专利名称：利用风味定向技术筛选中国白酒酿造中的β-大马酮产生菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用风味定向技术从中国白酒大曲、小曲、酒醅、原料、环境中筛选白酒中微生物代谢相关的香气物质产生菌的筛选方法，以及利用该法筛选中国白酒大曲、小曲、酒醅、原料、环境中的β-大马酮产生菌株，以及将菌株应用于传统酿造食品工业领域和生物香料制备领域。属于生物工程技术和酿酒生物技术领域。
背景技术：
中国白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一，深得消费者喜爱。中国白酒具有多种特殊的风格特征。白酒风味物质十分复杂，含量微少，种类繁多，对形成白酒的风格特征及其典型性具有很重要的作用。明确白酒重要风味物质的来源及其形成机制，并在酿造过程中对这类风味物质的合成进行有效的控制，对于白酒行业不同香型白酒工艺的改造以及白酒行业的现代化发展具有举足轻重的作用。对于任何传统食品酿造过程，都需要在微生物的作用下才能使加工原料发生重要的生物化学及物理变化后生成食品，并且发酵食品独特的风味和风格也都是建立在微生物生命运动的基础上。白酒酿造微生物是白酒酿造的原动力，也是造就白酒独特风味和风格的原因所在。白酒的生产包括制曲和发酵两个过程。在制曲过程中依靠自然界各种微生物富集到用淀粉质原料制成的曲坯上，经过培养、贮藏，成为成品大曲。在发酵过程中，依靠大曲提供的微生物在密闭发酵容器中多微共酵，形成复杂的白酒风味成分。因此建立白酒酿造中微生物代谢相关的重要香气物质产生菌的筛选方法，筛选风味物质产生功能微生物，不但能够明确白酒重要风味物质的来源及其形成机制，深入的认识中国白酒的科学理论价值；而且对于开发新的生物香料资源，以及生物香料行业的发展具有重要的意义。β -大马酮(β -damascenone)又名β -突厥烯酮，属于C13萜烯类芳香化合物。阈值极低，水中为2ng/L，模拟葡萄酒中为50ng/L，具有极高的香气贡献度；具有水果香、蜂蜜香、苹果味等香气，广泛存在于葡萄酒、啤酒、蒸馏酒等酒类酿造产品中，是这些产品中的关键香气成分。目前发现在葡萄酒酿造过程中存在一些非酿酒酵母，如汉逊德巴利酵母、美极梅奇酵母、异常毕赤酵母、葡萄酒有孢汉逊酵母等能够以葡萄汁为培养基产生β -大马酮， 但是β-大马酮浓度都极低。大马酮是中国白酒中重要的风味物质，尤其是清香型白酒中重要的微量特征性风味物质，但是对于中国白酒中β-大马酮产生来源却一无所知，也未有β-大马酮产生菌株的任何相关报道。因此，科学的认识中国白酒中β大马酮的产生机制，并有效改良中国白酒的酿造工艺，提高白酒品质，最关键的环节就是寻找以及利用产生大马酮的菌株。另外，β-大马酮作为一种珍贵的生物香料，主要被用于调制包括玫瑰香调在内的各种花香、木香、醛香、药草香和果香香调。因其价格较高，达2万元/kg左右，目前主要用于高级香水、高级化妆香精、食品香精和烟用香精中。尽管大马酮问世较晚，但因其具有独特的香气，为一名贵香料，颇受人们重视，目前已得到美国香料提取物制造协会的认可 (FEMA NO. 3420)。近年来，随着食品、高级化妆品及烟草工业的发展，其需求量有较大的增长。每年全球范围内的需求量为1 10吨。为了满足市场需求，许多国家都一直致力于其合成方法和工艺的研究，但是到目前为止，国际上主要还是集中于化学法合成β -大马酮，尚未见生物法规模化转化生产大马酮方面的研究报道。因此，规模化生物转化生产 β-大马酮的最关键环节也是寻找以及利用高产β-大马酮的菌株。本发明所提供的利用风味定向技术筛选中国白酒酿造过程中的微生物代谢相关的重要香气物质产生菌，对于科学地认识和理解中国白酒酿造过程及机制，对中国白酒的技术发展和进步具有重要的现实意义；同时，对于食品添加剂行业中新型生物香料的开发与生产也具有重要的实用价值。另外，本发明从中国白酒酿造大曲、小曲、酒醅、原料、环境中筛选所得的菌株是具有生物转化生产大马酮的功能。为首次从中国白酒酿造过程中获得的大马酮产生菌株，不但能够实现高效制备大马酮的功能，应用于大马酮生物香料的制备行业；而且能够解释中国清香型白酒中特征性风味物质大马酮产生的机制，将该菌株应用于中国白酒的酿造过程中，能够有效调控白酒中大马酮含量，实现中国白酒品质的提升。
发明内容
(1)要解决的技术问题
本发明要解决的一个技术问题是提供了一种利用风味定向技术从中国白酒大曲、小曲、酒醅、原料、环境中筛选白酒中微生物代谢相关的香气物质产生菌的筛选方法，以及将该方法应用于生物香料的制备工业中对中国白酒酿造中微生物代谢相关的香料物质的开发。本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一种β-大马酮产生菌株的筛选方法及其将菌株于传统白酒酿造行业和生物香料制备行业中的应用。(2)本发明的技术方案
一种大马酮产生菌株，其分类命名为
