专利名称：一种微生物酶法转化白藜芦醇苷为白藜芦醇的方法
技术领域：
本发明涉及微生物酶法转化虎杖提取物为白藜芦醇的工艺方法，属于天然活性物质提取及转化的技术领域。
技术领域在此处键入技术领域描述段落。
背景技术：
白藜芦醇(resveratroLRes)。学名为3，4，5_三羟基二苯乙烯，是蒽醌萜类化合物，物理性质为无味、白色晶体粉末；难溶于水，易溶于乙醇，丙酮等有机溶剂。白藜芦醇主要存在于虎杖、葡萄、花生、松树等植物。白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和具有冠心病、缺血性心脏病、高血脂症的防治作用，白藜芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一。目前国际上白藜芦醇已被广泛应用，导致了白藜芦醇需求的大幅增加。由于化学合成白藜芦醇的工艺还不成熟，其所需白藜芦醇仍源于天然植物。当今国内学者优选的白藜芦醇的提取方法多是用有机溶剂或水从虎杖 {Polygonum cusp i da turn Sieb. et Zucc.， P. cusp i datum)中提取白藜戸酉享苷(polydatin, PD)，又叫虎杖甙，虎杖甙物理性质为白色针状结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，微溶于水。再用酸、碱或酶法解去甙上的糖，转化为甙元而成。虎杖甙的含量随产地不同差异较大，一般含量在1 4%。经文献和专利查新，已有文献和专利报道从虎杖甙制备白藜芦醇苷的方法。如中国专利申请号201010022075. 1采用专用固定化酶对虎杖材料粗提液进行生物转化，短时间内使其中白藜芦醇类似物转化为白藜芦醇，然后采用萃取分离技术获得高纯度的白藜芦醇。本发明可提高虎杖材料中白藜芦醇含量10-20倍，避免了同类技术中转化时间过长、催化时间不易控制以及反应完成后酶无法回收造成成本提高的问题，同时采用层析、结晶等分离、精制技术，获得大于95%的白藜芦醇和一定纯度的副产物大黄素两种产品。田天丽的论文(四川大学学报，2008)从中药材虎杖中筛选到一株具有转化虎杖苷能力的根霉菌株 T234，利用该菌株产生的葡萄糖苷酶能将虎杖苷转化为白藜芦醇.转化率达98 %。尽管相关专利申请和研究论文较多，但仍然不能很好解决酶催化活性不高，转化率低，时间过长，成本高的问题，难以有效应用生产实际。
发明内容
本发明的目的就针对上述缺陷，从虎杖内生菌中筛选到一株高效转化虎杖苷为白藜芦醇的微生物菌株。从根本上解决酶催化活性不高，转化率低，时间过长，成本高的问题，促进生产实践应用。发明内容之一.提供一种能发酵生产虎杖糖苷水解酶并高效转化虎杖苷为白藜芦醇的微生物菌株，该菌株经分子生物学和形态学鉴定为棘孢曲霉 acWmim)，该菌株2010年5月观日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号，CGMCC No. 3876。在一个实施方案中，其中说述菌株的筛选过程从各地采野生虎杖样品，采用虎杖提取物配制不同的培养基，从虎杖内生菌中进行筛选，将刚采集的新鲜虎杖的根状茎在自来水下冲洗干净，浙干水分，切割成2 3 cm小段，按常规无菌操作进行如下表面消毒处理 75%酒精漂洗；Γ5 s，0. 1%升汞漂洗圹5 min，无菌水冲洗4飞次。将上述处理过的根状茎在无菌条件下剥开取其韧皮部，将韧皮部外围剪去，再剪切成0.5 cmX0.5 cm的小片，放置于PDA平板上，每个平板放置4块，30°C培养3 7 d后，即见样品剪切过的边缘有真菌菌丝长出，真菌菌丝经纯化后转接到PDA斜面上培养好后备用。将保存至斜面上的菌种发酵，检测其粗酶液转化PD生成Res的效果，进行复筛。筛选到多个菌株，逐一复筛进行虎杖糖苷水解实验，得虎杖糖苷水解酶高活性菌株，进行菌种签定。在另一个具体实施方案中，所述菌株棘孢曲霉Usper识7ΛΛ5. acWeaim)，CGMCC No. 3876的形态特征为菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质，有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞垂直生出，大多数无隔膜，光滑或粗糙，上部较粗大，顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊；从泡囊的全部表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗；小梗单层或在顶部再分枝成2个至多个的小梗。