专利名称：miRNA-106a及其抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭调控剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，特别涉及胶质瘤干细胞侵袭行为调控的调控剂。
背景技术：
恶性胶质瘤(glioblastoma，GBM)是中枢神经系统最常见的原发性恶性脑肿瘤。 肿瘤细胞的侵袭性生长是恶性胶质瘤的重要生物学特性，这种侵袭特性使得手术难以彻底切除肿瘤组织，而且化疗和放疗效果差，术后复发率高，预后不佳。恶性胶质瘤的侵袭性生长和治疗抵抗机制尚不清楚。最近大量的研究表明，肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)在肿瘤发生与发展中发挥重要作用。研究发现恶性胶质瘤中存在胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs), 这些GSCs具有自我更新能力、多向分化潜能以及形成肿瘤的能力。同时发现，GSCs具有高侵袭力，然而具体的分子机制不明。microRNA(miRNA)是一类新近发现的长度约为21 23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通过调节靶基因的表达在发育和疾病中参与了增殖、迁移、分化和凋亡等生理性和病理性过程。越来越多的证据显示不同类型的miRNA参与了调控肿瘤的发生及转移。此外，目前已有研究发现CSCs中miRNA的表达谱与正常干细胞中的不同，并在肿瘤的诊断、治疗和预后中具有重要意义。miRNA的表达可能参与了恶性胶质瘤侵袭的调控，但是和GSCs 生物学行为之间的关系还需要进一步深入研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种胶质瘤干细胞侵袭的促进剂，该促进剂为制备胶质瘤干细胞侵袭模型提供了有效的途径。miRNA-106a在制备胶质瘤干细胞侵袭促进剂中的应用。进一步，miRNA-106a在制备TIMP-2抑制剂中的应用。进一步，miRNA-106a在制备MMP2促进剂中的应用。进一步，miRNA-106a在制备MMP9促进剂中的应用。本发明的目的之二在于提供一种胶质瘤干细胞侵袭的抑制剂，该抑制剂为治疗胶质瘤提供了新思路。为实现上述方案，本发明的技术方案为miRNA-106a的抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭抑制剂中的应用。进一步，所述miRNA_106a为TIMP-2的抑制剂。进一步，所述miRNA_106a为MMP2促进剂。进一步，所述miRNA_106a为MMP9促进剂。进一步，所述miRNA-106a 的抑制剂为 Anti-miR miRNA-106a inhibitors。上述技术方案是通过如下方法得到的首先分离了人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的⑶133+胶质瘤细胞(glioma cells, GCs)，并通过鉴定证实了人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的CD133+胶质瘤细胞具有GSCs特性；然后，根据miRNA芯片结果(miRCURY LNA microRNA array (v. 10. 0)，丹麦 Exiqon Life Sciences 公司)发现了两个功能性的miRNA，其中一个为miRNA-106a，检测了 miRNA_106a和TIMP-2通路在 GSCs和GCs中的表达；最后，通过研究miRNA-106a对TIMP-2的直接调控作用并证明这是 miRNA-106a促进GSCs侵袭的重要机制。本发明的有益效果在于分离得到的CD133+细胞具有自我更新、多向分化潜能、形成肿瘤等的生物学特性；证明GSC较胶质瘤细胞(GC)具有高侵袭性；miRNA-106a在GSC中的表达显著高于GC (P < 0. 05)，TIMP-2无论mRNA水平还是蛋白水平在GSC中的表达显著低于GC (P < 0. 05) ；miRNA-106a的抑制剂可以明显抑制GSC的侵袭能力(P < 0. 05)；抑制 miRNA-106a的表达后，TIMP_2mRNA水平和蛋白水平的表达显著升高(P < 0. 05)，荧光素酶报告基因实验证实miRNA-106a不仅可以负调控TIMP-2的表达，而且是通过和TIMP-2的 3，UTR相结合的方式直接调控TIMP-2的表达。所以，GSCs具有高侵袭特性，发现miRNA-106a 高表达促进了 GSCs的侵袭性，其机制至少是通过下调TIMP-2、上调MMP2和MMP9表达而实现的。
