专利名称：封闭式生物安全微生物快速接种器及匹配集成培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种封闭式生物安全微生物快速接种器及其匹配集成培养基的设计和使用方法。
背景技术：
细菌分离培养是进行细菌鉴定和药物敏感试验的基础。利用接种环分区划线以获取单个菌落，是经典的细菌接种方法。由于对仪器、设备等工作条件要求较低而便于推广， 该方法一直沿用至今。但该方法也存在一些弊端。首先，该方法对个人操作水平要求较高， 必须做到无菌操作，通过严格培训和长期操作实践才能获得理想分离效果；其次，在标本接种过程中需要点燃酒精灯、电炉等明火，用以接种环快速灭菌，而使用明火会对生物安全柜的气流产生影响，并且在处理挥发性物品和易燃物品时，易造成危险；再次，人工接种方法， 总体效率低，并受操作者个人水平和接种习惯影响，而且，同样的待检标本在不同的实验室所接种培养基的数量和种类也不尽相同，难以进行全程质量控制，不符合实验室对程序化、 标准化的要求；同时，多数微生物培养标本外观恶心、并伴有恶臭等异味，给操作者带来不愉快的感觉；另外，在预处理及接种过程中，标本完全暴露于空气中，操作者与标本近距离接触，自身健康受到威胁，不符合实验室生物安全越来越高的要求。目前，市场上有商品化一次性塑料平皿出售，消毒后采用真空包装，打开即可使用，比较方便。但这种一次性塑料平皿同时也存在一些缺陷，如，平皿与平皿盖密封效果差， 外包装一旦打开，必须一次用完，否则平皿易被污染，只能弃去而造成浪费；由于平皿开口大，在制备成平板后，即使真空包装，外包装一旦打开，放置2—8°C冰箱也不能长时间储存， 平板容易污染，琼脂中水分也易丢失，平板质量不稳定；同时，由于多数细菌初次分离培养过程中需要5%_10%的(X)2气体环境，因此，实验室采用二氧化碳孵育箱，外接1个装有(X)2压缩气体的钢瓶，源源不断地向孵箱输入(X)2气体。按照培养标本及时处理的原则要求，接到标本后要及时接种、及时孵育，这样就需要频繁地开关孵育箱，导致CO2气体大量外泄，尽管无色无味，但由于密度大于空气而不易消散，使得细菌室空气污浊；另外，接种标本后，平板需要在温箱中孵育18— Mh，在孵育过程中标本本身及生长的细菌容易在平皿内形成大量气溶胶。由于平皿盖密封效果差，培养基中气溶胶会扩散到整个孵育箱中，例如进行粪便培养时，打开孵育箱，会使整个实验室充满污浊的恶臭气体，对实验室内空气造成污染，长期吸入混合生物气溶胶和高浓度CO2的温湿气体，会给实验室工作人员的身体带来严重危害； 尤其是培养物含有一些能够引起烈性传染病的呼吸道病毒、细菌(如鼠疫耶尔森菌、炭疽杆菌、结核分枝杆菌等)、以及能够产生气生菌丝的病原性真菌(如曲霉菌)时，其气溶胶危害更大，实验室工作人员自身健康受到威胁，稍有不慎可能造成实验室感染或人群间传播，例如，SARS流行期间就曾经出现过严重的实验室内感染，带来灾难性后果。因此，近年来，实验室生物安全问题逐渐得到世界范围内多数国家卫生行政管理部门的高度重视。目前，除少数大型实验室配备全自动细菌分离培养系统外，国际市场上仅有少数几种自动化细菌接种仪投放市场，尽管自动化细菌接种仪能够提高工作效率，尽可能降低生物危害，但其价格极其昂贵，难以推广，尤其是在发展中国家更无法普及；其次，多数自动化细菌接种仪也存在一些缺陷。