用作本发明中样品的体液或分泌物包括例如血液、尿液、唾液、粪便、胸水、淋巴液、痰、腹水、前列腺液、脑脊液(CSF)、或任何其它身体分泌物或其衍生物。词语血液意图包括全血、血浆、血清、或任何血液衍生物。此类体液或分泌物中生物标志物的评估在侵入性取样方法不适宜或不方便的情况中有时可以是优选的。然而，本文中要测试的样品优选血液、滑膜组织、或滑液，最优选血液。上述样品可以是冷冻的、新鲜的、固定的(例如福尔马林固定的)、离心的、和/或包埋的(例如石蜡包埋的)、等。当然，细胞样品可以在评估样品中标志物的量之前进行多种公知的收集后制备和保存技术(例如核酸和/或蛋白质提取、固定、保存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心、等)。同样，活检物也可进行收集后准备和保存技术，例如固定。A.基因表达的检测本文中描述的遗传生物标志物可以使用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以使用Northern、点印迹、或聚合酶链式反应(PCR)分析、阵列杂交、RNA酶保护测定法、或使用商品化的DNA SNP芯片微阵列(包括DNA微阵列snapshot)方便地对来自哺乳动物的组织或细胞样品测定例如来自感兴趣遗传生物标志物的mRNA或DNA。例如，实时-PCR (RT-PCR)测定法(诸如定量PCR测定法)是本领域众所周知的。在本发明的一个例示性实施方案中，用于检测生物学样品中的来自感兴趣遗传生物标志物的mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA ；扩增如此生成的cDNA ；并检测所扩增cDNA 的存在。另外，此类方法可以包括一个或多个如下步骤，其容许测定生物学样品中mRNA的水平(例如通过同时检查“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平)。任选的是，可以测定所扩增靶cDNA的序列。1.核酸的检测在一个具体的实施方案中，表1-3任一所列基因的表达可通过RT-PCR技术来实施。用于PCR的探针可以用可检测标记物标记，诸如例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合物、或酶。此类探针和引物可用于检测样品中表达的表1-3任一所列基因的存在。正如熟练技术人员会理解的，可根据本文中提供的序列制备极其多种不同引物和探针，并有效用于扩增、克隆、和/或检测表达的表1-3任一所列基因的存在和/或水平。其它方法包括通过微阵列技术检验或检测组织或细胞样品中至少一种表1-3 任一所列基因的 mRNA (例如 ABCC9 ；AFAP1L1 ；CD93 ；CTLA2A ；CTLA2B ；CNTNAP2 ；C0L18A1 ； C0L4A1 ；C0L4A2 ；EGFL7 ；ELTDl ；ESMl ；FAM38B ；FAM167B ；GIMAPl ；GIMAP5 ；GIMAP6 ；GNGll ； GPRl 16 ；HBB ；ICAM2 ；KCNE3 ；KDR ；MCAM ；MEST ；MMRN2 ；MYCTl ；MYL9 ；NIDl ；NID2 ；N0S3 ； N0TCH4 ；0LFML2A ；PCDH17 ；PDE6D ；PODXL ；PRND ；RAPGEF3 ；RASGRP3 ； RBP7 ； SPARCL1 ； SPRY4 ； TAGLN ;TMEM88和TSPAN18 mRNA)的方法。使用核酸微阵列，逆转录并标记来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品以生成cDNA探针。然后使探针杂交至在固体支持物上固定化的核酸阵列。该阵列配置成该阵列的每个成员的序列和位置是已知的。例如，可以将有可能在某些疾病状态中表达的基因选集在固体支持物上排列成阵列。经过标记的探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达分析能提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术在一个实验中评估数以千计的基因的mRNA表达序型(参见例如WO 2001/75166)。参见例如U. S. 5，700，637 ； 美国专利 5，445，934 ；和美国专利 5，807, 522 ；Lockart, Nature Biotechnology，14 1675-1680(1996)；及 Cheung et al.，Nature Genetics 21 (Suppl) 15-19 (1999)，关于阵列制作的讨论。另外，可采用利用EP 1753878中记载的微阵列进行的DNA序型分析和检测方法。此方法利用短串联重复(STR)分析和DNA微阵列快速鉴定和区分不同DNA序列。在一个实施方案中，使经过标记的STR靶序列杂交至携带互补探针的DNA微阵列。这些探针长度不同以覆盖可能STR的范围。利用杂交后酶促消化自微阵列表面选择性清除DNA杂合物的带标记物的单链区。根据仍然杂交至微阵列的靶DNA的样式来推导未知靶物中的重复数目。微阵列处理器的一个例子是Affymetrix GENECHIP 系统，其是商品化的且包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作的阵列。可使用本领域技术人员知道的其它系统。在RT-PCR或其它基于PCR的方法以外，用于测定生物标志物水平的其它方法包括蛋白质组学技术，以及个性化遗传序型，这是在分子水平根据患者响应治疗血管发生病症所必需的。本文中的专门化微阵列，例如寡核苷酸微阵列或cDNA微阵列，可包含一种或多种生物标志物，其具有与对一种或多种抗VEGF抗体的敏感性或耐药性有关的表达序型。许多参考文献是可获得的，它们提供了应用上述技术的指导(Kohler et al., Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1980) ；Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Inimunoassays (Elsevier, Amsterdam,1985) ；Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam,1984) ；Hurrel1, Monoclonal Hybridoma Antibodies :Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982) ； R Zola, Monoclonal Antibodies :A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. ,1987))。Northern印迹分析是本领域公知的一种便利的技术，记载于例如 Molecular Cloning, a Laboratory Manual,第 2 版，1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500。用于评估基因和基因产物的状态的典型方案可见于例如Ausubel et al.编，1995，Current Protocols In Molecular Biology,单元 2 (Northern 印迹)、单元 4 (Southern ￡口迹)、单元 15(免疫印迹)和单元18 (PCR分析)。2.