专利名称：一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。
背景技术：
青蒿素是中国科学家首次从青蒿(Artemisia annua)中分离鉴定的一种含过氧桥的倍半萜内酯，是目前最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。以青蒿素为基础的综合疗法已受到世界卫生组织和西方国家的确认和推荐。青蒿中青蒿素含量低(0. 01-1 %干重)，且受品种和地域性种植影响大，资源紧缺。在青蒿素生物合成中，倍半職成分紫穗槐二烯(Amorphadiene, Amorpha-4,11-diene)由青蒿中的紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase ；ADS)催化 FPP 环化形成，它是青蒿酸和青蒿素生物合成的共同前体。增加紫穗槐二烯的产量可以促进青蒿酸和青蒿素的合成和积累。人工全合成青蒿素工艺复杂、成本高。因此，目前世界上青蒿素原料主要依靠从野生和栽培青蒿中直接提取。青蒿素生物合成途径研究近年来取得许多进展，已经克隆了紫穗槐二烯合酶(ADS)、青蒿酸合成酶(CYP71AV1)和青蒿醛还原酶Dbr2。科学家们利用代谢工程技术尝试通过微生物发酵合成青蒿素前体青蒿酸，然后通过有机半合成生产青蒿素，以降低青蒿素的生产成本。2006年，Jay Keasling对酵母菌进行了遗传工程改造，使之产生出高水平的青蒿酸。目前认为，利用微生物生产青蒿酸是一个切实可行的方法，可以降低青蒿素的生产成本。另外，也可以通过转基因植物过量表达青蒿素生物合成的相关基因，以期提高代谢产物的含量。发酵工程菌种的遗传改造需要将青蒿酸生物合成途径中的基因ADS和CYP701AV1整合到工程酵母或者工程细菌染色体中。并且，ADS的酶活性直接关系到青蒿酸的生物合
成的产量。因此，如何有效地提高ADS的酶活性是本领域需要深入研究的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。在本发明的第一方面，提供一种突变型紫穗槐二烯合酶，其对应于SEQ IDNO 2(野生型)氨基酸序列的第399位由苏氨酸突变为丝氨酸。在另一优选例中，该蛋白是(a)具有SEQ ID NO :3(突变型)所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个 ’较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO 3第399位位置的氨基酸为丝氨酸。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组
(i)编码所述的突变型紫穗槐二烯合酶蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的多肽。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的宿主细胞是酵母、细菌或植物细胞。更优选地，所述的宿主细胞是大肠杆菌。在本发明的另一方面，提供一种生产突变型紫穗槐二烯合酶的方法，包括步骤
(I)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离突变型紫穗槐二烯合酶。在本发明的另一方面，提供所述的突变型紫穗槐二烯合酶的用途，用于生产紫穗槐二烯和/或青蒿酸。在本发明的另一方面，提供一种生产紫穗槐二烯的方法，所述的方法包括利用所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)环化,从而获得紫穗槐二烯。在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化FPP环化在胞内或胞外进行。在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸环化在胞内进行，包括步骤将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而生产紫穗槐二烯。在另一优选例中，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸环化在胞内进行，包括步骤将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因以及法尼基焦磷酸产生酶(MVA/MEP途径中的酶；选自但不限于乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、5-磷酸-D-I-脱氧木酮糖合成酶5-磷酸-D-I-脱氧木酮糖还原异构酶、异戊烯二磷酸异构酶、5-磷酸-D-I-脱氧木酮糖合成酶、5-磷酸-D-I-脱氧木酮糖还原异构酶、4-磷酸-2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸合酶、2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸激酶、2C-甲基赤藓醇_2，4-焦磷酸合酶、I-羟基-2-甲基-2- 丁烯-4-焦磷酸合酶、I-羟基-2-甲基-2- 丁烯-4-焦磷酸还原酶、FPP合成酶、I-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶、HMG-CoA还原酶、香叶基转移酶等)的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而生产紫穗槐二烯。在本发明的另一方面，提供一种生产青蒿酸的方法，所述的方法包括将所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因，法尼基焦磷酸产生酶(MVA/MEP途径中的酶)编码基因，青蒿酸合成酶编码基因，细胞色素P450还原酶编码基因转化入宿主细胞；培养该细胞，从
而生产青蒿酸。在另一优选例中，还包括将获得的青蒿酸通过有机半合成生产青蒿素。在另一优选例中，在25_45°C下培养所述的细胞。在另一优选例中，在35-43°C下培养所述的细胞；更佳地，在38-42°C下培养所述的细胞。
在另一优选例中，在PH下6. 0-10. 5下培养所述的细胞。在另一优选例中，在PH下8. 5-10下培养所述的宿主细胞；更佳地，在PH下9-10下培养所述的宿主细胞；最佳地为PH9. 8。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、ADS及突变克隆的序列对比结果。从结果中可以看出，399位氨基酸残基T突变成了中性氨基酸残基S、A、N，和带电荷的氨基酸残基R、D0图2、ADS及其突变体的GC-MS图。A-F分别代表野生型和不同突变体GC-MS图；G和H分别代表E图和F图的放大图。I显示了 a-Gur junene (I)和Zingiberene (2)的结构图。其中AMO代表紫穗槐二烯。 图3、温度(上图)、pH(下图)对野生型和突变体ADS(T399S)活力的影响。