图1为人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的GSCs的分离流式细胞结果图。图2为为⑶133_细胞在肿瘤干细胞培养基中培养36小时，⑶133+细胞在肿瘤干细胞培养基中培养7天；光学显微镜观察，X 200。图3为⑶133+细胞中⑶133和nestin的表达免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，DAPI标记细胞核，标尺=50 μ m。图4为⑶133+细胞形成的细胞球诱导分化7天后，分化成表达GFAP、β -tubulin III和MBP的细胞。免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，DAPI标记细胞核，标尺=50 μ m。图5为⑶133+细胞和⑶133—细胞在裸小鼠体内成瘤大小的照片。图6为⑶133+细胞和⑶133—细胞在裸小鼠体内成瘤大小的定量分析结果，*P
<0. 05，**P < 0. 01。图7为Transwell侵袭实验细胞数目图，光学显微镜观察，X200。图8为Transwell侵袭实验细胞数目定量分析结果，*P < 0. 05。图9为定量PCR检测miRNA_20a和miR_106a在GSCs和GCs中的表达差异，**P
<0. 01，_P < 0. 001。图10为miRNA_20a和miR_106a分别对GSCs侵袭能力的影响，Transwell侵袭实验细胞数目图，光学显微镜观察，X200。图11为Transwell侵袭实验细胞数目定量分析结果，*P < 0. 05，，其中 miRNA-20aI 代表 miRNA-20a 抑制剂，miRNA-106aI 代表 miRNA-106 抑制剂。图 12 为 TIMP-2、MMP2 和 MMP9mRNA 水平在 GSCs 和 GCs 中的表达差异，*P < 0. 05， **P < 0· 01，_P < 0. 001。图13为TIMP-2、MMP2和MMP9蛋白水平在GSCs和GCs中的表达差异。
图 14 为分别转染 miRNA-20a 和 miR_106a 抑制剂后 TIMP-2、MMP2 和 MMP9mRNA 水平的表达变化，*P < 0. 05，**P < 0. 01。图15为分别转染miRNA-20a和miR_106a抑制剂后TIMP-2、MMP2和MMP9蛋白水平的表达变化。图16为荧光素酶报告基因实验检测miRNA_20a和miR-106a分别对TIMP-2的直接调控作用*P <0.05。图17为生物信息学预测的miRNA_20a和miR_106a与TIMP-2的结合位点的截图。附图中U87具体为胶质瘤细胞系U87，Casel具体指原代胶质瘤细胞CaSel，CaSe2 具体指指原代胶质瘤细胞Case2 ；miR为miRNA的简写。
具体实施例方式实施例1胶质瘤干细胞1 材料原代人胶质瘤细胞的培养新鲜胶质瘤组织取自西南医院和大坪医院(重庆市第三军医大学)神经外科，先后共取2例，均为多形性胶质母细胞瘤(WHO IV级)。原代胶质瘤组织块用0. OlM PBS清洗3次，仔细去除表面纤维和坏死组织；将组织块浸入少量DMEM培养基(美国Gibco公司) 中，并用眼科剪将肿瘤组织块反复剪切至Imm3的碎块；加入混合胶原酶(美国Gibco公司) 消化20 30分钟；边消化边用移液器吹打，获得单细胞悬液，置于DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清)中培养；对小时后换液除去红细胞，待细胞长至80% 90%时用于分选CD133+细胞。胶质瘤细胞系的培养人胶质瘤细胞系U87来自美国菌种保藏中心(ATCC)，保藏号为HTB-14 。人胶质瘤细胞系U87用含体积分数为10%胎牛血清(美国Gibco公司)的DMEM培养基，置37°C、 体积分数为5%C02孵箱(相对湿度为95%)中培养。