专利名称：狂犬病病毒优势表位肽抗原及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于狂犬病疫苗技术领域，具体涉及狂犬病病毒优势表位肽段抗原及其用途。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus, RV)引起的自然疫源性、高度致死性人兽共患传染病，该病呈全球性分布。狂犬病病毒可以引起人和多种动物致死性中枢神经系统感染，狂犬病临床表现主要为恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等，病死率几乎为100%。全世界每年因狂犬病死亡的人数大约55000人，是迄今为止病死率最高的急性传染病。印度是狂犬病流行最严重的国家，中国的狂犬病例数仅次于印度，居世界第二位。狂犬病病毒属于弹状病毒科(rhabdoviridae)，狂犬病病毒属(lyssa virus)，呈子弹状。狂犬病病毒可通过破损的皮肤或黏膜侵入人体，经神经末梢上行进入人及所有温血动物中枢神经系统(CNQ而引发狂犬病。狂犬病病毒基因组核酸为不分节段的单股负链RNA，由11拟8或11932个核苷酸组成，相对分子量约4.6 X 106，3'到5'端依次排列着N、P、M、G、L基因，分别编码5种结构蛋白核蛋白(nucleoprotein，NP)、磷酸化蛋白 (phosphoprotein，PP)、基质蛋白(matrix protein, MP)、糖蛋白(glycoprotein, GP)禾口转录酶大蛋白(large protein,LP) 0完整的狂犬病病毒颗粒由核衣壳和包膜两部分构成，核衣壳由核蛋白、磷蛋白和转录酶大蛋白构成，而包膜由糖蛋白和基质蛋白构成。近年来，随着人民生活水平的提高，犬、猫作为宠物大量进入城市家庭，我国狂犬病发病率呈上升趋势，死亡率居传染病首位，至今尚无有效的治疗方法，一旦被犬类咬伤后，迅速接种疫苗可快速刺激机体产生免疫反应。但由于现有疫苗的质量、使用方法及人群个体差异等各种原因影响，并非所有人群免疫后均产生保护性抗体。因此，需要建立一种用于狂犬病毒抗体检测方法，对免疫犬和免疫人群进行血清学检测，评价疫苗的免疫效果。评价疫苗优劣的方法是疫苗免疫机体后能否产生足够的抗体，以及疫苗免疫后在免疫期内能否抵抗致死性强毒的攻击。当前国际认可检测狂犬病抗体的方法有多种，如荧光抗体病毒中和试验(FAVN)、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)、小鼠病毒中和试验(MNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。FAVN、RFFIT等方法检测狂犬病抗体至少需要96h，MNT法检测狂犬病抗体需要21d，这几种方法都需要活病毒和培养细胞，操作繁琐，对操作者的操作技能要求较高，存在生物安全和人为判读误差的问题。此外，荧光抗体质量优劣，如抗体的特异性、荧光素的标记、操作人员对该方法的掌握程度都可以对荧光抗体病毒中和试验造成很大的影响，甚至影响判读结果。ELISA方法不需要特殊的实验室设备和条件；操作简单安全，不需要活病毒；快速，只需2 4h就可以检测出疫苗接种后血清样品中的狂犬病病毒抗体；不需要操作人员主观判断，通过酶标板读数，避免出现人为判读误差。临床所采用的ELISA抗体检测方法都是采用全病毒裂解抗原或全长G蛋白抗原进行包被的，存在假阴性率高、灵敏度低、特异性
差等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种狂犬病病毒优势表位肽抗原。本发明的目的还在于提供编码上述狂犬病病毒优势表位肽抗原的基因。本发明的目的还在于提供含有狂犬病病毒优势表位肽抗原基因的原核表达载体。本发明的目的还在于提供含上述原核表达载体的基因工程菌。本发明的目的还在于提供狂犬病病毒优势表位肽抗原在制备用于评价狂犬疫苗免疫效果的试剂中的用途。一种狂犬病病毒优势表位肽抗原，所述抗原为如下(a)或(b)所示的蛋白质(a)由序列表中 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 5 或 SEQ IDNO. 6 所示的氨基酸序列组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有狂犬病病毒表位肽抗原活性的由(a)衍生的蛋白质。