如，在接种过程中，完全打开的平皿暴露于空气中，易于受到周围空气中细菌污染，只能在生物安全柜中操作；其次，必须使用标准平板，琼脂的厚度、 平整度、表面光滑程度，以及有无空泡等，对接种效果的影响均很大；再次，在整个接种过程中使用的是同一根接种针，尽管每次接种后都进行快速清洗、消毒，但，由于部分细菌对消毒剂具有很强的抵抗力，尤其是能够形成芽胞的细菌，要在很短时间内彻底杀灭所有细菌， 几乎不可能；同时，由于标本自身的特点，在处理含杂菌量较大的粪便、痰液等粘稠性标本时，快速清洗、消毒很难完全杜绝交叉污染的发生；另外，接种针还有可能携带残余高浓度消毒剂，对后续标本中的细菌生长产生抑制。本发明的目的，是设计一种封闭式微生物快速接种器，并设计一种与其匹配集成培养基，使其生物安全性能大大提高。本发明采用完全创新的接种原理，利用活塞式喷雾器原理，在标本被封闭条件下，液态(或经液化处理)标本由于负压和虹吸作用进入封闭式接种器(也是标本杯)内的细导管后，在按压活塞产生的气体压强作用下从微孔喷出，遇到外部的空气被雾化，并直接喷涂到五面封闭的集成平板上，以达到接种目的而无需打开标本杯。被水雾直射区域的平板(平板中心区域)接种的标本量大，而远离直射的区域接种标本量少，仅雾状接种，从而实现将标本在平板上有层次展开，提高了标本在平板上的分散度。 中心区域接种了适量标本，保证检测灵敏度；而平板周围区采用雾状分散，可以得到足够的单个菌落；而且，在1个与其匹配的集成培养皿中，同时含有接种1份标本需要的全部培养基(3种或4种)，避免了频繁更换平板带来的麻烦，按压活塞即可以完成接种，10分钟可以轻松接种20份标本；同时，集成培养基配有螺旋式培养皿盖，可以方便地将接种后培养基完全密封起来，不让气溶胶外泄；经原创性科学设计，本集成培养基自带(X)2气体发生系统，无需放在(X)2孵育箱，也能够保证细菌可以在5%—10% CO2气体环境下培养，并且在整个培养过程中，CO2气体不会外泄；培养皿设有观察窗，观察培养结果时无需打开培养皿盖子。与现有同类仪器比较，本发明操作方便，无需特别培训，工作效率高；在细菌接种及培养过程中，不使用CO2孵育箱，不会污染实验室空气；培养基密闭性好，不会释放生物气溶胶， 具有清洁、无公害特点；接种器同时也是标本杯，节约资源，生产成本低廉，适合在各类微生物实验室推广、使用；小巧，携带方便，尤其适合野外现场采样、现场接种；符合生物安全要求，能够满足培养携带烈性传染性病原微生物特殊标本的安全要求。
发明内容
本发明内容包括封闭式微生物接种器及其匹配集成培养基设计及其临床应用方法三部分。第一部分封闭式微生物接种器组成及设计。本发明封闭式微生物接种器由4个部分组成，包括杯体(1个由PVC制作的外直径35mm、高75mm的圆柱体杯体，上部开口处有外螺旋，可以与第一层密封盖(红色)的内螺旋匹配旋紧密封)，第一层密封盖(1个带内螺旋的红色密封盖，内螺旋直径与杯体外螺旋匹配，而且，该密封盖顶部有外螺旋，可以与第二层密封盖(蓝色)的内螺旋匹配并可旋紧密封)，第二层密封盖(1个带内螺旋的蓝色盖子，内螺旋直径与红色密封盖顶部外螺旋匹配并可旋紧密封)，接种喷雾头(1个带内螺旋盖子的小型活塞式喷雾器的喷雾头，内螺旋直径与红色密封盖顶部外螺旋匹配，并可以旋紧密封，喷雾头下端连接吸液导管)。其中，杯体部分距离杯底IOmm处用防尘网设计一层隔离网(将采集的标本与杯底部分开，只允许已液化后、能通过纱网微孔的标本通过，以保证喷雾器部分畅通)，杯体中部设计1根上端开口、穿过隔离网并固定于杯底的导管，长70mm，直径IOmm 导管，位于隔离网以下的导管部分管壁上有孔，可以与杯体内隔离网以下部分自由相通；在第一层密封盖(红色)正对该导管上端的开口处，设计1个直径为5mm的开口，并以防水锡纸密封；第二层密封盖蓝色密封盖则完全密封；小型接种喷雾头，采用市售小型活塞式喷雾器喷雾头进行改造，主要是设计其盖子的内螺旋直径与红色密封盖顶部外螺旋匹配并可以密封，并使其下端所连吸液导管(长72mm，直径2. 