专利名称：鉴定h3亚型禽流感病毒的pcr引物对及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定H3亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。
背景技术：
禽流感是由禽流感病毒引起的禽类病毒性传染病。H3亚型禽流感病毒是流行于水禽的主要亚型之一；近年来发现我国大部分地区鸡群存在H3亚型流感病毒的血清阳性抗体，且有从鸡群中分离到H3亚型禽流感病毒的报道，说明H3亚型禽流感病毒已经感染鸡， 并进入鸡群；此外，流行病学调查显示，H3亚型禽流感病毒与鸡群中的主要流行亚型(H5和 H9亚型)病毒发生了基因交换产生了新型流感病毒，并引起鸡群发病；而且，H3亚型禽流感病毒曾经是人间流感大流行毒株的供体。因此，建立一种针对H3亚型禽流感病毒的检测试剂，既可满足水禽和鸡群禽流感病毒监测的需要，又可为人间流感大流行的预警提供一种有效的检测方法。传统的检测方法，如病毒分离、血凝抑制试验等，费时、费力，不能做出快速而及时的诊断。现代的分子生物学诊断技术能从分子水平揭示多种疾病，如高致病性禽流感，也能从分子水平揭示潜在高致病性禽流感毒株的差异，从而实现早期而快速地诊断疾病。目前还没有一种针对H3亚型禽流感病毒进行检测的PCR引物及方法，以用于流感病毒的流行病学监测和诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定H3亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。本发明所提供的PCR引物对，是由两条单链DNA组成，所述两条单链DNA是序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA。本发明所提供的PCR引物对可用于制备诊断或辅助诊断H3亚型禽流感的试剂或试剂盒，或用于制备鉴定或辅助鉴定H3亚型禽流感病毒的试剂或试剂盒。含有所述PCR引物对的试剂或试剂盒均属于本发明的保护范围。上述PCR引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括将所述PCR引物对中所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。所述鉴定或辅助鉴定H3亚型禽流感病毒的试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括如下步骤将所述PCR引物对中所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂盒内DNA聚合酶和4种dNTP(dATP， dTTP, dCTP 和 dGTP)。本发明所提供的PCR引物对可检测H3亚型禽流感病毒，尤其适合检测H3N8亚型的禽流感病毒。本发明所提供的PCR引物对可检测不同来源的H3亚型禽流感病毒，尤其适合检测鸭源的H3亚型禽流感病毒。本发明所提供的引物对用于检测H3亚型禽流感病毒的特异性高，灵敏度可达1EID5(I/I00yl，与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比的符合率为 100% ；不仅可以对待测病禽的口腔拭子、泄殖拭子进行检测，还可检测病禽尿囊液，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用，可成为H3亚型禽流感病毒疫病诊断和流行病学调查的有用检测工具。
图1为引物对H3V的特异性检测。其中，M为Maker，1-6分别为感染H3亚型禽流感病毒 A/Duck/BeiJing/33/2004、A/Duck/BeiJing/40/2004、A/Duck/BeiJing/44/2004、 A/Duck/BeiJing/56/2005、A/Duck/BeiJing/59/2005 和 A/Duck/BeiJing/61/2005 的样品，7-19分别为感染H5m亚型禽流感病毒A/Chicken/Huabei/202/2010、H5N1亚型禽流胃__ A/tree sparrow/Jiangsu/l/2008> H5N1 MMA/Duck/Huabei/7/2009> H9N2 亚型禽流感病毒 A/Quail/HongKong/Gl/1997、H9N2 亚型禽流感病毒 A/Chicken/ Beijing/3/1999、H9N2 亚型禽流感病毒 A/Duck/ShangDong/2CP/2010、H4N6 亚型禽流感病毒 A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1 亚型禽流感病毒 A/Duck/Bei jing/1/2003、新城疫病毒HG/Beijing/2009、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、呼肠孤病毒 (REO)的样品，19为阴性鸡胚尿囊液对照。图2为引物对H3V的敏感性测定。其中，1-7分别为不同稀释度的H3亚型禽流感病毒含量样品，依次为 1 X 104EID50/100 μ 1U X 103EID50/100 μ 1U χ io2eid50/ioo μ 1, 10EID50/100 y 1、1ΕΙΕ)50/100 μ 1、1 X 1(^EID50/100 μ 1、1 X 1(T2EID5Q/100 μ 1，8 为阴性鸡胚尿