对所选择狂犬病病毒优势表位肽抗原进行适当的修饰仍然具有检测效果。例如对其中个别氨基酸进行保守替换、增加或缺失，个别氨基酸指少于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸。保守氨基酸替换的实例例如Ala、Val、Leu和Ile间的替换；Ser和Thr间的替换； 酸性残基Asp和Glu间的替换；Asn和Gln间的替换；和碱性残基Lys和Arg间的替换；或者芳香族残基Phe和Tyr间的替换。编码狂犬病病毒优势表位肽抗原(a)或(b)的基因(a)由序列表中 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 5 或 SEQ IDNO. 6 所示的
氨基酸序列组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有狂犬病病毒表位肽抗原活性的由(a)衍生的蛋白质。含狂犬病病毒优势表位肽抗原基因的原核表达载体。所述原核表达载体为pBVILl、pGEX-4T-2或pET48a。含上述原核表达载体的基因工程菌。所述基因工程菌为大肠杆菌。狂犬病病毒优势表位肽抗原在制备用于评价狂犬疫苗免疫效果的试剂中的用途。本发明的有益效果本发明利用生物信息学软件筛选优势表位抗原区段，通过 PCR扩增出优势表位抗原区段编码基因，并在大肠杆菌中高效表达，获得高纯度抗原，经间接ELISA实验证明所获得的抗原能够检测免疫人或犬血清中的保护性抗体。采用基因工程表达优势表位肽段抗原替代全病毒抗原提高检测的特异性，组合应用多种特异性抗原进行检测，显著提高检测的敏感性。
图1是狂犬病病毒G蛋白表位预测分析图。图2是狂犬病病毒N蛋白表位预测分析图。图3是狂犬病病毒8种表位肽段抗原纯化后SDS-PAGE电泳图；其中1为NP-I抗原，2为NP-2抗原，3为NP-3抗原，4为NP-4抗原，5为GP-1抗原，6为GP-2抗原，7为GP-3抗原，8为GP-4抗原，M为蛋白分子量标准。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而不应构成对本发明实施范围的限定。实施例中未注明具体条件的实验方法，参见《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002，第 1217-1270页。适宜的原核表达载体pBVILl、pEGX购买自Amersham Pharmacia公司、pET 系列原核表达载体购买自Novagen公司、pI^rxFus系列原核表达载体购买自hvitrogen公司。实施例1 狂犬病毒优势表位抗原区段的确定利用BIOSUN生物学分析软件分别分析狂犬病毒G蛋白和N蛋白的表位分布情况， 首先输入其氨基酸序列，然后寻找B细胞表位，所得表位分布图如图1和图2所示。根据表位分布情况确定特异性优势表位抗原区段，分别为优势表位区段GP-I (l-200aa)，氨基酸序列为SEQ ID NO :1 ；优势表位区段GP-2(301-400aa)，氨基酸序列为SEQ ID NO :2 ；优势表位区段GP-3 (60-230aa)，氨基酸序列为SEQ ID NO 3 ；优势表位区段GP_4 (231-345aa)， 氨基酸序列为SEQ ID N0:4;优势表位区段NP-l(301-420aa)，氨基酸序列为SEQ ID N0:5 ；优势表位区段NP-2^)-180aa)，氨基酸序列为SEQ ID NO :6;优势表位区段 NP-3Q55-315aa)，氨基酸序列为SEQ ID NO 7 ；优势表位区段NP-4 (342_450aa)，氨基酸序列为 SEQ ID NO :8ο实施例2 狂犬病毒优势表位肽段抗原编码基因的克隆1、引物设计根据G蛋白和N蛋白的全长核苷酸序列和8种优势表位肽段抗原的核苷酸序列分别设计并合成了上下游引物，所使用的限制性内切酶分别为》io I.Xba I.BamH I或EcoR I。