5mm)正对红色密封盖上锡封处的中央；将用以喷雾的导管部分延长至12mm，喷雾嘴开口与该导管垂直，当右手持接种器进行接种时， 喷雾方向远离接种者。整个接种器的组装方式为，杯体以红色密封盖密封，红色密封盖上以蓝色密封盖再次密封，而小型接种喷雾头则单独包装，环氧乙烷消毒后真空包装一次性使用。杯体中可以根据需要加入不同的辅助液，使标本采集后即浸泡在辅助液中开始预处理， 如，在拟采集粪便等粘稠性标本的接种器中加入3ml无菌生理盐水；在拟采集痰液、气道分泌物的接种器中于送患者采集标本前加入3ml化痰液等。
附图给出本发明封闭式生物安全微生物快速接种器主要部件及结构示意图
图1本发明的封闭式生物安全微生物快速接种器标本采集状态结构示意图
图2本发明改进后的小型按压活塞式喷雾器的喷雾头结构示意图
图3本发明封闭式生物安全微生物快速接种器标本接种状态下结构示意图。第二部分，匹配集成培养基的设计及制备。本发明的集成培养基设计包括特制培养皿及培养基制备两部分。特制培养皿由一个四面体、具螺旋开口的培养皿及其匹配的平皿盖，以及(X)2气体发生系统3部分组成。培养皿主体部分为四面体，四面体最佳的长、宽、 高分别为长8cm、宽8cm，高12cm ；四个对称平面(长12mm，宽8mm)上均设计一个向平皿外部凸出的长方体，长8cm，宽6cm，厚4mm (如图2)，并分别标记；四面体培养皿的上平面向上隆起，设计一个向上凸出的圆形开口，外直径6cm，高2. 5cm，凸出的圆形开口部分的外侧有螺旋，可以与平皿盖内侧螺旋匹配并旋紧；平皿盖为圆形，内直径6cm，内高2. 0cm，内附一层大小适宜的软橡胶垫，有助于旋紧时不漏气；CO2气体发生系统的设计首先取适量吸水棉，用纱布包裹成团并压实(直径3cm)，以加热溶解后的明胶将其粘附在平皿盖内侧中央， 使其不影响平皿盖旋紧密封；称取Ig NaHCO3 (按照无结晶水计算)，以Iml无菌蒸馏水溶解，吸取0. 5ml，加到平皿盖内固定的吸水棉中央，待其自然干燥后，与培养皿一起以环氧乙烷消毒备用；以灭菌蒸馏水配制5N HCL备用。培养基制备方法。超净操作台内打开已消毒特制培养皿并使其平卧，此时培养皿的某标记面平贴台面，该面向外凸出的部分成为一个凹槽，以消毒移液管向其中准确加入15ml (注意勿使培养基溢出凹槽)已消毒、并冷却到 45— 50°C左右的某种含琼脂培养基(可以在原有培养基成分基础上加入适量明胶，以增加培养基对平皿的附着粘性)。待琼脂凝固后，将瓶子翻转一面，使另一面平贴桌面，同法加入另一种培养基；根据拟培养标本种类不同，可以选择加入不同的培养基组套，如痰液培养选择血平板、巧克力平板及中国兰平板；粪便培养选择SS平板(或XLD、麦康凯平板)、TCBS平板以及碱性4号平板；尿培养选择血平板、巧克力平板以及GC平板等组套；各种培养基浇注并凝固后，盖上平皿盖并旋紧，第4个凹槽一般不加入培养基而留作观察窗，置2—8°C冰箱保存。
附图给出本发明封闭式生物安全微生物接种器匹配集成培养皿的结构示意4本发明封闭式生物安全微生物接种器匹配培养皿的正视平面结构示意5本发明封闭式生物安全微生物接种器匹配培养皿部分横切面结构示意6本发明封闭式生物安全微生物接种器匹配培养皿盖结构示意图。第三部分闭式微生物接种器及其匹配集成培养基临床应用方法。将包装完好的接种器交给患者，嘱其小心打开下层红色密封盖，采集适量标本(注意勿使痰液等粘稠标本直接进入杯底固定的导管内)，旋紧密封盖后送检；打印标本条码并黏贴到待接种集成培养基上；打开待接种的接种器的第二层密封盖(蓝色)，将接种喷雾头下端吸液导管正对接种器红色密封盖上的锡封孔中部，垂直刺入至杯底并旋紧盖子；左手持培养基打开平皿盖并反扣在无菌操作台上，右手持接种器，将喷雾嘴伸入集成培养基中部并正对其中一种培养基，按下喷雾器活塞接种标本；将接种器旋转角度后，同法接种该平皿内其他2种培养基； 取滴管吸取0.5ml 5N HCL滴加于平皿盖内粘附的吸水棉中央，立刻盖上平皿盖并旋紧，放孵育箱培养即可。