异常毕赤酵母 G0ZcAiaBJY-I，保藏编号 CGMCC No. 4740，
东方伊萨酵母(Issa tchenkia orien talis ) BJY-2，保藏编号 CGMCC No. 4741，
扣囊复膜孢酵母(SaccAarofflj^oAsis) BJY-3，保藏编号 CGMCC No. 4742，
粉状毕赤酵母 O0ZcAia /ari/70>sa)BJY-4，保藏编号 CGMCC No. 4743，
粟酒裂殖酵母(^bAizosaccAarofflj^^s /70 力e) BJY-5，保藏编号 CGMCC No. 4744，
丝孢酵母(Trichosporon asahii ) BJY-7，保藏编号 CGMCC No. 4746，
酿酒酵母(SaccAarofflj^e1S cererisiae) BJY-8，保藏编号 CGMCC No. 4747，
少孢酵母(Mzachs tania exigua ) BJY-9，保藏编号 CGMCC No. 4748，
嗜渗压有孢汉逊酵母(Waz^eeia1Spora o^swoMih )BJY-IO，保藏编号 CGMCC No. 4749，
发酵毕赤酵母(^icAia /eiTse^ia/ 》BJY-11，保藏编号 CGMCC No. 4750，
膜醭毕赤酵母 G0ZcAia 力rafli/acie^dBJY-U，保藏编号 CGMCC No. 4751，
葡萄牙棒孢酵母(CZari1^ora A^iiafliadBJY-lS，保藏编号CGMCC No. 4752，上述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述β-大马酮产生菌株的筛选方法以风味为导向，利用风味定向技术分析中国白酒酿造过程中微生物代谢相关的香气物质的含量变化，明确微生物代谢相关香气物质的产生环节，以该环节的中国白酒大曲、小曲、酒醅、原料、环境作为分离原料，筛选白酒中微生物代谢相关香气物质的产生菌；
采用色谱法分析中国白酒酿造过程中微生物代谢相关的香气物质的含量变化，包括 GC、GC/MS、HPLC、HPLC/MS、纸色谱的方法。所述大马酮产生菌株的筛选方法，为尽可能全的筛选白酒中微生物代谢相关的香气物质产生菌，模拟白酒酿造过程的培养基配方，以白酒酿造所用的原料为培养基成分，选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方，制取原料液体培养基，制作方式为20 200g原料样品经粉碎后，加mL/g计1 4倍体积的水，蒸煮l_5h，呈糊状，冷却后加入10 50U/g的糖化酶，于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液，调节糖度为ΚΓ δΤχ，调节pH为4 6。所述β-大马酮产生菌株的筛选方法，将大曲、小曲、酒醅、原料与无菌水混合后， 经过稀释涂布平板，对获得的菌株进行摇瓶发酵培养，培养条件为 40°C，150rpm，培养M 120h，发酵液经过顶空固相微萃取后，采用GC/MS测定β -大马酮含量，筛选获得产生大马酮的菌株。所述β-大马酮产生菌株的应用，在传统和现代食品酿造工业、生物香料制备工业中的应用。所述传统和现代食品酿造工业为中国白酒酿造工业。所述生物香料制备工业为β -大马酮的生物转化香料制备工业。风味定向技术的筛选方法
风味物质产生环节的测定跟踪白酒酿造的过程，取中国大曲或小曲及每隔2飞天的发酵酒醅，各5 50g，加入2 5倍质量的超纯水，加入5g NaCl，室温浸泡6 Mh，超声 10 60min，10000r/min离心20min，取上清液5 8mL，HS-SPME-GC-MS测定。根据曲和酒醅中风味物质的浓度变化，分析风味物质产生的环节，选择该环节的样品作为分离原料。风味物质产生菌株的筛选模拟白酒酿造过程的培养基配方。以白酒酿造所用的原料为培养基成分，包括高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方，制取原料液体培养基，制作方式为20 200g原料样品经粉碎后，加1 4倍体积的水，蒸煮l-5h，呈糊状，冷却后加入10 50U/g的糖化酶，于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液， 糖度为10 15°Bx，调节pH为4 6。培养条件为28 40°C，150rpm，培养M 120h。摇瓶培养发酵液采用HS-SPME-GC-MS检测。筛选获得产生风味物质的菌株。β -大马酮产生菌株的筛选采用风味定向技术的筛选方法，分析β -大马酮产生于大、小曲和培养初期的酒醅中，取大、小曲或培养0 5天的酒醅0. 5 5g，溶于 15 150mL无菌生理盐水摇床振荡30 150分钟，再稀释，涂布平板后单菌落移接斜面培养基，25 35°C恒温培养2 5天，单菌落移接斜面，挑取菌株进行摇瓶培养，采用 HS-SPME-GC-MS方法测定发酵液中β-大马酮含量，筛选获得β-大马酮产生菌株。