分生孢子串生于小梗顶端，作辐射状排列或丛集成柱形，着褐色、形状、大小和纹饰的变化很大。发明内容之二 . 提供所述菌株棘孢曲霉(Aspergillus, aculeatus)，CGMCC No. 3876发酵制备的胞外酶。所述菌株胞外酶是一组复合酶，其中包括纤维素内切酶，纤维素外切酶，木聚糖酶以及虎杖糖苷水解酶等。在一个实施方案中，所述菌株胞外酶发酵制备方法是，用无菌培养基(配方3% 6%麸皮、0. 5 1. 0%蛋白胨、起始pH 5 6)接种棘孢曲霉CGMCC No. 3876，在沘 30°C 条件下好氧发酵3 3. 5天，发酵一层纱布液经过滤、5000 10000转/min离心，上清液用截留分子量为5000 Da中空纤维膜浓缩5倍，浓缩液为胞外酶粗酶液。发明内容之三.采用所述菌株发酵制备的胞外酶，提供一种酶法提取虎杖苷及其类似物，并结合常规醇提和水提方法获得虎杖苷及其类似物粗提液的方法及其用途。所述菌株胞外酶法酵制备工艺包括用棘孢曲霉CGMCC No. 3876胞外酶粗酶液与 60 80目的虎杖干粉调浆，胞外酶粗酶液与虎杖干粉比例为1.5 mL:l g;在35 40°C条件下酶法水解3 4小时；再补充5 6倍体积用95%工业酒精浸提3次，每次1. 5 2小时，合并浸提液；将浸提液用常规方法挥干，获得虎杖苷及其类似物粗品。酶法提取虎杖苷及其类似物，提取率为2. 3% ；未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶(对照)提取虎杖苷及其类似物，提取率仅为1. 2%，处理提高了 91. 7%。在另一个具体实施方案中，用于提取的植物材料可以是富含白藜芦醇苷的虎杖、 花生、葡萄等。发明内容之四.从所述菌株发酵制备的胞外酶中提供高效转化虎杖苷为白藜芦醇的虎杖糖苷水解酶及其用途。包括
⑴所述菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的虎杖糖苷水解酶的需分离纯化，分离纯化方法可以是硫酸铵沉淀、离子交换层析、葡聚糖凝胶层析、亲和层析，也可以是活性凝胶电泳二步循环法(NGGEE) [1]，-40°C冻干并获得纯度为98%以上的虎杖糖苷水解酶。该酶的酶学特性为由一个亚基组成，亚基分子量为27. 3 kDa，等电点pi 4. 65，最适反应度40°C，最适反应pH 5. 0, K =5 mg/mL虎杖苷。虎杖糖苷水解酶比活力达1783. 6 IU/ (mg protein)
⑵用蒸馏水配制1% 5%过饱和的虎杖糖苷水溶液(虎杖糖苷原料含量98%以上)， 加入0. 5% 1%，纯度为98%以上的所述虎杖糖苷水解酶，在pH 5. 0，40°C条件下水解虎杖糖苷，并不断搅拌，水解3 6 h，获得过饱和的白藜芦醇过饱和水溶液。虎杖糖苷在水溶液中溶解度很低，在过饱和状态下，虎杖糖苷被所述虎杖糖苷水解酶源源不断水解为白藜芦醇。由于白藜芦醇溶解度比虎杖糖苷溶解度更低，过饱和的白藜芦醇水溶液不断有白藜芦醇析出，在此机制下，虎杖糖苷几乎完全水解为白藜芦醇，转化率达99. 5%以上。经常规的离心过滤，蒸发浓缩获得高纯度的白藜芦醇，纯度达98. 5%。在一个具体实施方案中，底物还可以是富含白藜芦醇苷的虎杖、花生、葡萄等浸提的白藜芦醇苷粗品，酶液可以是纯化的说所述虎杖糖苷水解酶，也可以是未纯化说所述菌株复合酶，水解产物为白藜芦醇。
虎杖糖苷被虎杖糖苷水解酶水解为白藜芦醇薄层色谱图，lane PD为虎杖糖苷标样，lane Res为白藜芦醇标样，lane 1虎杖糖苷被杖糖苷水解酶水解反应3 min, lane 2 反应6 min, lane 3反应9 min, lane 4反应12 min, lane 5反应15 min分别为虎杖糖苷水解时间，展开剂(正丁醇醋酸水=4:1:1)，紫外365nm显色。技术效果