通常，从标本采集至运送到实验室已超过30分钟，因此，需预处理的标本在振荡器上震荡2分钟后也可以直接进行接种。本发明的优点。本发明是一种封闭式微生物快速接种器及其匹配集成培养基，突出优点是具有很高生物安全性和接种快速。利用活塞式喷雾器原理，淘汰了酒精灯和接种环；实现标本有层次展开，即保证检测灵敏度又可以得到足够单个菌落；接种器也是标本杯，密闭性操作更安全并减少标本带来的恶臭；采用不透明PVC生产接种器，可以避免因标本外观给操作者带来的恶心的感觉；集成培养基的应用，避免频繁更换平板带来的麻烦； 按压活塞即可以完成接种，10分钟可以轻松接种20份标本；同时，集成培养基的良好密闭性，观察培养结果也无需打开培养皿盖子，尽量减少气溶胶外泄。与现有同类仪器比较， 本发明操作方便，无需特别培训，工作效率高；培养基自带(X)2气体发生系统，应用HCL与 NaHCO3反应，可以使平皿内(X)2浓度迅速达到10%左右(NaHCO3略过量)，摒弃了 (X)2孵育箱， 不会造成CO2气体污染；培养基密闭性好，不会释放生物气溶胶，具有清洁、无公害特点；接种器同时也是标本杯，节约资源，成本低廉，平板外在质量对接种效果几乎没有影响，适合在各类微生物实验室推广、使用；小巧，携带方便，尤其适合野外现场采样、现场接种；符合生物安全要求，能够满足培养携带烈性传染性病原微生物特殊标本的安全要求。实现本发明的最佳方案是无色透明聚丙乙烯制成集成培养基的四面体培养皿部分，平皿盖部分由无毒塑料制备；以透明或不透明PVC制备成接种器，经环氧乙烷消毒后一次性使用；利用塑料制品工厂的基本设备，采用批量生产培养皿和接种器；对现有平板自动化浇注系统略加改造，即可实现集成培养基的自动化批量生产，以供应各类微生物实验室需求，这样就能更好地实现本发明的实用价值和经济价值。
权利要求
1.一种封闭式生物安全微生物快速接种器，其主要结构包括杯体、第一层密封盖、第二层密封盖以及接种喷雾头4个部分组成——其特征在于，接种器的杯体本身也是标本杯；——其特征在于，杯体、第一层密封盖、第二层密封盖可以组成一个密封的标本杯，三者中两两之间均是以螺旋相连接，并可以旋紧密封；——其特征在于，第一层密封盖、第二层密封盖以不同颜色标示，避免操作过程中出T曰；——其特征在于，接种器的杯体底部设计一层隔离网，将刚采集的标本与杯底部分开而又可以使其浸泡在预处理液中，只允许液化后能通过纱网微孔的标本通过，以保证喷雾器部分畅通；—其特征在于，接种器的杯体底部设计1根上端开口、穿过隔离网并固定于杯底的导管，隔离网以下的导管部分管壁上有孔，可以与杯体内隔离网以下部分自由相通；既保证了隔离网的隔离效果，又保障了喷雾吸液导管与隔离网下待接种标本的畅通—其特征在于，在第一层密封盖正对接种器杯体底部固定的导管上端开口处，设计1 个开口并以防水锡纸密封，既可以使杯体内部密封，接种时又允许喷雾吸液导管穿过；—其特征在于，在第一层密封盖上面增加了第二层密封盖，能够起到对第一层密封盖上开口锡纸密封处的保护，防止其在转运过程中受损—其特征在于，杯体、第一层密封盖、第二层密封盖既可以组成一个密封的标本杯， 又可以在根据需要，方便的打开任何一层；—其特征在于，接种器的杯体内可以根据需要提前加入预处理液，在采集到标本的同时已经开始了对标本的预处理，缩短了标本处理时间，提高了工作效率；一一其特征在于，它采用活塞式喷雾器原理进行标本接种，而不使用接种针或接种环接种标本，杜绝了接种针或接种环携带造成标本间交叉污染。