蛋白质的检测为了检测蛋白质生物标志物，诸如 ABCC9 ；AFAP1L1 ；CD93 ；CTLA2A ；CTLA2B ； CNTNAP2 ；C0L18A1 ；C0L4A1 ；C0L4A2 ；EGFL7 ；ELTDl ；ESMl ；FAM38B；FAM167B ；GIMAPl ； GIMAP5 ；GIMAP6 ；GNGll ；GPRl 16 ；HBB ； ICAM2 ；KCNE3 ；KDR ；MCAM ；MEST ；MMRN2 ；MYCTl ；MYL9 ； NIDl ；NID2 ；N0S3 ；N0TCH4 ；0LFML2A ；PCDH17 ；PDE6D ；PODXL ；PRND ；RAPGEF3 ；RASGRP3 ； RBP7 ；SPARCL1 ；SPRY4 ；TAGLN ；TMEM88和TSPAN18中至少一种，例如各种蛋白质测定法是可获得的。例如，可以使样品在足以形成抗体-生物标志物复合物的条件下接触对所述生物标志物特异性的抗体，然后检测所述复合物。蛋白质生物标志物的存在可以以许多方式来实现，诸如通过用于测定多种组织和样品(包括血浆或血清)的Western印迹(含或不含免疫沉淀)、2维SDS-PAGE、免疫沉淀、荧光激活细胞分拣(FACS)、流式细胞术、和 ELISA规程。使用此类测定法形式的一系列免疫测定技术是可获得的，参见例如美国专利 No. 4，016，043,4, 424，279及4，018，653。这些包括非竞争类型的单个位点和两个位点或 “三明治”/ “夹心式”测定法，以及传统的竞争性结合测定法二者。这些测定法也包括经标记抗体对靶生物标志物的直接结合。三明治测定法是最有用且最常用的测定法之一。三明治测定技术存在许多变化形式，本发明意图涵盖所有的变化形式。简言之，在一种典型的正向测定法(forward assay)中，将未标记的抗体固定化于固体基片上，并使待检测的样品与所结合分子接触。温育合适的一段时间后，即足以容许抗体-抗原复合体形成的一段时间，然后添加经能够产生可检测信号的报道分子标记的、对所述抗原特异性的第二抗体，并温育，容许足以形成抗体-抗原-经标记抗体的另一种复合体的时间。洗掉任何未反应的物质，并通过观察由所述报道分子所产生的信号来测定所述抗原的存在。结果可以是定性的(通过对可视信号的简单观察进行)，或者可以是定量的(通过与含有已知量生物标志物的对照样品比较来进行)。正向测定法上的变化包括同时测定法(simultaneous assay)，其中同时将样品和经标记的抗体两者添加至所结合的抗体。这些技术对本领域技术人员是公知的，包括会容易明白的任何微小变化。在一种典型的正向三明治测定法中，将具有对所述生物标志物特异性的第一抗体或是共价地或是被动地结合至固体表面。典型地，所述固体表面是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以采用试管、珠、微量板盘的形式，或者适于进行免疫测定法的任何其它表面。结合方法是本领域公知的，并且一般包括交联、共价结合、或物理吸附，清洗聚合物-抗体复合体以为测试样品做好准备。然后将测试样品的等分试样添加至固相复合体，并在合适的条件(例如从室温至40°C，诸如包括端点在内的25°C和32°C之间)下培养足够的一段时间 (例如2-40分钟或者过夜，如果更方便的话)，所述条件和时间适于或足以容许存在于抗体中的任何亚单位的结合。温育期后，清洗抗体亚单位固相，干燥，并与对生物标志物一部分特异性的第二抗体一起温育。所述第二抗体连接有用于指示第二抗体对分子标志物结合的报道分子。一种备选的方法包括将样品中的靶生物标志物固定化，然后使固定化的靶物暴露于特异性抗体，该特异性抗体可以是或不是经报道分子标记的。根据靶物的量和报道分子信号的强度，可以通过用所述抗体直接标记，使所结合的靶物变成可检测的。或者，使对第一抗体特异性的经标记第二抗体暴露于靶物-第一抗体复合体以形成靶物-第一抗体-第二抗体三元复合体。通过报道分子所发出的信号检测所述复合体。“报道分子”在用于本说明书时指通过其化学性质提供分析上可鉴定的信号的分子，所述信号容许结合至抗原的抗体的检测。这种类型的测定法中最常用的报道分子是酶、荧光团、或含发射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。在酶免疫测定法的情况中，酶是偶联至第二抗体的，一般藉戊二醛或高碘酸盐进行。然而，会容易认可的是，存在极其多种不同的偶联技术，它们对技术人员是轻易可获得的。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶、和碱性磷酸酶等。一般选择与特定酶一起使用的底物以在相应酶的水解作用后产生可检测的颜色变化。合适酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可能采用产生荧光产物的荧光底物而不是上文所记录的显色底物。在所有情况中，将酶标记的抗体添加至第一抗体-分子标志物复合体，容许结合，然后洗掉过量的试剂。然后将含有合适底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体复合体。底物会与连接至第二抗体的酶起反应，给出定性的视觉信号，其可以被进一步地定量 (通常通过分光光度法)以给出存在于样品中的生物标志量的指标。或者，荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)可以以化学方法偶联至抗体，而不改变所述抗体的结合能力。通过使用特定波长的光线光照来激发时，荧光染料标记的抗体吸收光能，在分子中诱导激发态，接着发出光线，其特征性颜色是用光学显微镜在视觉上可检测的。如在EIA中那样，容许荧光标记的抗体结合至第一抗体-分子标志物复合体。洗掉未结合的试剂后，然后使剩余的三元复合体暴露于适当波长的光线，观察到的荧光表明感兴趣的分子标志物的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中都是非常完善建立的。然而，还可以采用其它报道分子，诸如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。B.试剂盒为了用于检测生物标志物，本发明提供了试剂盒或制品。此类试剂盒可用于确定患有血管发生性病症的受试者是否会对VEGF拮抗剂产生有效响应。这些试剂盒可包括装载装置，装载装置被分成小格以接纳紧密排列的一个或多个容器，诸如管形瓶、管等，每个容器装有本发明方法中要使用的不同成分之一。例如，所述容器之一可以装有可检测标记的或可以可检测标记的探针。此类探针可以是本发明的抗体。此类探针可以是分别对蛋白质或信使(message)特异性的抗体或多核苷酸。若试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸，则试剂盒还可具有装有用于扩增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或装有报告手段(诸如结合至报告分子(诸如酶、荧光、或放射性同位素标记物的生物素结合蛋白，例如亲合素或链霉亲合素)的容器。此类试剂盒通常会包括上文所述容器和一个或多个其它容器，其中装有从商业和使用者观点看有需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使用说明的包装插页。容器上可存在标签，以指示该组合物用于具体的应用，而且还可指示体内或体外使用的说明，诸如上文所描述的那些。本发明的试剂盒有许多实施方案。一个典型的实施方案是一种试剂盒，包括容器、 所述容器上的标签、和装在所述容器内的组合物，其中所述组合物包括结合蛋白质或自身抗体生物标志物的一抗，而且所述容器上的标签指示该组合物可用于评估样品中此类蛋白质或抗体的存在情况，且其中所述试剂盒包括说明书，其关于使用该抗体来评估特定样品类型中生物标志物蛋白质的存在情况。所述试剂盒可进一步包括一套用于制备样品并将抗体应用于样品的说明书和材料。所述试剂盒可以包括一抗(primary antibody)和二抗 (secondary antibody) 二者，其中所述二抗偶联有标记物，例如酶标记物。