细胞换液时间为2 3天，传代时间为3 5天，传代前用质量分数为0. 25%胰蛋白酶+质量分数为0. 02% EDTA(美国Sigma 公司)混合消化液消化2 4分钟。2⑶133+细胞的分离和培养原代胶质瘤细胞和胶质瘤细胞系U87长至80% 90%时，PBS清洗3次；加入胰蛋白酶+EDTA消化液消化5分钟，轻轻吹打使细胞脱落，成单细胞悬液；收集细胞悬液， IOOOrpm离心5min ；弃去上清，PBS清洗2次，IOOOrpm离心5min ；用流式Buffer将细胞浓度稀释为2X107ml ；每100 μ 1细胞悬液加入10 μ 1 CD133/2-PE抗体(德国Miltenyi公司)，对照组只加10 μ 1流式Buffer ；4°C避光孵育30min，每IOmin吹打混勻一次，避免细胞沉淀；用10倍体积PBS稀释上述各组细胞悬液，洗涤2次后，IOOOrpm离心5min ；用流式Buffer重悬细胞使浓度为2X 107ml，上流式细胞分选仪(美国Becton and Dickinson 公司)进行检测和分选；分选后，用含有B27 (1 X，美国Gibco公司)、bFGF(20ng/ml，美国 Upstate公司)和EGFQOng/ml，美国Sigma公司)的DMEM/F12 (美国Gibco公司)干细胞完全培养基重悬后培养，换液和传代均采取半量换液方式。如图1所示，流式细胞技术检测分选前，CD133+细胞占胶质瘤细胞系U87以及原代胶质瘤细胞Casel、Case2的比例分别为0. 5%、2. 4%和1.5%。分选后回测，⑶133+细胞比例高达95%以上，⑶133—细胞中⑶133的表达在以下。3免疫荧光染色将流式细胞技术检测分选所得到的5X IO4个⑶133—细胞和⑶133+细胞接种于 DMEM/F12干细胞完全培养基中。免疫荧光染色检测培养的CD133+细胞中干细胞标记物 ⑶133和nestin的表达。固定好的各组细胞片用0. OlM PBS水化，5minX 3次；滴加山羊血清(北京中杉金桥公司)37°C，封闭30min，吸去多余血清，勿洗；各组分别滴加小鼠抗人 CD133单克隆抗体(1 100，德国Miltenyi公司)、小鼠抗人nestin单克隆抗体(1 100， 美国Chemicon公司)，4°C过夜；0. OlM PBS洗涤5minX3次；各组分别滴加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(l 100，美国Molecular ftObes公司)，37°C孵育30min后，吸去多余二抗液体，勿洗；滴加20 μ 1 DAPI (美国Sigma公司)室温孵育IOmin ;0. OlM PBS洗涤5minX3 次；滴加少许封片剂，反扣在载玻片上，注意勿产生气泡，激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)下观察，免疫荧光染色显示，分选出的CD133+细胞广泛表达神经干细胞标记物CD133 和nestin如图3所示。免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察，DAPI标记细胞核，标尺= 50 μ m04⑶133+细胞成球培养和分化将分选得到5 X IO4个⑶133_细胞和⑶133+细胞接种于DMEM/F12干细胞完全培养基中培养，观察⑶133—细胞和⑶133+细胞形成细胞球的能力。将⑶133+细胞形成的细胞球接种于DMEM培养基(含质量分数为10%胎牛血清)中进行诱导分化，7天后用免疫荧光染色方法检测分化细胞中GFAP、β -tubulin III和MBP的表达。固定好的各组细胞片用0. OlM PBS水化，5minX3次；滴加山羊血清37°C，封闭30min，吸去多余血清，勿洗；各组分别滴加兔抗人GFAP多克隆抗体(1 100，美国Dako公司)、兔抗人MBP多克隆抗体(1 100，美国 Chemicon公司)和小鼠抗人β-tubulinIII单克隆抗体(1 100，美国Chemicon公司)， 4°C过夜；0. OlM PBS洗涤5minX3次；各组分别滴加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(l 100， 美国 Molecular Probes 公司)、FITC标记的山羊抗兔 IgG(l 100，美国 Molecular Probes 公司)、Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(l 500，美国Molecular Probes公司)、Cy3标记的山羊抗兔IgG(l 500，美国Molecular ftObes公司)，37°C孵育30min后，吸去多余二抗液体，勿洗；滴加20 μ 1 DAPI室温孵育IOmin ；0. OlM PBS洗涤5minX3次；滴加少许封片剂， 反扣在载玻片上，注意勿产生气泡，普通光学显微镜和激光共聚焦显微镜下观察。