用所述菌株棘孢曲霉Usper识7ΛΛ5. acWeaim)，CGMCC No. 3876发酵制备的胞外酶。 酶法提取虎杖苷及其类似物，提取率为2. 3% ；未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶(对照)提取虎杖苷及其类似物，提取率仅为1. 2%，处理提高了 91. 7%。可为生产实践提供制备白藜芦醇专用复合酶。用所述菌株棘孢曲霉的纯化的虎杖糖苷水解酶水解虎杖糖苷，产物为白藜芦醇， 转化率高达99. 5%以上。为生产白藜芦醇提供专一性水解酶。
具体实施例方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。实施例1，高效转化虎杖苷为白藜芦醇的微生物菌株菌株的获得
从各地采野生虎杖样品，采用虎杖提取物配制不同的培养基，从虎杖内生菌中进行筛选，将刚采集的新鲜虎杖的根状茎在自来水下冲洗干净，浙干水分，切割成2 3 cm小段，按常规无菌操作进行如下表面消毒处理75%酒精漂洗;Γ5 s，0. 1%升汞漂洗Γ5 min，无菌水冲洗4飞次。将上述处理过的根状茎在无菌条件下剥开取其韧皮部，将韧皮部外围剪去， 再剪切成0.5 cmX0.5 cm的小片，放置于PDA平板上，每个平板放置4块，30°C培养;Γ7 d 后，即见样品剪切过的边缘有真菌菌丝长出，真菌菌丝经纯化后转接到PDA斜面上培养好后备用。将保存至斜面上的菌种发酵，检测其粗酶液转化PD生成Res的效果，进行复筛。 筛选到多个菌株，逐一复筛进行虎杖糖苷水解实验，得虎杖糖苷水解酶高活性菌株，进行菌种签定。该菌株经分子生物学和形态学鉴定为棘孢曲霉(Aspergillus, aculeatus),该菌株 2010年5月观日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号，CGMCC No.3876。
实施例 2，棘孢曲霉(Aspergillus, aculea tus ) CGMCC No. 3876 的形态特征
"^MWMl^(.Aspergillus, aculeatus), CGMCC No. 3876 在 PDA 培养基培养 3 4 天，用光学显微镜观察其形态特征，该菌株菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质，有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞垂直生出，大多数无隔膜，光滑或粗糙，上部较粗大，顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊；从泡囊的全部表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗；小梗单层或在顶部再分枝成2个至多个的小梗。分生孢子串生于小梗顶端，作辐射状排列或丛集成柱形，着褐色、形状、大小和纹饰的变化很大。实施例3，棘孢曲霉(Aspergillus, aculeatus)CGMCC No. 3876的胞外酶的发酵制备
配制培养基(配方4%麸皮、1.0%蛋白胨、起始pH 5.0)，接种棘孢曲霉CGMCC No. 3876， 在观 301条件下用100 L发酵罐好氧发酵3. 5天，发酵一层纱布液经过滤、三足式离心机5000转/min离心20min，上清液用截留分子量为5000 Da中空纤维膜浓缩5倍，浓缩液为胞外酶粗酶液复合酶12 L ；分别测定该菌株的纤维素酶活力，木聚糖酶活力，β-葡萄糖苷酶活力，该菌株发酵液的纤维素酶滤纸酶活力(Filter Paper Activity, FPA)达到3. 8 IU/mL (其中，一个FPA酶活力国际单位，是指在pH 4. 8，50 ° C，每min由滤纸生成1. 0 μπιο 还原糖的酶量，以IU/mL表示)；β-葡萄糖苷酶活力达713 IU/mL (其中，一个β-葡萄糖苷酶活力国际单位，是指在PH 4. 8，50 ° C，每min由纤维二糖生成1.0 μ mol葡萄糖的酶量，以IU/mL表示)木聚糖酶活力达179 IU/mL (其中，一个木聚糖酶活力国际单位， 是指在PH 4. 8，50 ° C，每min由木聚糖生成1.0 μ mol木糖的酶量，以IU/mL表示)。实施例4，酶法提取虎杖苷及其类似物