另一个实施方案是一种试剂盒，包括容器、所述容器上的标签、和装在所述容器内的组合物，其中所述组合物包括一种或多种在严格条件下与表1-3任一所列生物标志物的互补物发生杂交的多核苷酸，而所述容器上的标签指示该组合物可用于评估样品中表1-3 任一所列生物标志物的存在情况，且其中所述试剂盒包括说明书，其关于使用该多核苷酸来评估特定样品类型中生物标志物RNA或DNA的存在情况。试剂盒中的其它任选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、清洗缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂(诸如可以被酶标记物化学改变的底物，例如色原)、表位修复液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照载玻片等。试剂盒还可包括用于解释使用该试剂盒获得的结果的说明。在又一个具体的实施方案中，对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可包括例如 (1)第一抗体(例如附着至固体支持物的)，其结合生物标志物蛋白；和任选的(2)不同的第二抗体，其结合所述蛋白质或所述第一抗体且偶联有可检测标记物。对于基于寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒可包括例如(1)寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸，其与编码生物标志物蛋白的核酸序列发生杂交，或( 一对引物，其可用于扩增生物标志物核酸分子。所述试剂盒还可包括例如缓冲剂、防腐剂、和蛋白质稳定剂。 所述试剂盒可进一步包括检测可检测标记物所必需的成分(例如酶或底物)。所述试剂盒还可包括对照样品或一系列对照样品，其能被测定并与测试样品进行比较。所述试剂盒的每种成分可以封装在单独的容器内，而各个容器都可与说明书(用于解释使用该试剂盒实施的测定的结果)一起在单个包装内。C.统计学如本文中所使用的，一般形式的预测规则存在于一种或多种生物标志物的函数的说明中，其可能包括临床协变量以预测响应或不响应，或更一般地，预测有益或无益(就适当定义地临床终点而言)。最简单形式的预测规则由没有协变量的单变量模型组成，其中通过截留值或阈值的手段来确定预测结果。这可以表述成特定截留值c和生物标志物度量χ的Heaviside函数，若要做出二元预测A或B，则若H(x-c) = 0，则预示 A。若H(x-c) = 1，则预示 B。这是在预测规则中使用单变量生物标志物度量的最简单方式。如果这样一种简单规则就足够了，那么它容许简单鉴定效果的方向，即高的还是低的表达水平对患者有利。如果需要考虑临床协变量，和/或，如果多变量预测规则中使用多种生物标志物， 那么情况会更加复杂。下面的两个假设例阐述了所涉及的问题协变量修正(假设例)对于生物标志物X，在一个临床实验群体中发现高表达水平与较差的临床响应有关(单变量分析)。一项更周密的分析显示该群体中有两种类型的临床响应者，其中第一组拥有比第二组差的响应，而且同时第一组的该生物标志物表达一般在施用至少一剂VEGF 拮抗剂之后较高。一项修正协变量分析揭示对于每一个组，临床受益与临床响应之间的关系被反转了，即在各组内，较低的表达水平与较高的临床响应有关。整体相反效果被协变量 RA类型所掩盖-而且协变量修正分析，作为预测规则的一部分，反转了方向。多变量预测 (假设例)对于生物标志物X，在一个临床实验群体中发现高表达水平与较差的临床响应微弱有关(单变量分析)。对于第二生物标志物Y，通过单变量分析进行了类似的观察。X与 Y的组合揭示了，若这两种生物标志物都低，则看到好的临床响应。这使得规则在这两种生物标志物都低于一些截留值时预示受益(和-Heaviside预测函数的联系)。对于组合规则，一条简单的规则不再以单变量意义适用；例如，具有低的X表达水平不会自动地预示较好的临床响应。这些简单的例子显示了，不能根据每一种生物标志物的单变量水平来判断具有和没有协变量的预测规则。多种生物标志物的组合加上由协变量进行的潜在判断不容许给单一生物标志物指派简单关系。因为可以在可能包括其它临床协变量的多标志物预测模型中使用多种标志物基因(特别是血清中的)，所以不能以简单方式确定此类模型内单一标志物基因的有益效果的方向，而且可能与单变量分析中找到的方向矛盾，即关于单标志物基因描述的情况。临床医师可使用本领域已知的数种方法之任一来测量VEGF拮抗剂的特定剂量方案的功效。例如，可使用体内成像(例如MRI)来测定肿瘤大小及鉴定任何转移以确定对该疗法的相对有效响应性。可调整剂量方案来提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可施用一剂，可以在一段时间里施用多个分剂，或者可以根据治疗情况的紧急事件成比例地降低或提高剂量。根据诸如具体拮抗剂类型等因素，具有本领域普通技术的内科医师能容易地确定所需要的药物组合物的有效量和开出这样的处方。例如，内科医师可以以多剂此类拮抗剂 (诸如抗VEGF抗体)开始，其在药物组合物中以低于实现期望的治疗效果所需要的水平的水平使用，并逐渐提高剂量，直至实现期望的效果。拮抗剂的给定剂量或治疗方案的功效可通过例如使用标准功效度量评估患者中的体征和症状来测定。在又一个实施方案中，至少两次用相同的拮抗剂，诸如抗VEGF抗体治疗受试者。 如此，第一次和第二次拮抗剂暴露优选用相同的拮抗剂，更优选所有拮抗剂暴露用相同的拮抗剂，即头两次暴露、优选所有暴露的处理用一种类型的VEGF拮抗剂，例如结合VEGF的拮抗剂，诸如抗VEGF抗体，例如都用贝伐单抗。在本文中所列出的所有本发明方法中，所述拮抗剂(诸如结合VEGF的抗体)可以是未偶联的，诸如裸抗体，或者可以是为了进一步的功效(诸如例如延长半衰期)而偶联有另一分子的。本文中优选的拮抗性抗体是嵌合、人源化、或人抗体，更优选抗VEGF抗体，最优选贝伐单抗。在另一个实施方案中，VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体)是对受试者施用的唯一药物。在一个实施方案中，拮抗剂是抗VEGF抗体，以每1、2、3、或4周约100或400mg的剂量施用或者以每1、2、3、或4周约1、3、5、10、15、或20mg/kg的剂量施用。剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2或3剂)施用，诸如输注。在又一个方面，在诊断步骤之后，本发明提供了确定是否要继续给具有血管发生性病症的受试者施用VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体)的方法，包括使用成像技术诸如放射照相术和/或MRI测量第一次施用拮抗剂之后肿瘤尺寸的缩小，使用成像技术诸如放射照相术和/或MRI测量第二次施用拮抗剂之后受试者肿瘤尺寸的缩小，比较第一次和第二次时受试者的成像发现，如果第二次的得分比第一次少，那么继续施用所述拮抗剂。在又一个实施方案中，治疗方法包括检验给药步骤之后受试者对治疗的响应的步骤，用于确定该响应水平对于治疗血管发生性病症是否有效。例如，包括检验给药之后的成像(放射照相术和/或MRI)得分并与给药以前获得的基线成像结果比较的步骤，用于通过测量是否发生变化和变化了多少来确定治疗是否有效。此检验可以在给药之后以多种有安排的或未安排的时间间隔重复，用于确定任何部分或完全消退的维持。或者，本文中的方法包括在给药前检验受试者的步骤，用于了解是否存在血管发生性病症的一种或多种生物标志物或症状，如上文所列。在本发明的一个实施方案，在VEGF拮抗剂以外没有给受试者施用其它药物来治疗血管发生性病症。在本文中的任何方法中，VEGF拮抗剂可以与有效量的第二药物(其中VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体)是第一药物)组合施用。合适的第二药物包括例如抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、或其组合。