具体实施例方式本发明人经过长期的研究，意外地获得了一种突变型紫穗槐二烯合酶，所述的突变型紫穗槐二烯合酶在保持催化产物不变的情况下，酶活性大大高于野生型。基于此完成了本发明。本发明的多肽(突变型紫穗槐二烯合酶)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括突变型紫穗槐二烯合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的突变型紫穗槐二烯合酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是a)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或ai)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或an)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“突变型紫穗槐二烯合酶”或“突变型紫穗槐二烯合酶蛋白”指具有突变型紫穗槐二烯合酶活性的SEQ ID NO :3序列的多肽。该术语还包括具有与突变型紫穗槐二烯合酶相同功能的、SEQ ID NO :3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变型紫穗槐二烯合酶的活性片段和活性衍生物。但是，这些变异形式中，对应于SEQ ID N0:2氨基酸序列第399位的氨基酸为丝氨酸。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与所述的突变型紫穗槐二烯合酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗突变型紫穗槐二烯合酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含突变型紫穗槐二烯合酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了突变型紫穗槐二烯合酶蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有突变型紫穗槐二烯合酶序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。 发明还提供突变型紫穗槐二烯合酶或多肽的类似物。这些类似物与所述的突变型紫穗槐二烯合酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。但是，这些多肽类似物中，对应于SEQ IDNO 2氨基酸序列第399位的氨基酸为丝氨酸。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“突变型紫穗槐二烯合酶的保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个(如I个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I
权利要求
1.一种突变型紫穗槐二烯合酶，其对应于SEQ ID NO :2氨基酸序列的第399位由苏氨酸突变为丝氨酸。
2.如权利要求I所述的蛋白，其特征在于，该蛋白是 (a)具有SEQID NO 3所不的氣基酸序列的蛋白；或 (b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO :3第399位上的氨基酸为丝氨酸。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组 (i)编码权利要求I或2所述的突变型紫穗槐二烯合酶蛋白的多核苷酸；或 (ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQIDNO 3所示氨基酸序列的多肽。
5.—种载体，其特征在于，它含有权利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或基因组中整合有权利要求3或4所述的多核苷酸。
7.—种生产突变型紫穗槐二烯合酶的方法，其特征在于，包括步骤 (1)培养权利要求6所述的宿主细胞，获得培养物；和 (2)从培养物中分离突变型紫穗槐二烯合酶。
8.权利要求I所述的突变型紫穗槐二烯合酶的用途，用于生产紫穗槐二烯和/或青蒿酸。
9.一种生产紫穗槐二烯的方法，其特征在于，所述的方法包括利用权利要求I所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸环化，从而获得紫穗槐二烯。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的突变型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸环化在胞内进行，包括步骤将权利要求I所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而生产紫穗槐二烯。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，还在所述的宿主细胞中转化法尼基焦磷酸产生酶的编码基因。
12.—种生产青蒿酸的方法，其特征在于，所述的方法包括将权利要求I所述的突变型紫穗槐二烯合酶的编码基因，法尼基焦磷酸产生酶的编码基因，青蒿酸合成酶编码基因，细胞色素P450还原酶编码基因转化入宿主细胞；培养该细胞，从而生产青蒿酸。
13.如权利要求7、9-12任一所述的方法，其特征在于，在25-45°C下培养所述的细胞。
14.如权利要求7、9-12任一所述的方法，其特征在于，在PH下6.0-10. 5下培养所述的细胞。
全文摘要
本发明涉及一种酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体及其应用。所述的紫穗槐二烯合酶突变体在保持催化产物不变的情况下，酶活性大大高于野生型。与传统方法相比，采用本发明的青蒿紫穗槐二烯合酶突变体酶促生产青蒿素的效率高且成本低。
文档编号C12P17/18GK102732499SQ20111028501
公开日2012年10月17日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年4月2日
发明者李建戌, 杨长青, 毛颖波, 洪高洁, 王凌健, 胡文利, 阮菊新, 陈晓亚 申请人:中国科学院上海生命科学研究院