用于扩增G蛋白全长基因的引物为GF和GR，核苷酸序列分别如SEQ IDNO :9和SEQ ID NO 10 所示；用于扩增N蛋白全长基因的引物为NF和NR，核苷酸序列分别如SEQ IDNO :11和 SEQ ID NO 12 所示；用于扩增优势表位区段GP-I编码基因的引物为GF-I和GR-200，核苷酸序列分别如 SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 14 所示；用于扩增优势表位区段GP-2编码基因的引物为GF-301和GR-400，核苷酸序列分别如 SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 所示；用于扩增优势表位区段GP-3编码基因的引物为GF-60和GR-230，核苷酸序列分别如 SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO 18 所示；用于扩增优势表位区段GP-4编码基因的引物为GF-231和GR-345，核苷酸序列分别如 SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO 20 所示；用于扩增优势表位区段NP-I编码基因的引物为NF-301和NR-420，核苷酸序列分别如 SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO 22 所示；用于扩增优势表位区段ΝΡ-2编码基因的引物为NF-20和NR-180，核苷酸序列分别如 SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24 所示；用于扩增优势表位区段NP-3编码基因的引物为NF-255和NR-315，核苷酸序列分别如 SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 所示；用于扩增优势表位区段NP-4编码基因的引物为NF-342和NR-450，核苷酸序列分别如 SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 28 所示。2、狂犬病病毒总RNA提取取狂犬病疫苗1支，加溶解液0. 3ml，于离心管中，加Trizol 0. 7ml混均，加入氯仿250 μ 1，室温放置5分钟，12000rpm离心4°C 15分钟，取上清于另一离心管中，加入等体积异丙醇放置室温10分钟，离心12000rpm 4。C 10分钟，弃上清，用75%乙醇洗一次，离心 12000rpm 4°C 10分钟，晾干后加入50 μ 1 DEPC水溶解，_20°C保存。3、狂犬病病毒cDNA获得反应体系总体积为13 μ 1，其中 DEPC 7jC 10 μ 1、RNA 1 μ l、25mMol dNTP 1 μ 1、随机引物 1 μ 1，65°C水浴 5 分钟，冰浴 1 分钟。加入 5XBuffer 4μ 1,0. IM DTT 1 μ 1、Rnasin 1 μ 1、逆转录酶1 μ 1，DEPC水20 μ 1，50 V水浴60分钟，70 V水浴15分钟，冰浴1分钟。4、PCR扩增法获得目的基因双蒸水34μ IUOXBuffer 5 μ 1, DMSO 2. 5 μ l,25mMol dNTP 4μ1、弓| 物 GF 禾口 GR(或者引物NF和NR)各1 μ 1、cDNA 2 μ 1、Tag酶0. 5 μ 1混均后用以下条件进行95°C 预变性2分钟，95°C 30 45秒、58°C 30 90秒、72°C 30 90秒，35个循环，72 °C 5分钟，4°C保存。琼脂糖电泳证明获得了 G蛋白和N蛋白全长基因片段，长度分别为1575bp和 1353bp。以G蛋白和N蛋白全长基因为模板，加入相应引物(GF-1和GR-200扩增GP-1， GF-301 和 GR-400 扩增 GP_2，GF-60 和 GR-230 扩增 GP_3，GF-231 和 GR-345 扩增 GP_4，NF-301 和 NR-420 扩增 NP-I，NF-20 和 NR-180 扩增 NP-2，NF-255 和 NR-315 扩增 NP-3，NF-342 和 NR-450扩增NP-4)扩增优势表位肽段抗原编码基因，琼脂糖电泳证明获得了 8种优势表位肽段抗原的编码基因，长度分别为 600bp (GP-I)、300bp (GP-2)、513bp (GP-3)、345bp (GP-4)、 360bp (NP-I) ,483bp (NP-2) U83bp (NP-3)和 327bp (NP_4)。测序由中美泰和生物技术有限公司完成，序列正确的克隆连接入经相同酶切的pBVILl、pGEX-4T-2或pET48a，成功构建原核表达载体。