所有这些第二药物可以彼此组合或者与第一药物一起使用，因此表述“第二药物，， 在用于本文时不意味着它是第一药物以外的唯一药物。如此，第二药物不必是一种药物，而是可以包含超过一种上述药物。本文所列的这些第二药物通常以与上文所用相同的剂量和施用途径或者迄今所用剂量的大约1-99%使用。如果确实使用此类第二药物，那么优选它们以低于不存在第一药物时的量使用，尤其是在第一药物的初始服药之后的后续给药中，以便消除或降低由此引起的副作用。对于本文所述复治(re-treatment)方法，其中第二药物以有效量与拮抗剂暴露 (exposure) 一起施用，它可以与任何暴露一起施用，例如，只与一次暴露或者与超过一次暴露一起施用。在一个实施方案中，第二药物与初始暴露一起施用。在另一个实施方案中，第二药物与初始和第二暴露一起施用。在又一个实施方案中，第二药物与所有暴露一起施用。 优选的是，在初始暴露(诸如类固醇的)之后，降低或清除此类第二药物的量以减少受试者对具有副作用的药剂诸如泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、和环磷酰胺的暴露。第二药物的联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用(同时施用)，以及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有(两种或更多种)活性剂 (药物)同时发挥其生物学活性。本文中的拮抗剂以任何合适手段施用，包括胃肠外、表面、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内(i. v.)、动脉内、腹膜内或皮下施用。 还涵盖鞘内施用。另外，还可合适地通过脉冲输注来施用拮抗剂，例如用剂量逐渐减少的拮抗剂。优选的是，通过静脉内或皮下，更优选通过静脉内输注来给予剂量给药。如果提供多次拮抗剂暴露，那么每次暴露可以使用相同的或不同的施用手段来提供。在一个实施方案中，每次暴露通过静脉内施用。在另一个实施方案中，每次暴露通过皮下施用给予。在又一个实施方案中，所述暴露通过静脉内和皮下施用二者给予。在一个实施方案中，以缓慢的静脉内输注而非静脉内推注或快速注射来施用拮抗剂诸如抗VEGF抗体。例如，在抗VEGF抗体的任何输注之前约30分钟施用类固醇诸如泼尼松龙或甲泼尼龙(例如静脉内约80-120毫克，更具体静脉内约100毫克)。所述抗VEGF抗体是通过例如专用线路输注的。对于多剂抗VEGF抗体暴露的初始剂，或者对于所述暴露只包括一剂的单剂，此类输注优选以约50毫克/小时的速率开始。这可逐步提高，例如，每约30分钟速率提高约50 毫克/小时直至约400毫克/小时的最大值。然而，如果受试者正发生输注相关反应，那么输注速率优选降低至例如当前速率的一半，例如从100毫克/小时降低至50毫克/小时。 优选的是，抗VEGF抗体此类剂(例如约1000毫克总剂量)的输注用约255分钟G小时15 分钟)完成。任选的是，受试者在开始输注前大约30至60分钟通过口接受醋氨酚/对乙酰氨基酚(例如约1克)和盐酸苯海拉明(diphenhydramine HCl)(例如约50毫克或相似药剂的等效剂量)的预防性处理。如果给予超过一次的抗VEGF抗体输注(剂)以完成整个暴露，那么优选在此输注实施方案中以高于初始输注的速率开始第二或随后的抗VEGF抗体输注，例如约100毫克/ 小时。此速率可以逐步提高，例如每约30分钟速率提高约100毫克/小时直至约400毫克 /小时的最大值。发生输注相关反应的受试者优选将输注速率降低至该速率的一半，例如从100毫克/小时降低至50毫克/小时。优选的是，此类第二剂或随后剂的抗VEGF抗体 (例如约1000毫克总剂量)的输注用约195分钟(3小时15分钟)完成。在一个优选的实施方案中，拮抗剂是抗VEGF抗体，而且以约0. 4至4克的剂量施用，而且更优选的是，抗体以约0. 4至1. 3克的剂量、约1个月的时段内1至4剂的频率施用。还更优选的是，剂量是约500mg至1. 2g，而且在其它实施方案中，是约750mg至1. Igo 在此类方面，拮抗剂优选以2至3剂施用，和/或在约2至3周的时段内施用。在一个实施方案中，受试者先前从未施用用于治疗血管发生性病症的任何药物。 在另一个实施方案中，受试者或患者先前曾经施用用于治疗血管发生性病症的一种或多种药物。在又一个实施方案中，受试者或患者对先前施用的一种或多种药物没有响应。受试者对其可没有响应的此类药物包括例如抗肿瘤剂、化疗剂、细胞毒剂、和/或生长抑制剂。更具体的说，受试者对其可没有响应的药物包括VEGF拮抗剂(诸如抗VEGF抗体)。在又一个方面，此类拮抗剂包括抗体或免疫粘附素，使得复治涵盖受试者以前对其没有响应的、本发明的一种或多种抗体或免疫粘附素。IV.拮抗剂治疗一旦鉴定出对拮抗剂治疗最响应或敏感的患者群，用本文中的拮抗剂单独地或与其它药物联合地进行处理导致对血管发生性病症的改善。例如，此类治疗可导致肿瘤尺寸缩小或无进展存活延长。此外，用本文中的拮抗剂与至少一种第二药物的组合进行的治疗优选导致对患者产生累加的、更优选协同的(或大于累加的)治疗受益。优选的是，在此组合方法中，第二药物的至少一次施用与本文中的拮抗剂的至少一次施用之间的时间安排是大约一个月或更短、更优选大约两周或更短。医学领域技术人员会领会，在诊断得出患者有可能对拮抗剂有响应后对所述患者施用治疗有效量的VEGF拮抗剂的确切方式由主治医师判断。施用的模式包括剂量、与其它药剂的组合、施用的时间安排和频率、等等，可受到患者有可能对此类拮抗剂有响应的诊断以及患者的状况和历史的影响。如此，甚至预测对拮抗剂相对不敏感的诊断有血管发生性病症的患者仍可受益于其治疗，特别是在与其它药剂(包括可改变患者对拮抗剂的响应性的药剂)的组合中。会以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用包含本发明拮抗剂的组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的血管发生性病症的具体类型、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、血管发生性病症的起因、投递药剂的部位、可能的副作用、拮抗剂的类型、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。要施用的拮抗剂的有效量会取决于此类考量。作为一般提议，胃肠外施用的拮抗剂的每剂(per dose)有效量会在约20mg至约 5000mg的范围里，通过一个或多个剂量(one or more dosages)来实现。用于抗体(诸如抗VEGF抗体)的例示性剂量方案包括每1、2、3、或4周100或400mg，或者每1、2、3、或4 周施用约1、3、5、10、15、或20mg/kg的一剂。该剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2或3 剂)施用，诸如输注。然而，如上面指出的，对于拮抗剂的这些建议量要加以诸多治疗上的考量。在选择合适剂量和进度安排中，关键的因素是所得的结果，如上文提示的。在一些实施方案中，尽可能接近血管发生性病症的首次体征、诊断、表现或出现，施用拮抗剂。