2.—种接种器的接种喷雾头，对普通活塞式小型喷雾器喷雾头进行改良；——其特征在于，接种器的接种喷雾头盖子的内螺旋直接与接种器第一层密封盖(红色)顶部外螺旋匹配，并可以旋紧密封；——其特征在于，接种器的接种喷雾头上盖子旋紧密封后，同时起到第二层密封盖的作用，使标本始终处于密封状态；——其特征在于，接种器的接种喷雾头单独存放，接种标本时安装，避免了在标本采集、转运时被污染；——其特征在于，接种器用以接种喷雾的导管部分延长，以便于深入5面封闭的培养皿内部进行接种，并减少对空气的污染；——其特征在于，手持接种器进行接种时，喷雾方向远离接种者，从而使接种更加安全。
3.一种集成培养基，其主要结构包括特制四面体培养皿、培养皿盖、培养皿内置CO2气体发生系统及培养基特殊组套；——其特征在于，四面体培养皿除其底平面和上平面外，其余四个平面上均设计一个向培养皿外部凸出的长方体，形成凹槽，用于浇注琼脂；——其特征在于，四面体培养皿三个侧面凹槽用于浇注培养基，第4个凹槽用于方便接种和观察培养结果的“观察窗”；——其特征在于，平皿盖内侧有螺旋与培养皿的圆形开口处匹配，内附软橡胶垫，有助于旋紧不漏气，可以使整个集成培养基密封；—其特征在于，培养皿内置(X)2气体发生系统，并固定于平皿盖内侧中央； ——其特征在于，应用HCL与NaHCO3反应，可以使平皿内(X)2浓度迅速达到要求，并使 NaHCO3略过量，摒弃了(X)2孵育箱；——其特征在于，先将HCL溶液固化于培养皿内，气体发生前临时加入NaHCO3溶液； ——其特征在于，根据不同的培养对象，设计不同的集成培养基组套，同一个培养皿内加入不同的培养基；——其特征在于，设计出痰液培养集成培养基，内含有血平板、巧克力平板及中国兰平板；——其特征在于，设计出粪便培养集成培养基，内含有SS平板(或XLD、麦康凯平板)、 TCBS平板以及碱性4号平板；——其特征在于，设计出尿培养集成培养基，内含有血平板、巧克力平板以及GC平板等组套。
4.根据权利要求1，一种封闭式生物安全微生物接种器，采用一层或多层密封盖对标本杯密封，相互之间通过螺旋进行连接；——根据权利要求1，一种封闭式接种器，标本杯底部设计一层或多层隔离网，将刚采集的标本与杯底部分开而又可以使标本浸泡在预处理液中。
5.根据权利要求2，一种接种器的接种喷雾头盖子与标本杯外螺旋匹配，并可以旋紧密封；通过延长或伸缩接种喷雾的导管部分以便于接种标本。
6.根据权利要求3，一种培养皿内置通过化学反应而制备气体的气体发生系统，并固定于平皿内部；——根据权利要求3，通过固定于培养皿内的其他化学试剂，通过化学反应制备CO2气体并用于微生物培养。
全文摘要
本发明属医学检验技术领域，具体涉及一种封闭式生物安全微生物快速接种器及其匹配集成培养基的设计和使用。本发明摒弃接种环、酒精灯、CO2孵育箱，采用完全创新的原理，突出优点是具有很高生物安全性和工作效率高。与现有同类仪器比较，本发明操作方便，无需特别培训，10分钟可以轻松接种20份标本；培养基密闭性好，不会释放生物气溶胶，具有清洁、无公害特点；节约资源，成本低廉，适合在各类微生物实验室推广、使用；携带方便，尤其适合野外现场采样、现场接种；符合生物安全要求，能够满足接种、培养携带烈性传染性病原微生物标本的特殊生物安全要求。
文档编号C12M1/32GK102352310SQ20111030264
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者王敬华, 王科元, 虞培娟 申请人:王敬华, 王科元, 虞培娟