专利名称：离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法
技术领域：
本发明涉及生化制药领域，具体涉及离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法。
背景技术：
咖啡酸苯乙酯，英文名称Caffeic acid phenethyl ester (CAPE)，化学名称: 2-苯乙基-3-(3，4-二羟苯基)-2-丙烯酸酯，分子式=C17H16O4,分子量284. 31。咖啡酸苯乙酯是蜂胶、红景天等天然产物中的主要功能成分，经药理实验证明其能够阻断中性粒细胞中活性氧化物质的产生、阻断黄嘌呤氧化酶系统、能够抑制机体内NO的增加，还能抑制肿瘤细胞增生(Biol. Pharm. Bull, 2003, 26 (4) :487-491)，是国际上各大医药公司竞相开发的辅助药物或药物有效成分。制备咖啡酸苯乙酯的方法主要有提取和化学合成两种方法(Journal of Biotechnology, 2010,148 :133-138) :(1)咖啡酸苯乙酯在自然界中的含量相当少，在咖啡酸苯乙酯含量最高的中国蜂胶中，其含量一般在5 25mg/g。直接从天然植物中提取的难度太大，且制得的咖啡酸苯乙酯的纯度低；( 有机溶剂为反应介质、以传统的酸作为催化剂的酯化合成法具有反应副产物多、对设备的腐蚀性强、产品分离过程复杂以及易挥发溶剂气体对环境污染大等缺点(Journal of Molecular catalysis A :chemical, 2005, 234 107-110)。因此，急需寻求一种新型的反应介质及其催化剂来解决咖啡酸苯乙酯制备方法的以上技术缺陷。与传统的催化剂相比，选择脂肪酶作为酯化合成咖啡酸苯乙酯的催化剂具有其得天独厚的优势(1)脂肪酶对酯化反应具有专一性，避免了反应产生的副产物，使得反应产物的分离纯化得到简化；(2)由于酶具有高效性，能够大大提高酯化反应的速率，从而提高咖啡酸苯乙酯的得率；C3)脂肪酶催化化学反应的反应条件相对温和，对设备的腐蚀大大降低；(4)跟传统的以酸作为催化剂相比较，脂肪酶不会挥发，对环境友好等(Process Biochemistry, 2009,44 :1358-1365)。因此，以脂肪酶作为反应催化剂、以咖啡酸和苯乙醇直接酶法合成咖啡酸苯乙酯不失为一种高效的制备方法。然而，虽然这种制备方法具有上述优点，但是传统反应介质有机溶剂带来的诸如对底物溶解度不高、挥发性溶剂对环境污染大等问题并没有得到解决。离子液体作为一种新型的反应介质，具有传统反应介质所不具备的一些优越特性。首先，离子液体的蒸汽压极低，难以挥发，对环境几乎没有污染；其次，离子液体具有优良的热稳定性，在反应需要的较高温度条件下仍然能搞保护酶的活性以及反应的顺利进行；再次，疏水作用的离子液体能够与反应形成的水形成两相，从而推动酯化反应向生成产物咖啡酸苯乙酯的方向进行；同时，还能够保证脂肪酶分子的空间结构正常分布，保证酶具有正常的活性；此外，离子液体的最大特点是具有可重塑性，即可以根据反应底物的极性以及疏水性来调节阴、阳离子的结合，从而最大限度的增大反应底物的溶解度以及互溶度，从而提高反应的速率(Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic，2010，65 :68-72)。然而，以离子液体为反应介质的酶促合成咖啡酸苯乙酯尚未见报道。因此，本专利旨在建立以离子液体为反应介质，以脂肪酶为催化剂，通过酯化合成的方法来制备咖啡酸苯乙酯。该方法操作简便，反应条件温和，产物得率高，对环境友好，从而可以克服传统的脂肪酶催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于大量制备高纯度咖啡酸苯乙酯，为推动其在医药工业中的广泛应用具有十分重要的意义。
发明内容
技术问题为解决以上缺陷，本发明提供了一种在新型的反应介质——离子液体中由咖啡酸和苯乙醇酯化制备咖啡酸苯乙酯的方法，以有效提高底物浓度、提高产物收率以及缩短反应时间。技术方案离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，按照摩尔比苯乙醇咖啡酸=1 50 1的比例配制反应体系，按照质量比脂肪酶咖啡酸=1 200 1的比例加入脂肪酶，按照体积比离子液体苯乙醇=10 500 1的比例加入离子液体，在反应温度10 100°C、振荡转速50 200rpm的条件下进行酯化反应10 150h。上述方法中，还可以按照质量比抗氧化剂咖啡酸=5 100 1的比例加入抗氧化剂。所述离子液体的阳、阴离子类型组合包括阳离子类型为[anim]、[Hmim]、[Nmim]、 [Τ0ΜΑ]或[Omim]，阴离子类型为[PF6]、[Tf2N]、[BF4]、[HSO4]或[Cl]，上述阴、阳离子配合而成离子液体。所述脂肪酶为微生物、动物、或植物来源的游离脂肪酶或固定化脂肪酶。