拮抗剂以任何合适手段施用，包括胃肠外、表面、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。还涵盖鞘内施用。另外，可合适地通过脉冲输注来施用拮抗剂，例如用剂量逐渐减少的拮抗剂。最优选地， 通过静脉内注射来给予剂量给药。可以与本文中的拮抗剂一起施用如上所述的第二药物。联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用，以及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有(两种或更多种)活性剂同时发挥其生物学活性。除了通过上文所述传统路径将拮抗剂施用于患者，本发明涵盖通过基因疗法进行的施用。编码拮抗剂的核酸的此类施用涵盖在表述“施用有效量的拮抗剂”中。可参见例如TO 1996/07321，其关注使用基因疗法来产生胞内抗体。主要有两种方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内(in vivo) 和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要拮抗剂的部位将核酸直接注射入患者。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞直接施用于患者，或是例如装入多孔膜再植入患者(参见例如美国专利No. 4，892，538和5，283，187)。 有多种技术可用于将核酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至目的宿主的体外培养的细胞还是体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(例如，可用于脂质介导的基因转移的脂质有D0TMA、 DOPE和DC-Chol)进行转染。在有些情况中希望与对靶细胞特异性的药剂一起提供核酸来源，诸如对靶细胞上的细胞表面膜蛋白特异性的抗体、针对靶细胞上受体的配体等。若采用脂质体，则可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、和靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术记载于例如 Wu et al.，J. Biol. Chem. 262 :4429-4432(1987)和 Wagner et al.，PNAS USA 87 3410-3414(1990)。基因标记和基因治疗方案记载于例如Anderson et al. ,Science 256 808-813(1992)和 WO 1993/25673。可以将VEGF拮抗剂与至少一种别的具有抗癌特性的化合物在药物组合配制剂中组合或作为组合疗法以给药方案组合。所述药物组合配制剂或给药方案中的至少一种别的化合物优选具有对VEGF拮抗剂组合物的补充活性，使得它们彼此不会产生不利影响。所述至少一种别的化合物可以为化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、及其组合。此类分子以对指定目的有效的量适当地组合存在。含有VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体)的药物组合物还可以包含治疗有效量的抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、或其组合。一方面，所述第一化合物是抗VEGF抗体，而且所述至少一种别的化合物是抗VEGF 抗体以外的治疗性抗体。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是结合癌细胞表面标志物的抗体。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗HER2抗体，曲妥单抗(例如Herceptin ,Genentech，Inc.，South San Francisco, CA)。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗 HER2 抗体，pertuzumab(Omnitarg ，Genentech, Inc.，South San Francisco，CA，参见US6949MO。在一个实施方案中，所述至少一种别的化合物是抗体(裸抗体或ADC)，而且所述别的抗体是第二种、第三种、第四种、第五种、第六种抗体或更多，使得此类第二种、第三种、第四种、第五种、第六种、或更多种抗体(裸的或作为ADC的)的组合有效治疗血管发生性病症。依照本发明的其它治疗方案可包括施用VEGF拮抗剂抗癌剂，而且包括但不限于放射疗法和/或骨髓和外周血移植和/或细胞毒剂、化疗剂或生长抑制剂。在一个这样的实施方案中，化疗剂是以下药剂或药剂组合，诸如例如环磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星、长春新碱(ONCOVIN )、泼尼松龙、CHOP、CVP或C0P，或者免疫治疗剂，诸如抗PSCA、 抗HER2 (例如HERCEPTIN , 0MNITARG )。组合疗法可以作为同时或序贯方案施用。当序贯施用时，可以以两次或更多次施用来施用所述组合。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥其生物学活性。在一个实施方案中，使用抗VEGF抗体的治疗涉及组合施用本文中所鉴定的抗癌剂和一种或多种化疗剂或生长抑制剂，包括共施用不同化疗剂鸡尾酒样混合物。化疗剂包括紫杉烷类(诸如帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))和/或蒽环类抗生素。熟练从业人员可以按照制造商的说明书或凭经验确定地使用此类化疗剂的制备和剂量给药方案。此类化疗剂的制备和剂量给药方案还记载于“Chemotherapy Service", (1992) Μ. C. Perry H, ffilliams&ffilkins, Baltimore, Md。任何上述共施用的药剂的合适剂量就是那些当前使用的剂量，而且可以由于新鉴定的药剂和其它化疗剂或治疗的联合作用(协同作用)而降低。组合疗法可以提供“协同作用”并且证实是“协同性”的，即当一起使用活性组分时所实现的效果大于分开使用所述化合物时所产生的效果之和。当活性组分为如下情况时可以获得协同效应(1)共同配制和施用或在合并的单位剂量配制剂中同时投递；( 作为分开的配制剂交替或平行投递；或C3)通过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在序贯施用或投递所述化合物时，例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般而言，在交替疗法中，序贯地，即依序地施用每种活性组分的有效剂量，而在组合疗法中，一起施用两种或更多活性组分的有效剂量。对于疾病的预防或治疗，所述别的治疗剂的适宜剂量将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用VEGF拮抗剂和别的药剂是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对VEGF拮抗剂和别的药剂的响应、及主治医师的判断。合适的是，一次性或通过一系列治疗将VEGF拮抗剂和别的药剂施用于患者。VEGF拮抗剂通常如上文所述施用。根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约 20mg/m2至600mg/m2别的药剂，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约20mg/m2、85mg/m2、90mg/m2、125mg/m2、200mg/m2、 400mg/m2、500mg/m2或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。如此，可对患者施用约20mg/m2、85mg/m2、90mg/m2、125mg/m2、200mg/ m2、400mg/m2、500mg/m2、600mg/m2(或其任意组合)的一剂或多剂。这些剂量可间歇施用，例如每周或每两、三、四、五、或六周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂别的药剂)。