用棘孢曲霉CGMCC No. 3876胞外酶粗酶液与80目的虎杖干粉调浆，胞外酶粗酶液与虎杖干粉比例为1. 5 mL: 1 g ；在40°C条件下酶法水解3小时；再补充5倍体积用95%工业酒精浸提3次，每次1. 5 2小时，合并浸提液；将浸提液用常规方法挥干，获得虎杖苷及其类似物粗品。酶法提取虎杖苷及其类似物，提取率为2. 3% ；未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶 (对照)提取虎杖苷及其类似物，提取率仅为1. 2%，处理提高了 91. 7%。实施例5，从花生壳中酶法提取白藜芦醇苷及其类似物
用棘孢曲霉CGMCC No. 3876胞外酶粗酶液与60目的花生壳干粉调浆(其中花生壳为市售花生去花生仁的废弃物)，胞外酶粗酶液与花生壳干粉比例为2 mL:l g;在40°C条件下酶法水解4小时；再补充6倍体积用95%工业酒精浸提3次，每次2小时，合并浸提液；将浸提液用常规方法挥干，获得白藜芦醇苷及其类似物粗品。酶法提取白藜芦醇苷及其类似物，提取率为0. 4%ο实施例6，从葡萄皮中酶法提取白藜芦醇苷及其类似物
用棘孢曲霉CGMCC No. 3876胞外酶粗酶液与葡萄皮调浆(其中葡萄皮为市售葡萄去仁的废弃物，，如巨峰葡萄等)，胞外酶粗酶液与葡萄皮比例为1.5 mL:l g;在40°C条件下酶法水解3小时；再补充5倍体积用95%工业酒精浸提3次，每次2小时，合并浸提液；将浸提液用常规方法挥干，获得白藜芦醇苷及其类似物粗品。酶法提取白藜芦醇苷及其类似物，提取率为1. 7%。实施例7，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的虎杖糖苷水解酶的分离纯化
(1)将棘孢曲霉 Usper^iV^As. acWeatos) CGMCC No. 3876 的胞外酶粗酶液 2000 mL,用15%饱和度的硫酸铵沉淀，收集上清，在用80%饱和度的硫酸铵沉淀，收集沉淀；
⑵沉淀用G25脱盐，收集β-葡萄糖苷酶活性峰，收集液用截留分子量为5000 Da中空纤维膜浓缩至1000 mL，得浓缩酶液Lys — 1 ；
(3)浓缩酶液Lys— 1用DEAE C-52离子交换进一步分离纯化，用0 0. 8 mol/L的氯化钠-20 mmol/L pH 5. 0柠檬酸缓冲液梯度洗脱，收集β -葡萄糖苷酶活性峰，收集液用截留分子量为5000 Da中空纤维膜浓缩至200 mL，得浓缩液Lys — 2 ；
(4)浓缩酶液Lys- 2，用葡聚糖凝胶G75层析，用20 mmol/L pH 5. 0柠檬酸缓冲液洗脱，收集β-葡萄糖苷酶活性峰，收集液用截留分子量为5000 Da超滤膜(Millipore，MW 10000, 50 ml, USA)浓缩至100 mL，得浓缩酶液Lys — 3，浓缩酶液Lys — 3为菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的β -葡萄糖苷酶，即为本发明的虎杖糖苷水解酶；
(5)浓缩酶液Lys- 3经-40°C冻干并获得纯度为98%以上的虎杖糖苷水解酶固体粉剂。实施例8，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的虎杖糖苷水解酶浓缩酶液Lys — 3的酶学特性
⑴菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的虎杖糖苷水解酶的亚基分子量，将浓缩酶液Lys — 3用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以及上海生化所蛋白质marker (14. 1 - 97. 4 KDa)测定亚基分子量[2]，该虎杖糖苷水解酶由一个亚基组成，亚基分子量为27. 3 kDa ；虎杖糖苷水解酶比活力达1783. 6 IU/(mg protein)。(2)虎杖糖苷水解酶等电点，将所述虎杖糖苷水解酶浓缩酶液Lys — 3，用5%的聚丙烯酰胺凝胶以及两性电解质(Ampholine 0.4% pH 4 - 6以及pH 3-10, Sigma)按 0' Farrell方案等电聚焦[3]，测定等电点，等电点pi 4. 65 ；