β -大马酮浓度测定采用HS-SPME-GC-MS方法，15 mL顶空瓶中加入5 10 mL 澄清发酵液，进行顶空固相微萃取。顶空固相微萃取的条件为三相(Car/DVB/PDMQ萃取头，60°C预热5 10 min，萃取吸附30 50 min, GC解吸5 10 min。β -大马酮产生菌株在中国白酒酿造工业中的应用将菌株制成液体或固体菌制剂，添加于白酒大曲或酒醅中，能够有效增加中国大曲或酒醅中该菌株的生物量，并有效提高酒醅中大马酮的含量，最终提高中国白酒中大马酮的含量。β -大马酮产生菌株生物转化制备β -大马酮香料的应用菌株采用大麦汁培养基，25 ;35°C，150rpm，培养M 120h后，β -大马酮含量达到46 μ g/L。(3)本发明的有益效果
本发明提供了一种利用风味定向技术筛选中国白酒曲和酒醅中的微生物代谢相关的重要香气物质产生菌，对于科学地认识和理解中国白酒酿造过程及机制，对中国白酒的技术发展和进步具有重要的现实意义；同时，对于食品添加剂行业中新型生物香料的开发与生产也具有重要的实用价值。另外，本发明从中国白酒酿造大、小曲、酒醅、原料、环境中筛选所得的菌株是具有生物转化生产大马酮的功能。为首次从中国白酒酿造过程中获得的大马酮产生菌株，不但能够实现高效制备大马酮的功能，应用于大马酮生物香料的制备行业；而且能够解释中国清香型白酒中特征性风味物质大马酮产生的机制，将该菌株应用于中国白酒的酿造过程中，能够有效调控白酒中大马酮含量，实现中国白酒品质的提升。生物材料样品保藏β -大马酮产生菌株，其分类命名为
异常毕赤酵母G0Zdia anomala)m~l,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No. 4740，保藏日期2011年4月6日。东方伊萨酵母(Jl5lSaicAez^ia oriental is风Ti_2,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4741，保藏日期2011年4月6日。扣囊复膜孢酵母(feccAarofflj^oAsis fibuligera)^X_ >,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4742，保藏日期2011年4月6日。粉状毕赤酵母G0ZcAia farinosa)m~^已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4743，保藏日期2011年4月6日。粟酒裂殖酵母(SbAizo1SaccAarofflJ^e1S 知)BJY_5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4744，保藏日期2011年4月6日。丝孢酵母(rr/cAospoirw sssAii)BJY~7,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4746，保藏日期2011年4月6日。酿酒酵母iSdccharomycGS cerevisiae) BJY-8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4747，保藏日期2011年4月6日。少孢酵母(JazacAsexigua)^X-9,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4748，保藏日期2011年4月6日。嗜渗压有孢汉逊酵母osmophila) BJY-10,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4749，保藏日期2011年4月6 曰。发酵毕赤酵母ipichia fermentans) BJY-11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4750，保藏日期2011年4月6日。
膜醭毕赤酵母QPichia membranifaciens)BJY-12,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4751，保藏日期2011年4月6日。葡萄牙棒孢酵母(CZaW1^ora lusitaniae)节^i-Yi,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4752，保藏日期2011年4月6日。
图1 菌株细胞形态电镜照片。图2 葡萄牙棒孢酵母CGMCC No. 4752高粱糖化液体培养基发酵液质谱图。
具体实施例方式实施例1