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。V.药物配制剂依照本发明使用的拮抗剂的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的拮抗剂与任选的药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干配制剂或水溶液的形式制备供贮存。关于配制剂的一般信息参见例如Gilman et al. , (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed. , Pergamon Press ；A. Gennaro(ed.), Remington ' s Pharmaceutical Sciences,18th Edition, (1990), Mack Publishing Co. , Eastori, Pennsylvania. ；Avis et al. , (eds.) (1993)Pharmaceutical Dosage Forms !Parenteral Medications Dekker, New York ；Lieberman et al. . , (eds. )(1990) Pharmaceutical Dosage Forms Tab lets Dekker,New York ^Lieberman et al. , (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms :Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters(ed. )(2002)Dermatological and Transdermal Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker0可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸 ’防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇； 3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合剂，诸如EDTA ；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENtm、PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG)。例示性的抗VEGF抗体配制剂记载于美国专利No. 6，884，879。在某些实施方案中， 抗VEGF抗体在单次使用管形瓶中以25mg/mL配制。在某些实施方案中，在MOmg α，α-海藻糖二水合物、23. aiig磷酸钠(一碱基的，一水合物)、4. 8mg磷酸钠(二碱基的，无水的)、 1.6mg聚山梨酯20、和注射用水(USP)中配制IOOmg抗VEGF抗体。在某些实施方案中，在 960mg α , α-海藻糖二水合物、92. 8mg磷酸钠(一碱基的，一水合物)、19. 2mg磷酸钠(二碱基的，无水的)、6. ^ig聚山梨酯20、和注射用水(USP)中配制400mg抗VEGF抗体。适于皮下施用的冻干配制剂记载于例如美国专利No. 6，267, 958 (Andya et al.)。 此类冻干配制剂可以用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度，重建的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。还涵盖拮抗剂的结晶形式。参见例如US 2002/0136719A1 (Shenoy et al.)。本文中的配制剂还可含有超过一种活性化合物(上文提到的第二治疗药物)，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。此类治疗药物的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的VEGF拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。优选的此类第二治疗药物如上所述。活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有所述拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No. 3，773，919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸、乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTJ (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D- (-) -3-羟基丁酸。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
实施例提供下述实施例以例示但非限制当前要求保护的发明。统计方法统计任务可包含以下步骤1.候选生物标志物的预选择2.有关临床功效响应预测性协变量的预选择3.单变量水平的生物标志物预测函数的选择4.在单变量水平包括临床协变量的生物标志物预测函数的选择5.多变量水平的生物标志物预测函数的选择6.在多变量水平包括临床协变量的生物标志物预测函数的选择下文详述不同的步骤1 候选生物标志物的预选择。候选生物标志物的统计学预选择的方向指向与临床受益各度量的关联强度。为此目的，可以将不同临床终点变换成推导得出的替代得分，像例如关于TTP的临床受益得分程度的依次指派，避免检查观察(censored observations) 0这些替代变换度量能容易地用于简单相关分析，例如通过非参数Spearman等级相关办法。一种备选方法是使用生物标志物度量作为时间对事件回归模型(像例如Cox比例危害回归)中的计量协变量。取决于生物标志物数值的统计学分布，此步骤可要求一些预加工，像例如变异稳定化变换和使用合适的标尺，或者标准化步骤诸如使用百分点代替原始测量结果。另一个办法是检查双变量散布图，例如通过在单患者基础上显示(X轴=生物标志物数值，y轴=临床受益的度量) 的散布。有些非参数回归线(像通过例如平滑样条(smoothing splines)函数而实现的) 对于显现生物标志物与临床受益的关联是有用的。这些不同办法的目的是显示与所采用的至少一项受益度量中临床受益的一些关联，同时对其它度量的结果不矛盾的生物标志物候选者的预选择。若对照组可得，则生物标志物与不同分支中临床受益的关联的差异可以是差异预测的迹象，使得该生物标志物符合进入进一步考虑的条件。