囊液对照。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例所使用的病毒毒株信息如表1所示实施例1、PCR引物对设计根据Η3亚型禽流感病毒HA基因的高度保守区域基因设计引物对H3V:上游引物 H3-622F :5，-TTCACCACCCGAGCACAA-3，(序列表序列 1 序列)；下游引物 H3-837R 5，-GGGCGATTAGGTTTCCATTA-3，(序列表序列2序列)；退火温度为51°C ；引物对H3V的靶序列为 Genbank EU492531 的第 622-639 位和第 818-837 位。实施例2、PCR引物对的特异性检测
1、总RNA提取及质量控制分别取感染 H3 亚型禽流感病毒 A/Duck/BeiJing/33/2004、A/Duck/ Beijing/40/2004, A/Duck/BeiJing/44/2004, A/Duck/BeiJing/56/2005, A/Duck/ Beijing/59/2005 或 A/Duck/BeiJing/61/2005(Pu，J.，Liu, Q. F.，Xia, Y. J.，Fan, Y. L.， Brown, E. G. , Tian,F.L. and Liu,J. H. ,2009. Genetic analysis of H3subtype influenza viruses isolated from domestic ducks in northern China during 2004-2005. Virus Genes 38，136-42.)的鸡胚尿囊液和感染类似H3亚型禽流感病毒的H5m亚型禽流感病毒 A/Chicken/Huabei/202/2010、H5N1 亚型禽流感病毒 A/tree sparrow/Jiangsu/l/2008(Liu, Q. ， Ma, J. ， Kou, Z. ， Pu, J. ， Lei, F. ， Li, T. and Liu, J. ,2010b. Characterization of a highly pathogenic avian influenza H5Nlclade 2.3.4virus isolated from a tree sparrow. Virus Res 147, 25-9.) > H5N1A/Duck/
Huabei/7/2009、H9N2 亚型禽流感病毒 A/Quail/HongKong/Gl/1997、H9N2 亚型禽流感病毒 A/Chicken/Bei jing/3/1999 (Sun，Y.，Pu, J.，Jiang, Ζ.，Guan, Τ.，Xia, Y.，Xu, Q.，Liu, L. , Ma, B. , Tian, F. , Brown, Ε. G. and Liu, J. , 2010. Genotypic evolution and antigenic drift of H9N2influenza viruses in China from 1994to 2008.Vet Microbiol 146， 215-25.)、H9N2 亚型禽流感病毒 A/Duck/ShangDong/2CP/2010、H4N6 亚型禽流感病毒 A/ Duck/ShangDong/1/2010、H6N1 亚型禽流感病毒 A/Duck/Bei jing/1/2003、新城疫病毒 HG/ Bei jing/2009 (Rui, Ζ. , Juan, P. , Jingliang, S. , Jixun, Ζ. , Xiaoting, W. , Shouping, Ζ., Xiaojiao, L. and Guozhong, Ζ. ,2010a. Phylogenetic characterization of Newcastle disease virus isolated in the mainland of China during 2001-2009. Vet Microbiol 141,246-57.)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)或呼肠孤病毒(REO) 的鸡胚尿囊液及阴性鸡胚尿囊液，分别提取总RNA (方法同实施例4)。用核酸蛋白分析仪 BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。2、反转录合成cDNA用反转录试剂盒(K1622，Fermentas)分别将步骤1的总RNA样品进行反转录，得到cDNA ；DEPC水作为总RNA的对照。反应体系 QOyL) 1 μ L Oligo 引物(20pmol/μ L)，4 μ L Reaction (5 X)， 1 μ LRibolock Rnase Inhibitor (20U/μ L), 2 μ L IOmM dNTP Mix, 1 μ L RevertAid M-MuLVReverse Transcriptase (200U/ μ L)，650ng 总 RNA, DEPC 7jC卒卜足至 20 μ L。反应条件加完DEPC水(提取的RNA溶解其中)和oligo引物后，瞬离，65°C 5min 后立即冰浴。加完其余五样后，瞬离，37°C让，再70151^11，41保存。