实施例3 狂犬病毒优势表位肽段抗原的表达和纯化用所得到的重组质粒转化大肠杆菌菌株，热诱导表达，收集菌体，将沉淀称湿重， 用10倍体积的20mmol/L pH8. OTE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(lmg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。 8°C，1，2000rpm,离心20分钟，弃上清，沉淀用lmol/LNaCl (用TE配制)洗一次，再用TE洗2 次，收集沉淀。沉淀用溶解液(25mM Tirs-HClU% β -巯基乙醇、8M脲，PH 7.8)将其溶解， 上Ni-kpharose Fast Flow柱，分别用3个柱体积的结合缓冲液QOmM Tirs-HCl.O. 1% β-巯基乙醇、6M脲，PH 7. 8)、4个柱体积的洗涤缓冲液QOmM Tirs-HCUO. 1% β -巯基乙醇、6Μ脲，PH 6. 0)洗涤柱体，用25mM咪唑(洗涤缓冲液配制)洗杂蛋白，用250mM咪唑 (洗涤缓冲液配制)洗脱目的蛋白。将收集的洗脱峰G-50凝胶过滤TE、 0. 1% SDS, PH8. 5)，收集第一峰。经SDS-PAGE分析，结果表明8种优势表位肽段抗原在大肠杆菌中均获得了表达，经纯化后获得了纯度较高的目的抗原(图3)。
实施例4 狂犬病毒8种优势表位肽段抗原在狂犬疫苗免疫效果评价中的应用分别以8种狂犬病毒优势表位肽段抗原包被酶联板，以间接ELISA方法初步检测了 74份狂犬病毒免疫犬血清样本和20份未免疫犬血清样本，检测结果如表1和表2所示， 从表1和表2可以看出8种优势表位肽段抗原均能够检测出狂犬疫苗免疫犬血清中的抗体，其中GP-1、GP-2、NP-I和NP-2优势表位肽段抗原的检测活性明显高于其它4种，并且 GP-1、GP-2、NP-1和NP-2优势表位肽段抗原的检测活性彼此之间存在互补性。因此，GP-1、 GP-2、NP-1和NP-2抗原有望用于狂犬疫苗免疫效果评价。表1 8种优势表位肽段抗原对狂犬疫苗免疫犬血清抗体的检测(0D450nm)
权利要求
1.一种狂犬病病毒优势表位肽抗原，其特征在于，所述抗原为如下(a)或(b)所示的蛋白质(a)由序列表中SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示的氨基酸序列组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有狂犬病病毒表位肽抗原活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码如权利要求1所述蛋白质(a)或(b)的基因(a)由序列表中SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示的氨基酸序列组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有狂犬病病毒表位肽抗原活性的由(a)衍生的蛋白质。
3.含权利要求2所述基因的原核表达载体。
4.根据权利要求3所述的原核表达载体，其特征在于，所述原核表达载体为pBVILl、 PGEX-4T-2 或 pET-28a。
5.含权利要求3所述原核表达载体的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌。
7.权利要求1所述狂犬病病毒优势表位肽抗原在制备用于评价狂犬疫苗免疫效果的试剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了属于狂犬病疫苗技术领域的狂犬病病毒优势表位肽段抗原及其用途。本发明利用生物信息学软件筛选优势表位抗原区段，通过PCR扩增出优势表位抗原区段编码基因，并在大肠杆菌中高效表达，获得高纯度抗原，经间接ELISA实验证明所获得的抗原能够检测免疫人或犬血清中的保护性抗体。采用基因工程表达优势表位肽段抗原替代全病毒抗原提高检测的特异性，组合应用多种特异性抗原进行检测，显著提高检测的敏感性。
文档编号C12N15/47GK102329377SQ20111028460
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者何竞, 修冰水, 冯晓燕, 宋晓国, 张贺秋, 朱翠侠, 杨锡琴, 王国华, 陈堃 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所