2 有关临床功效响应预测性协变量的预选择。本文中所定义的临床协变量的统计学预选择与用于预选择生物标志物的办法平行，而且它的方向也指向与临床受益各度量的关联强度。所以，原则上，与上文第1点下考虑的方法相同的方法适用。在统计标准之外，来自临床经验和理论知识的标准可适用于预选择有关临床协变量。临床协变量的预测值可以与生物标志物的预测值相合(interact with)。如果必要，可以考虑它们来改进预测规则。3 单变量水平的生物标志物预测函数的选择。术语“预测函数”以一般意义使用，指生物标志物度量的数值函数，得出经过定标的数值，以暗示目标预测。一个简单例子是特定截留c和生物标志物度量χ的Heaviside选择函数，其中要做出二元预测，即A或B，那么，若H(X-C) = 0，则预测 A。若H(X-C) = 1，则预测 B。这大概是在预测规则中使用单变量生物标志物度量的最常见方式。如上所述“预测函数”的定义包括提到现有的培训数据集(training data set)，其可用于探索预测可能性。可采取不同路径自培训集获得合适的截留C。首先，可使用第1点下提到的带平滑样条的散布图来定义截留。或者，可选择一些分布百分点，例如中值或四分位。也可以通过调查所有可能截留依照它们关于临床受益度量的预测潜力而系统性提取截留。然后，可以将这些结果绘图，以容许手工选择或为实现最佳而采用一些搜索算法。这可使用Cox模型基于某些临床终点认识到，在Cox模型中，在每一个测试截留，使用生物标志物作为二元协变量。然后，可以一起考虑临床终点的结果以选择根据两终点显示预测的截留。选择预测函数的另一种不常用的办法可基于自培训集得到的固定参数Cox回归模型，其中以生物标志物数值(可能是经过转换的)作为协变量。另一种可能性是将决策基于一些似然比(likelihood ratio)(或其单调转换(monotonic transform))，其中目标概率密度是在用于分拆预测状态的培训集中预先确定的。然后，将生物标志物塞入预测标准的一些函数中。4 在单变量水平包括临床协变量的生物标志物预测函数的选择。单变量指只使用一项生物标志物-就临床协变量而言，这可以是多变量模型。这种办法与没有临床协变量的搜索平行，只是此类方法应当容许掺入有关协变量信息。选择截留的散布图法只容许协变量的有限使用，例如二元协变量可以在图内用颜色编码。如果分析依赖于一些回归办法，那么通常有利于协变量的使用(一次多个)。基于上文第3点下描述的Cox模型的截留搜索容许容易地掺入协变量，并由此导致经过协变量调整的单变量截留搜索。通过协变量进行的调整可以像模型中的协变量那样或经由包括在分层分析中来进行。还有，预测函数的其它选项容许掺入多项协变量。这对于作为预测函数的Cox模型选项是直截了当的。这包括评估协变量对交互水平的影响的选项，这意味着例如，对于不同年龄组，适用不同预测标准。对于似然比型预测函数，必须估算预测密度，包括协变量。为此目的，可使用多变量样式识别方法学，或者可通过协变量的多重回归(在密度估计之前)来调整生物标志物数值。CART 技术(分类和回归树，Breiman et al.，ffadsworth, Inc. :New York, 1984) 可用于此目的，采用生物标志物(原始测量水平)加临床协变量并利用临床受益度量作为响应。搜索截留，发现函数的决策树型涉及预测的协变量。CART所选择的截留和算法常常是接近最佳的，而且可以通过考虑不同临床受益度量来组合和统一。5 多变量水平的生物标志物预测函数的选择。若有多项生物标志物候选者在不同的单变量预测函数选项中维持它们的预测潜力，则可通过生物标志物的组合来实现进一步改进，即考虑多变量预测函数。基于简单的Heaviside函数模型，可评估生物标志物组合，例如通过考虑生物标志物数值的双变量散布图，其中指明了最佳的截留。然后可通过逻辑“和”和“或”组合不同Heaviside函数来实现生物标志物的组合，以实现改良的预测。CART技术可用于此目的，采用多项生物标志物(原始测量水平)和临床受益作为响应，以获得生物标志物的截留和决策树型预测函数。CART所选择的截留和算法常常是接近最佳的，而且可以通过考虑不同临床受益度量来组合或统一。可以在不同水平采用Cox回归。第一种方式是以二元方式掺入多项生物标志物 (即基于具有一些截留的Heaviside函数)。另一种选择是(在合适的转换后)以计量方式使用生物标志物或二元与计量办法的混和体。进化多变量预测函数属于上文第3点下描述的Cox型。多变量似然比办法(likelihood ratio approach)难以执行，但是为多变量预测函数呈现了另一个选项。6 在多变量水平包括临床协变量的生物标志物预测函数的选择。若有多项有关临床协变量，则可通过组合多项生物标志物与多项临床协变量来实现进一步的改进。就包括多项临床协变量的可能性而言，评估不同的预测函数选项。基于关于生物标志物的Heaviside函数的简单逻辑组合，可以将别的协变量包括至基于在培训集中得到的逻辑回归模型的预测函数。可以容易地与别的协变量(包括预测算法中的这些)一起使用CART技术和进化决策树(evolving decision tree)。所有基于Cox回归的预测函数可使用别的临床协变量。存在评估协变量对交互水平的影响的选择，这意味着例如，对于不同年龄组，适用不同的预测标准。多变量似然比办法不能直接延伸至别的协变量的使用。实施例1此实施例描述可用于预测患者对VEGF拮抗剂的响应性或敏感性的生物标志物的鉴定。用对照或抗VEGF抗体任一处理后7天自小鼠胰腺癌模型分离肿瘤。此时，观察到预期的较大的对血管表面积的抗VEGF效应。我们实施了微阵列分析来鉴定被抗VEGF处理特异性改变的那些转录物。简言之，使用T7启动子引物和MMLV-RT (Agilent，低RNA输入荧光线性扩增试剂盒，产品#5184-3523)将1 μ g总RNA转变成双链cDNA。cDNA合成后，使用T7RNA聚合酶(其同时掺入花青3或花青5标记的CTP)来合成cRNA。在亲和树脂柱(RNeasy迷你试剂盒，Qiagen)上纯化经标记cRNA。通过测量^Onm处的吸光度及使用260nm处的IOD对应于40 μ g/ml RNA的惯例来测定经标记cRNA的量。通过使用NanoDrop ND-1000分光光度计 (NanoDrop Technologies, Wilmington,DE)(其测量花青3和花青5标记的CTP的吸光度) 测量样品来测定染料的掺入。通过在片段化缓冲液(Agilent原位杂交试剂盒plus，产品 #5184-3568)中于60°C温育30分钟，将750ng花青3标记的通用人参照cRNA (Stratagene， La Jolla, CA，产品#740000)和750ng花青5标记的cRNA片段化。通过添加含有LiCl和月桂基硫酸锂的杂交缓冲液来终止片段化。将样品与Agilent阵列在电热轮转炉中于60°C 杂交18小时。阵列使用SSC缓冲液清洗，并使用乙腈干燥。阵列在Agilent G2505B型扫描仪中扫描。使用 Agilent 特征提取软件(7. 5 版 Agilent Technologies,Palo Alto，CA) 来计算表达信号。微阵列杂交为40，009个探针集(其中37，710个存在于两种处理的所有重复物中)产生数据。该40，009个探针集对应于21，200种基因的转录丰度的测量，其中20，503 种存在于两种条件每一种的所有五份重复物中。为每一个处理组测定每个探针集的均值。 这些均值的比较揭示有很少的转录物因抗VEGF抗体处理而表达有差异。然而，有一小群探针响应实验处理而丰度有显著降低。为了鉴定代表对抗VEGF疗法的最极端响应的探针集，我们分析了抗VEGF和对照抗体处理的肿瘤之间的均值倍数变化差异(具体而言，我们使用每组的log2均值)。我们将这些差异的分布作为Gaussian混合体建模。混合体中的每一个成分分布可对应于三组之一 ·· (a)在抗VEGF之后表达降低的探针集，(b)在抗VEGF疗法之后没有变化的探针集，或 (c)在抗VEGF疗法之后表达升高的探针集。我们对混合体分布的参数的最终估值对应于三个 Gaussian 成分，它们集中于(-0. 46117,0. 03042, -0. 017276)，标准偏差为(0. 77230， 0. 13221,0. 30198)且相对比例为(0. 02638,0. 59943,0. 37419)。我们的签名由那些遵循混合体分布中最左边的Gaussian成分的探针集定义。此分布最左边的尾代表那些在抗VEGF疗法之后表达降低最多的探针集。在此抗VEGF响应签名中的316个探针集中，284个定位于260种HUGO基因，28个不能定位于小鼠中的已知基因，而32个尚未明确定位于HUGO符号。260种HUGO基因的集合被非常高度地富集用于涉及血管发生、血管发育、细胞粘附、细胞运动和分支结构形态发生的GO过程本体论项(GO Process Ontology terms)；涉及胞外基质结构组分、生长因子结合和跨膜受体蛋白酪氨酸激酶的功能本体论项；涉及胞外基质的成分本体论项。这些数据证明抗VEGF处理在某些血管基因中引起平均2. 65倍且至少2. 0倍的特异性且相当恒定的转录下调。另外，对肿瘤细胞特异性基因没有观察到基因表达的变化，而且有趣的是，响应VEGF阻断的基因没有可检测上调。该等基因列于下文表1。表1 Q60种基因，均值倍数变化=2. 7，阈值倍数变化=2. 0)