β-大马酮产生环节的确定跟踪白酒酿造的过程，取中国大曲或小曲及每隔2飞天的发酵酒醅各20g，加入3倍质量的超纯水，室温浸泡6 Mh，超声10 60min，10000r/min 离心20min，取上清液5 8mL，加入5g NaCl，HS-SPME-GC-MS测定。根据酒醅中风味物质的浓度变化，结果见表1。从结果中看出，β -大马酮主要在发酵的O 5天产生，因此选择发酵2天的酒醅样品作为分离原料。表1清香型白酒发酵酒醅中β -大马酮浓度变化
权利要求
1.β-大马酮产生菌株，其分类命名为异常毕赤酵母 G0ZcAiaBJY-I，保藏编号 CGMCC No. 4740，东方伊萨酵母(Issa tchenkia orien talis ) BJY-2，保藏编号 CGMCC No. 4741， 扣囊复膜孢酵母(SaccAarofflj^oAsis) BJY-3，保藏编号 CGMCC No. 4742，粉状毕赤酵母 O0ZcAia /ari/70>sa)BJY-4，保藏编号 CGMCC No. 4743， 粟酒裂殖酵母(SbAizo1SaccAarofflj^e1S /70 力e)BJY-5，保藏编号 CGMCC No. 4744， 丝孢酵母(Trichosporon asahii ) BJY-7，保藏编号 CGMCC No. 4746， 酿酒酵母(SaccAarofflj^e1S cererisiae) BJY-8，保藏编号 CGMCC No. 4747， 少孢酵母(Mzachs tania exigua ) BJY-9，保藏编号 CGMCC No. 4748， 嗜渗压有孢汉逊酵母(Waz^eeia1Spora o^swoMih )BJY-IO，保藏编号 CGMCC No. 4749， 发酵毕赤酵母{pichia fermentans) BJY-11，保藏编号 CGMCC No. 4750, 膜醭毕赤酵母 G0ZcAia 力rafli/acie^dBJY-U，保藏编号 CGMCC No. 4751， 葡萄牙棒孢酵母(CZari1^ora A^iiafliadBJY-lS，保藏编号CGMCC No. 4752，上述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.—种权利要求1所述大马酮产生菌株的筛选方法，其特征在于以风味为导向， 利用风味定向技术分析中国白酒酿造过程中微生物代谢相关的香气物质的含量变化，明确微生物代谢相关香气物质的产生环节，以该环节的中国白酒大曲、小曲、酒醅、原料、环境作为分离原料，筛选白酒中微生物代谢相关香气物质的产生菌；采用色谱法分析中国白酒酿造过程中微生物代谢相关的香气物质的含量变化，包括 GC、GC/MS、HPLC、HPLC/MS、纸色谱的方法。
3.根据权利要求2所述大马酮产生菌株的筛选方法，其特征在于为尽可能全的筛选白酒中微生物代谢相关的香气物质产生菌，模拟白酒酿造过程的培养基配方，以白酒酿造所用的原料为培养基成分，选用高粱、大麦、小麦、豌豆及其各种不同比例的混合配方， 制取原料液体培养基，制作方式为20 200g原料样品经粉碎后，加mL/g计1 4倍体积的水，蒸煮l_5h，呈糊状，冷却后加入10 50U/g的糖化酶，于40 80°C保持2 10h，过滤、离心所得滤液，调节糖度为1(Γ 5°Βχ，调节ρΗ为4 6。
4.根据权利要求2所述大马酮产生菌株的筛选方法，其特征在于将大曲、小曲、 酒醅、原料与无菌水混合后，经过稀释涂布平板，对获得的菌株进行摇瓶发酵培养，培养条件为 40°C，150rpm，培养M 120h，发酵液经过顶空固相微萃取后，采用GC/MS测定 β-大马酮含量，筛选获得产生大马酮的菌株。
5.一种权利要求1所述β -大马酮产生菌株的应用，其特征在于在传统和现代食品酿造工业、生物香料制备工业中的应用。
6.根据权利要求5所述大马酮产生菌株的应用，其特征在于所述传统和现代食品酿造工业为中国白酒酿造工业。
7.根据权利要求5所述大马酮产生菌株的应用，其特征在于所述生物香料制备工业为大马酮的生物转化香料制备工业。
全文摘要
利用风味定向技术筛选中国白酒酿造中的β-大马酮产生菌株及其应用，属于生物工程技术和酿酒生物技术领域。β-大马酮是我国清香型白酒重要的微量特征性风味物质。所述菌株为异常毕赤酵母CGMCC4740、东方伊萨酵母CGMCC4741、扣囊复膜孢酵母CGMCC4742、粉状毕赤酵母CGMCC4743、粟酒裂殖酵母CGMCC4744、丝孢酵母CGMCC4746、酿酒酵母CGMCC4747、少孢酵母CGMCC4748、嗜渗压有孢汉逊酵母CGMCC4749、发酵毕赤酵母CGMCC4750、膜醭毕赤酵母CGMCC4751、葡萄牙棒孢酵母CGMCC4752中任一一株。菌株是从中国多家名酒厂的大、小曲以及酒醅、酿造原料、酿造环境中分离得到。该菌株可用于传统食品酿造领域，及β-大马酮生物香料的制备中。
文档编号C12N1/16GK102242072SQ201110122420
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者吴群, 徐岩, 王薇 申请人:江南大学