⑶虎杖糖苷水解酶最适反应温度，将所述虎杖糖苷水解酶浓缩酶液Lys — 3，分别在 250C，30°C。35°C，40°C，45°C，50°C，55°C，60°C，65°C，70°C温度条件下水解 8 mg/mL 的虎杖糖苷水溶液，反应水解5min，用HPLC测定水解产物白藜芦醇的含量，最适反应度40°C ；
(4)虎杖糖苷水解酶最适反应pH，将所述虎杖糖苷水解酶浓缩酶液Lys— 3，分别在 pH3. 5，pH4. 0，pH4. 5，pH5. 0，pH5. 5，pH6. 0，pH6. 5，pH7. 0 条件下水解 8 mg/mL 的虎杖糖苷水溶液，反应水解5min，用HPLC测定水解产物白藜芦醇的含量，最适反pH为6. 0 ；
(5)虎杖糖苷水解酶反应常数，将所述虎杖糖苷水解酶浓缩酶液Lys— 3，在pH5. 0， 40°C条件下，分别水解1 10 mg/mL的虎杖糖苷水溶液，测定反应初速度，经双倒数作图法测定该酶米氏常数为·=5 mg/mL虎杖苷。实施例9，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876虎杖糖苷水解酶水解虎杖糖苷为白藜芦醇的转化率
用蒸馏水配制0. 5%虎杖糖苷水溶液(虎杖糖苷原料含量98%)，加入0. 5%浓缩酶液 Lys-3 (纯度为98%以上的所述虎杖糖苷水解酶)，在pH 5. 0，40°C条件下水解虎杖糖苷， 并不断搅拌，水解0 20min，在不同水解时间测定虎杖糖苷的转化率，其中3 min转化率为44%，6 min转化率为78%，9 min转化率为93%，12 min转化率为96%，15 min转化率为 99% (见附图1)，在20 min内虎杖糖苷几乎完全水解为白藜芦醇转化率。经常规的离心过滤，蒸发浓缩获得高纯度的白藜芦醇，纯度达99. 0%。实施例10，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876虎杖糖苷水解酶水解虎杖糖苷为白藜芦醇的转化率
用蒸馏水配制3%过饱和的虎杖糖苷水溶液(虎杖糖苷原料含量98%)，加入1%浓缩酶液Lys — 3 (纯度为98%以上的所述虎杖糖苷水解酶)，在pH 5. 0，40°C条件下水解虎杖糖苷，并不断搅拌，水解4 h，获得过饱和的白藜芦醇过饱和水溶液。虎杖糖苷在水溶液中溶解度很低，在过饱和状态下，虎杖糖苷被所述虎杖糖苷水解酶源源不断水解为白藜芦醇。由于白藜芦醇溶解度比虎杖糖苷溶解度更低，过饱和的白藜芦醇水溶液不断有白藜芦醇析出， 在此机制下，虎杖糖苷几乎完全水解为白藜芦醇，转化率达99. 7%。经常规的离心过滤，蒸发浓缩获得高纯度的白藜芦醇，纯度达98. 5%。实施例11，菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的复合酶水解虎杖苷的为白藜芦醇的转化率
用蒸馏水配制5%过饱和的虎杖糖苷水溶液(虎杖糖苷原料含量50%)，加入菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876的复合酶，在pH 5. 0，40°C条件下水解虎杖糖苷，并不断搅拌，水解6 h，获得过饱和的白藜芦醇过饱和水溶液。虎杖糖苷在水溶液中溶解度很低，在过饱和状态下，虎杖糖苷被所述虎杖糖苷水解酶源源不断水解为白藜芦醇。虎杖糖苷几乎完全水解为白藜芦醇，经HPLC测定，转化率达99. 5%。参考文献Yuanshan Lin, Guiguang Chen , Min Ling , Zhiqun Liang. A method of purification, identification and characterization of β-glucosidase from Trichoderma koningii AS3. 2774. Journal of Microbiological Methods 83 (2010), 74 - 81.Laemmli, U. K. , . Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(1970)，680 - 685.0' Farrel1, P. , High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250(1975)，4007 - 4021.