有图2所示，在光学显微镜下观测⑶133+细胞于3 4天开始形成细胞球，7 10天后70% 80%⑶133+细胞形成克隆性生长的细胞球，它们呈圆形或卵圆形，类似神经干细胞球，边界清楚，呈悬浮生长，折光性好，与现有技术报道一致。在相同培养条件下，大部分CD133_细胞于6小时左右贴壁，24小时左右可见分化的细胞，细胞呈梭形，与常规条件培养下的亲代细胞相似，培养3 4天后，细胞开始逐渐死亡。如图4所示，光学显微镜观察，将CD133+细胞球接种于DMEM培养基(含体积分数为10%胎牛血清)中，细胞球约6小时左右开始贴壁，16小时左右细胞球外侧细胞最先发生分化，分化的细胞呈梭形生长；培养3天左右细胞球变小，内侧细胞开始分化；培养7天后，细胞球中大部分细胞发生分化。免疫荧光染色显示，这些细胞可表达星形胶质细胞标志物GFAP，少突胶质细胞标志物MBP和神经元标志物β -tubulinlll，如图4所示。
实施例2移植瘤动物模型的建立1实验动物来源实验用动物4 6周龄的雌性裸鼠，体重15 20g，由第三军医大学实验动物中心提供，标准条件饲养。2实验分组实验共分3组，每组5只，第一组为U87-⑶133_细胞和U87-⑶133+细胞组；第二组为原代Casel-CD133.细胞和原代Casel_CD133+细胞组；第三组为原代Case2_CD133W细胞和原代Case2-CD133+细胞组。3皮下移植瘤模型皮下移植瘤模型用于分析GSCs成瘤能力。5X104个⑶133+细胞(来源于U87 细胞系和原代胶质瘤细胞)和CD133—细胞(来源于U87细胞系和原代胶质瘤细胞)，悬于 100 μ 1 PBS中，分别注射于4 6周龄裸鼠左、右腹股沟下。接种后，动物全部饲养于SPF 级环境中，每周观察移植瘤大小，共观察6周。由图5和图6所示，体内成瘤实验显示，无论是U87细胞还是原代胶质瘤标本来源的⑶133+细胞成瘤能力显著高于⑶133_细胞，⑶133_细胞几乎不成瘤。实施例3GSCs和GCs的体外侵袭研究GSCs和GCs侵袭能力的差异，我们采用Transwel 1体外侵袭实验观察了 GSCs 和GCs的侵袭能力。Transwell体外侵袭实验共分为2组，分别为GSCs组和GCs组，具体操作步骤为将细胞弃去培养基，PBS洗涤细胞3次；贴壁细胞用胰蛋白酶+EDTA消化液消化后离心，悬浮细胞直接离心后，用培养基重悬，调整细胞浓度为5XlO5Ail ；拆开transwell 小室(美国BD公司)包装，用无菌镊子夹出transwell小室放入M孔板中；吸取10 μ 1 Matrigel胶(美国BD公司)混合液铺胶于transwell膜上，注意铺注均勻，动作迅速且温和，Matrigel胶于37°C会迅速凝固；将铺好胶的小室连同M孔板一起放入37°C培养箱 30min ；在小室下室加入500 μ 1完全干细胞培养基，注意下室培养基与小室间不要有气泡产生；分别向小室上室内加入100 μ 1上述各组细胞悬液，放入37°C培养箱孵育；24小时取出U87细胞和干细胞，48小时取出原代胶质瘤细胞和干细胞，将小室内的上室和下室培养基吸出，PBS洗涤3次；加入下室500μ 1 4%多聚甲醛，固定20min ；PBS洗涤3次，每次 5min ；小室下室加入结晶紫(上海科兴生物科技有限公司)500 μ 1，染色20min ；染色完毕后，用自来水清洗终止染色，注意不能剧烈摇动小室，以免膜上细胞脱落，清洗4次；在显微镜下观察和计算穿过小室的细胞数目。如图7、8示，来源于U87细胞系的GSCs穿过小室的细胞数目平均为360个左右， 而对应的GCs穿过小室的细胞数目平均仅为20个左右；来源于原代胶质瘤细胞Case 1的 GSCs穿过小室的细胞数目平均为250个左右，而对应的GCs穿过小室的细胞数目平均仅为 21个左右；来源于原代胶质瘤细胞Case 2的GSCs穿过小室的细胞数目平均为309个左右， 而对应的GCs穿过小室的细胞数目平均仅为52个左右。