权利要求
1.一种监测接受至少一剂VEGF拮抗剂的患者是否会响应VEGF拮抗剂治疗的方法，该方法包括(a)检测施用至少一剂VEGF拮抗剂之后自患者获得的生物学样品中至少一种表1-3任一所列基因的表达；并(b)将该至少一种基因的表达水平与对该患者施用该VEGF拮抗剂之前自该患者获得的生物学样品中该至少一种基因的表达水平比较，其中施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中该至少一种基因的表达水平的降低鉴定出会响应VEGF拮抗剂治疗的患者。
2.一种优化VEGF拮抗剂的治疗功效的方法，该方法包括(a)检测施用至少一剂VEGF拮抗剂之后自接受该至少一剂VEGF拮抗剂的患者获得的生物学样品中至少一种表1-3任一所列基因的表达；并(b)将该至少一种基因的表达水平与对该患者施用该VEGF拮抗剂之前自该患者获得的生物学样品中该至少一种基因的表达水平比较，其中施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中该至少一种基因的表达水平的降低鉴定出受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性升高的患者。
3.权利要求1或2的方法，其中该至少一种基因的表达通过测量mRNA来检测。
4.权利要求1或2的方法，其中该至少一种基因的表达通过测量血浆蛋白质水平来检测。
5.权利要求1或2的方法，进一步包括检测来自该患者的生物学样品中至少第二种表1-3任一所列基因的表达。
6.权利要求5的方法，进一步包括检测来自该患者的生物学样品中至少第三种表1-3任一所列基因的表达。
7.权利要求6的方法，进一步包括检测来自该患者的生物学样品中至少第四种表1-3任一所列基因的表达。
8.权利要求1或2的方法，其中该至少一种基因选自下组ABCC9；AFAP1L1 ；⑶93 ；CTLA2A ；CTLA2B ；CNTNAP2 ；C0L18A1 ；C0L4A1 ；C0L4A2 ；EGFL7 ；ELTDl ；ESMl ；FAM38B ；FAM167B ；GIMAPl ；GIMAP5 ；GIMAP6 ；GNGll ；GPRl 16 ；HBB ； ICAM2 ；KCNE3 ；KDR ；MCAM ；MEST ；MMRN2 ；MYCTl ；MYL9 ；NIDl ；NID2 ；N0S3 ；N0TCH4 ；0LFML2A ；PCDH17 ；PDE6D ；PODXL ；PRND ；RAPGEF3 ； RASGRP3 ； RBP7 ； SPARCL1 ； SPRY4 ； TAGLN ；TMEM88 和 TSPAN18。
9.权利要求1或2的方法，其中该VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
10.权利要求9的方法，其中该抗VEGF抗体是贝伐单抗。
11.权利要求1或2的方法，其中该患者具有血管发生性病症。
12.权利要求11的方法，其中该患者具有选自下组的癌症结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，成胶质细胞瘤，及其组合。
13.一种用于为接受至少一剂VEGF拮抗剂的患者选择疗法的方法，该方法包括(a)检测施用VEGF拮抗剂之后自患者获得的生物学样品中至少一种表1-3任一所列基因的表达；(b)将该至少一种基因的表达水平与对该患者施用该VEGF拮抗剂之前自该患者获得的生物学样品中该至少一种基因的表达水平比较；并(c)如果在施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中检测到该至少一种基因的表达水平的降低的话，选择VEGF拮抗剂作为疗法；或(d)如果在施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中没有检测到该至少一种基因的表达水平的降低的话，选择不是VEGF拮抗剂的疗法。
14.权利要求13的方法，进一步包括检测来自该患者的生物学样品中至少第二种表1-3任一所列基因的表达。
15.权利要求14的方法，进一步包括检测来自该患者的生物学样品中至少第三种表1-3任一所列基因的表达。
16.权利要求15的方法，进一步包括检测来自该患者的生物学样品中至少第四种表1-3任一所列基因的表达。
17.权利要求13的方法，其中(c)的疗法包括施用选自下组的药剂抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，及其组合。
18.权利要求13的方法，进一步包括(e)如果在施用该VEGF拮抗剂之后获得的样品中检测到该至少一种基因的表达水平的降低的话，对该患者施用有效量的VEGF拮抗剂。
19.权利要求18的方法，其中该VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
20.权利要求19的方法，其中该抗VEGF抗体是贝伐单抗。
21.权利要求20的方法，进一步包括施用有效量的至少第二种药剂。
22.权利要求21的方法，其中该第二种药剂选自下组抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，及其组合。
23.权利要求13的方法，其中(d)的疗法包括施用选自下组的药剂抗肿瘤剂，化疗剂，生长抑制剂，细胞毒剂，及其组合。
24.一种鉴定用于监测对VEGF拮抗剂的响应性的生物标志物的方法，该方法包括(a)检测自接受至少一剂VEGF拮抗剂的患者获得的生物学样品中候选生物标志物的表达；(b)将该候选生物标志物的表达与参照样品中该候选生物标志物的表达水平比较，其中以与参照样品相比低至少1. 99倍的水平表达的候选生物标志物鉴定为可用于监测对VEGF拮抗剂的响应性的生物标志物。
25.权利要求M的方法，其中生物学样品中以与参照样品相比低至少2.0倍的水平表达的候选生物标志物鉴定为可用于监测对VEGF拮抗剂的响应的生物标志物。
26.权利要求M的方法，其中生物学样品中以与参照样品相比低至少2.7倍的水平表达的候选生物标志物鉴定为可用于监测对VEGF拮抗剂的响应的生物标志物。
27.权利要求M的方法，其中生物学样品中以与参照样品相比低至少2.9倍的水平表达的候选生物标志物鉴定为可用于监测对VEGF拮抗剂的响应的生物标志物。
28.权利要求M的方法，其中生物学样品中以与参照样品相比低至少3.1倍的水平表达的候选生物标志物鉴定为可用于监测对VEGF拮抗剂的响应的生物标志物。
29.权利要求对的方法，其中该参照样品是对该患者施用该VEGF拮抗剂之前自该患者获得的生物学样品。
30.权利要求M的方法，其中该VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
31.权利要求30的方法，其中该抗VEGF抗体是贝伐单抗。
全文摘要
本发明提供用于检测一种或多种生物标志物的表达以监测VEGF拮抗剂治疗的有效性的方法和组合物。本发明还提供用于鉴定和治疗有可能响应VEGF拮抗剂疗法的患者的方法。本发明还提供用于所述方法的试剂盒和制品。
文档编号C12Q1/68GK102575298SQ201080046450
公开日2012年7月11日 申请日期2010年8月13日 优先权日2009年8月14日
发明者C.贝斯, J.卡明克, M.布劳尔, M.辛 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司