权利要求
1.一种用于发酵生产虎杖糖苷水解酶并高效转化虎杖苷为白藜芦醇的微生物菌株，该菌株经分子生物学和形态学鉴定为棘孢曲霉识7ΛΛ5. acWeatos)，该菌株2010年5 月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号，CGMCC No. 3876。
2.权利要求1所述的微生物菌株发酵制备的复合酶，其特征在于(1)复合酶为胞外酶，含纤维素内切酶、纤维素外切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶；⑵复合酶发酵制备方法为，用培养基(配方3% 6%麸皮、0. 5 1. 0%蛋白胨、起始ρΗ 5 6)，无菌条件下接种棘孢曲霉CGMCC No. 3876，在观 30°C条件下好氧发酵3 3. 5 天，发酵经过滤、5000 10000 r/min离心，上清液用截留分子量为5000 Da中空纤维膜浓缩5倍，浓缩液为胞外酶粗酶液。
3.权利要求1-2所述的微生物菌株及其发酵制备的复合酶，用于从富含白藜芦醇苷的植物材料中提取白藜芦醇苷及其类似物的方法和用途，其特征在于⑴富含白藜芦醇苷的植物材料可以是虎杖、花生壳、葡萄皮；⑵提取白藜芦醇苷及其类似物的方法和用途为用权利要求1-2所述的菌株复合酶与60 80目的虎杖干粉调浆，胞外酶粗酶液虎杖干粉=1.5 mL:l g;在35 40°C条件下酶法水解3 4小时；再用5 6倍体积95%工业酒精浸提3次，每次1. 5 2小时，合并浸提液；结合常规方法挥干浸提液，获得白藜芦醇及其类似物的粗品。
4.权利要求1-2的菌株复合酶方法和用途还可以是用于转化白藜芦醇苷(虎杖苷)为白藜芦醇的工艺用菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876复合酶，在ρΗ 5. 0，55°C条件下水解催化用蒸馏水配制1% 5%虎杖糖苷粗品悬浊液，将虎杖苷转化为白藜芦醇的方法。
5.权利要求1-2所述的微生物菌株及其发酵制备的复合酶中，从中分离纯化获得虎杖糖苷水解酶及其用途，其特征在于(1)菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876虎杖糖苷水解酶，由一个亚基组成，亚基分子量为 27.3 kDa，等电点pi 4. 65，最适反温度40°C，最适反应pH 5. 0,Km=5 mg/mL虎杖苷，虎杖糖苷水解酶比活力达1783.6 IU/(mg protein)⑵用含量0. 5% 1%，纯度为98%以上菌株棘孢曲霉CGMCC No. 3876虎杖糖苷水解酶， 在ρΗ 5.0, 55°C条件下水解催化用蒸馏水配制1% 5%过饱和的虎杖糖苷悬浊液(虎杖糖苷原料含量98%以上)，水解虎杖糖苷，并不断搅拌，水解3 6 h，获得过饱和的白藜芦醇过饱和悬浊液；虎杖糖苷在水溶液中溶解度很低，在过饱和状态下，虎杖糖苷被所述虎杖糖苷水解酶源源不断水解为白藜芦醇；由于白藜芦醇溶解度比虎杖糖苷溶解度更低，过饱和的白藜芦醇悬浊液不断有白藜芦醇析出，在此机制下，虎杖糖苷几乎完全水解为白藜芦醇的方法。
全文摘要
本发明提供一种从虎杖、花生壳、葡萄皮等植物材料中高效提取白藜芦醇苷及其类似物所用的微生物菌株棘孢曲霉(Aspergillus.aculeatusCGMCCNo.3876)及其发酵制备的复合酶；用所述菌株的复合酶酶法提取虎杖苷及其类似物，提取率为2.3%；比未加所述菌株棘孢曲霉的胞外酶(对照)提取虎杖苷及其类似物，处理提高了91.7%。用所述菌株的复合酶转化白藜芦醇苷(虎杖苷)为白藜芦醇的转化率达99.5%以上；从所述菌株的复合酶中纯化的虎杖糖苷水解酶，并转化98%的虎杖苷为白藜芦醇，转化率达99.7%。白藜芦醇纯度达98.5%。本发明为生产实际提供一种新型复合酶制剂，从根本上解决当前生产升级中酶催化活性不高，转化率低，时间过长，成本高的问题，促进生产实践应用。
文档编号C12N9/42GK102408999SQ20111017932
公开日2012年4月11日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者庞一林, 杨祖佑, 林元山, 邹冬生 申请人:林元山