由此可见，GSCs侵袭的数量显著多于 GCs (P < 0. 05)。实施例4miRNA_106a在GSCs和GCs中的表达差异ImicroRNA 芯片采用Trizol试剂(美国^witrogen公司)按其操作说明书从CD133_细胞和CD133+细胞中提取总RNA。采用酶标仪测定RNA浓度。然后将提取的总RNA送往上海康成生物工程有限公司，进行microRNA芯片检测(miRCURY LNA microRNA array (v. 10. 0)，丹麦 Exiqon Life Sciences 公司)。采用miRNA高通量芯片技术对人胶质瘤细胞系U87和原代胶质瘤标本来源的GSCs 和GCs进行检测，总共638条成熟miRNA的探针。U87细胞系来源的GSCs和GCs中有62个 miRNA表达有显著差异，其中59个显著上调，3个显著下调；原代胶质瘤标本来源的GSCs和 GCs中有95个miRNA表达有显著差异，其中75个显著上调，20个显著下调。从中筛选出在 U87细胞系和原代标本中表达均有显著差异(fold彡1. 5)的miRNA共15条，均为在GSCs 中表达上调的miRNA，下调的miRNA无交集(表1)。miRNA-20a j^^lj (SEQ ID NO 11) 5' -uaaagugcuuauagugcagguag-3‘miRNA-106a j^^lj (SEQ ID NO 12) 5' -aaaagugcuuacagugcagguag-3'表IGSCs和GCs中表达有显著差异的miRNAs
权利要求
1.miRNA-106a在制备胶质瘤干细胞侵袭促进剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于miRNA-106a在制备TIMP-2抑制剂中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于miRNA-106a在制备MMP2促进剂中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于miRNA-106a在制备MMP9促进剂中的应用。
5.miRNA-106a的抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭抑制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述miRNA-106a为TIMP-2的抑制剂。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述miRNA-106a为MMP2促进剂。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述miRNA-106a为MMP9促进剂。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述miRNA-106a的抑制剂为 Anti-miRmiRNA-106a inhibitors。
全文摘要
本发明涉及医学领域，特别涉及胶质瘤干细胞侵袭行为调控的调控剂，其技术方案为miRNA-106a在制备胶质瘤干细胞侵袭促进剂中的应用；miRNA-106a的抑制剂在制备胶质瘤干细胞侵袭抑制剂中的应用；miRNA-106a在GSC中的表达显著高于GC，TIMP-2无论mRNA水平还是蛋白水平在GSC中的表达显著低于GC；miRNA-106a的抑制剂可以明显抑制GSC的侵袭能力；抑制miRNA-106a的表达后，TIMP-2mRNA水平和蛋白水平的表达显著升高，荧光素酶报告基因实验证实miRNA-106a不仅可以负调控TIMP-2的表达，而且是通过和TIMP-2的3’UTR相结合的方式直接调控TIMP-2的表达。
文档编号C12N5/095GK102321585SQ20111023152
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月12日 优先权日2011年8月12日
发明者卞修武, 王喆, 王斌 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院