3、PCR扩增检测引物对的特异性以弓丨物对H3V为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增。反应体系(25yL) :12. 5yL2XMIX buffer (AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为fesyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/ μ L序列表序列 1引物0. 5 μ L，浓度为20ρπιο1/μ L序列表序列2引物0. 5μ L，cDNA 2 μ L，DEPC水补足至 25 μ L，每个cDNA设置2个重复。反应程序94°C5min ；94°C 30s ；51°C 45s ；72°C 45s，从第二步开始进行 30 个循环，72°C IOmin ；4°C Ih0电泳取PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳(结果如图1所示)，A/Duck/ Beijing/33/2004, A/Duck/BeiJing/40/2004, A/Duck/BeiJing/44/2004, A/Duck/ Beijing/56/2005,A/Duck/BeiJing/59/2005 和 A/Duck/BeiJing/61/2005 感染的鸡胚尿囊液样品中均得到一条大小在200-300bp之间的PCR产物条带，经测序得知该条带的大小均为216bp。阴性鸡胚尿囊液及H5W亚型禽流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、H4N6亚型禽流感病毒、H6N1亚型禽流感病毒、新城疫病毒、IBV、IBDVJP REO感染的鸡胚尿囊液样品中在 200-300bp之间无PCR产物条带。结果表明，引物对H3V的特异性很好，可以特异检出H3亚型禽流感病毒。
实施例3、PCR引物对的灵敏度检测1、总RNA提取和各个稀释液的制备取感染H3亚型禽流感病毒A/Duck/Bei jing/40/2004的鸡胚尿囊液，采用 Reed-Muench法进行病毒EID5tl的测定，获得此H3亚型禽流感病毒在鸡胚尿囊液中的含毒量。根据此病毒含量，用无菌PBS将此鸡胚尿囊液稀释为病毒浓度为106EID5(1/100 μ 1 (如鸡胚尿囊液的病毒浓度为l(fEID5(l/100y 1，则进行10倍稀释(107/106 = 10))，然后在此基础上进行10倍倍比稀释，各个稀释液中，病毒含量分别为105EID5Q/100y l、104EID5Q/100y 1、 103EID50/100 y 1、102EID5(I/100 μ 1、Io1EID5ciZioo μ U10°EID50/100 y 1、Kr1EID5cZlOO μ 1、 10"2EID50/100 μ 1。测定病毒浓度在104EID5Q/100 μ 1-10"2EID50/100 μ 1之间样品的检测敏感性。取104EID5(1/100 μ 1-10-2EID50/100 μ 1之间各稀释度的尿囊液样品，分别提取总RNA(总 RNA提取方法同实施例4)。2、反转录合成cDNA用反转录试剂盒(K1622，i^rmentaS)分别将各个稀释液中提取的总RNA进行反转录，得到cDNA ；阴性鸡胚尿囊液的反转录产物作为总RNA的对照。反应体系 ΟΟμ 1 μ L Oligo 引物(20pmol/μ L)，4 μ L Reaction (5 X), 1 μ L Ribolock Rnase Inhibitor(20U/μ L),2 μ L IOmM dNTP Mix,1 μ L RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200U/ μ L), 11 μ L RNA, DEPC 7_Κ卒卜足至 20 μ L。反应条件加完DEPC水(提取的RNA溶解其中)和oligo引物后，瞬离，65°C 5min 后立即冰浴。加完其余五样后，瞬离，37°C让，再70151^11，41保存。3、PCR扩增检测引物对的灵敏度以弓丨物对H3V为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增。反应体系(25yL) :12. 5yL2XMIX buffer (AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为fesyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/ μ L序列表序列 1引物0. 5 μ L，浓度为20ρπιο1/μ L序列表序列2引物0. 5μ L，cDNA 2 μ L，DEPC水补足至 25 μ L，每个cDNA设置2个重复。反应程序94°C5min ；94°C 30s ；51°C 45s ；72°C 45s，从第二步开始进行 30 个循环，72°C IOmin ；4°C Ih0电泳取PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳(结果如图2所示)，1EID50/100 μ 1及以上病毒浓度样品的总RNA中可观察到216bp的扩增条带。结果表明，引物对H3V的检测灵敏度可达1ΕΠ)5(1/100μ 1，即检测样本病毒含量的下限为1EID5(1/I00y 1。实施例4、PCR引物对的符合率检测以经过病毒分离、血凝抑制试验等常规实验方法鉴定为Η3亚型禽流感病毒A/ Duck/Beijing/40/2004感染的鸡的组织样品以及从活禽市场采集的380份健康鸡和鸭的咽拭子及粪便棉拭子样品为检测样品，以健康鸡的肺组织样品为阴性对照，PBS为空白对照，以H3亚型禽流感病毒A/Duck/Bei jing/40/2004感染的鸡胚尿囊液为阳性对照，提取总 RNA,反转录后，以引物对H3V为引物进行PCR反应，过程如下1、样品的采集和处理鸡的组织样品取肺的组织；鸡和鸭的棉拭子咽拭子、泄殖腔拭子；2_8°C保存， 送实验室检测。要求送检样品新鲜。