所述脂肪酶微生物来源为假丝酵母Candida sp. (Candida antarctica、 Candida rugosa)、曲霄 Aspergillus sp. (Aspergillus niger、Aspergillus oryzae)、 青霉 Penicillium sp. (Penicillium camemberti、Penicillium roqueforti) > 根毛霄 Rhizomucor sp. (Rhizomucor miehei)、嗜热真菌 Thermomyces sp. (Thermomyces lanuginosus)、毛 β Mucor sp. (Mucor javanicus)、芽 3 If 菌 Bacillus sp. (Bacillus subtilis)、 假单胞菌 Pseudomonas sp. (Pseudomonas cepacia、Pseudomonas f luorescens)、色杆菌 Chromobacterium sp. (Chromobacterium viscosum)、伯克氏菌 Burkholderia sp. (Burkholderia cepacia)等。所述脂肪酶动物来源为猪、狗、牛、羊、马、兔、鼠、鸡、鸭、鹅等动物胰脏组织。所述脂肪酶植物来源为蓖麻、油菜、油茶、光皮树、黄连木、麻风树、文冠果等油料作物种子。所述的抗氧化剂为ΒΗΤ、AHT、抗坏血酸及其酯类或没食子酸及其酯类。有益效果在酶促合成咖啡酸苯乙酯的体系中选择合适的离子液体作为反应介质来强化合成效率，该方法反应条件温和，产物得率高，对环境友好，克服了以有机溶剂为反应介质催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于大量制备咖啡酸苯乙酯。此外，整个酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无环境污染，具有非常良好的工业化应用前景，可以满足迅速发展的医药工业的需要。
图1离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的反应式。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。检测酶促合成咖啡酸苯乙酯体系的高效液相色谱条件为色谱柱采用 250mmX4. 6mm 的 Alltima Cw 柱，流动相为乙腈冰醋酸(0. 5% ) (V V) = 50 50，流速为lmL/min，柱温为30°C，检测波长为325nm，进样量为20 μ L。其中，产物咖啡酸苯乙酯的转化率计算方法为
权利要求
1.离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于按照摩尔比苯乙醇咖啡酸=1 50 1的比例配制反应体系，按照质量比脂肪酶咖啡酸=1 200 1的比例加入脂肪酶，按照体积比离子液体苯乙醇=10 500 1的比例加入离子液体，在反应温度10 100°C、振荡转速50 200rpm的条件下进行酯化反应10 150h。
2.根据权利要求1所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于按照质量比抗氧化剂咖啡酸=5 100 1的比例加入抗氧化剂。
3.根据权利要求1所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述离子液体由下述阳离子和阴离子配合而成，其中阳离子类型为[anim]、[Hmim]、 [Nmim]、[Τ0ΜΑ]或[Omim]，阴离子类型为[PF6]、[Tf2N]、[BF4]、[HSO4]或[Cl]。
4.根据权利要求1所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述脂肪酶为微生物、动物或植物来源的游离脂肪酶及其固定化脂肪酶。
5.根据权利要求4所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述脂肪酶微生物来源为假丝酵母Candida sp.、曲霉Aspergillus sp.、青霉 Penicillium sp.、根毛霉Rhizomucor sp.、嗜热真菌Thermomyces sp.、毛霉Mucor sp.、芽孢杆菌Bacillus sp.、假单胞菌Pseudomonas sp.、色杆菌Chromobacterium sp.或伯克氏菌Burkholderia sp.。
6.根据权利要求4所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述脂肪酶动物来源为猪、狗、牛、羊、马、兔、鼠、鸡、鸭或鹅的动物胰脏组织。
7.根据权利要求4所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述脂肪酶植物来源为蓖麻、油菜、油茶、光皮树、黄连木、麻风树或文冠果的油料作物种子。
8.根据权利要求1所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述的抗氧化剂为BHT、AHT、抗坏血酸及其酯类或没食子酸及其酯类。
全文摘要
离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，在选择离子液体为反应介质中酶促合成咖啡酸苯乙酯，提高底物在反应介质中的溶解度，提高脂肪酶的热稳定性及其对底物的立体选择性。该方法操作简便，反应条件温和，产物得率大大提高，对环境友好，克服了传统脂肪酶催化合成效率低和底物溶解度低的缺点，有利于规模化制备咖啡酸苯乙酯。
文档编号C12R1/66GK102321692SQ20111030222
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者吴福安, 张磊霞, 李晶, 王俊, 郭锡杰, 顾双双 申请人:江苏科技大学