2、样本液的制备(1)组织样品称取IOOmg组织样品置研磨器中，加入0.8ml裂解液(硫氰酸胍， 0. 8M ；硫氰酸铵，0. 4M ；醋酸钠缓冲液，0. IM ；甘油5%和苯酚38%，混勻)研磨，把研磨好的组织样品移至1. 5ml离心管中，4°C 8000rpm离心5min，取上清250 μ 1，置于1. 5ml灭菌离心管中，加入750μ 1上述裂解液，剧烈振荡混勻，室温放置5min。(2)棉拭子样品将浸液中的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，4°C SOOOrpm离心 5min，取上清液250μ 1，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750 μ 1裂解液(硫氰酸胍，0. 8Μ ； 硫氰酸铵，0. 4Μ ；醋酸钠缓冲液，0. IM ；甘油5%和苯酚38%，混勻)，剧烈振荡混勻，室温放置 5min。(3)阴性对照(PBS)取灭菌双蒸水250μ1，置于1.5ml灭菌离心管中，加入 750 μ 1裂解液(硫氰酸胍，0. 8Μ ；硫氰酸铵，0. 4Μ ；醋酸钠缓冲液，0. IM ；甘油5%和苯酚 38 %，混勻)，剧烈振荡混勻，室温放置5min。3、总 RNA 提取1)取处理后的样本液(鸡胚尿囊液无需处理即可作为样本液)300 μ 1，加 900ulTRIZ0L (15596-018，hvitrogen)，轻轻颠倒混勻数次，冰浴 IOmin02)加 200 μ 1 氯仿，颠倒混勻 15s，冰浴 5min，4°C离心，13000r/m, 15min。3)取700ul上清移入新的离心管，加入等量的异丙醇，轻轻颠倒混勻，混勻后，4°C 离心，13000r/m, 15min。4)弃上清，贴壁缓缓加Iml 75% DEPC处理过的酒精，加完后轻转两圈。5)4°C，13000r/m，5min。6)倒上清，置于冰上风干5-lOmin。7)用 15 μ L DEPC 水和 1 μ L RNA 酶抑制剂(200U/ μ L, #kl622, Fermentas)溶解沉淀，即用或_80°C保存备用。4、反转录用反转录试剂盒(K1622，Fermentas)分别将步骤3获得的总RNA样品进行反转录，得到cDNA ；DEPC水作为总RNA的对照。反应体系 ΟΟμ 1 μ L Oligo 引物(20pmol/μ L)，4 μ L Reaction (5 X), 1 μ L Ribolock Rnase Inhibitor(20U/μ L),2 μ LlOmM dNTP Mix,1 μ L RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200U/ μ L), 11 μ L RNA, DEPC 7_Κ卒卜足至 20 μ L。反应条件加完DEPC水(提取的RNA溶解其中)和oligo引物后，瞬离，65°C5min 后立即冰浴。加完其余五样后，瞬离，37°C lh，再70°C 5min，4°C保存。5、PCR 检测反应体系(25yL) :12. 5yL2XMIX buffer (AS111，北京全式金生物技术有限公司，其成分为fesyTaq DNA聚合酶、dNIPs及反应缓冲液)，浓度为20pmol/μ L序列表序列1引物0. 5 μ L，浓度为20ρπιο1/μ L序列表序列2引物0. 5 μ L，2 μ LcDNA，DEPC水补足至 25 μ L，每个cDNA设置2个重复。反应程序94°C5min ；94°C 45s ；51°C 45s ；72°C 45s，从第二步开始进行 30 个循环，72°C IOmin ；4°C lh。6、电泳
取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果阳性对照可观察到216bp扩增带，空白对照和阴性对照无此扩增带，10个H3亚型禽流感病毒感染的鸡的组织样品全部呈阳性； 380个鸡和鸭的咽拭子和粪便拭子样品中检测到1个呈阳性；上述检测结果与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比的符合率为100%。
权利要求
1.鉴定或辅助鉴定H3亚型禽流感病毒的PCR引物对，它由两条单链DNA组成，其特征在于所述两条单链DNA是序列表中序列1所示的单链DNA，和序列表中序列2所示的单链 DNA。
2.权利要求1所述的PCR引物对在制备诊断或辅助诊断H3亚型禽流感试剂或试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述的PCR引物对在制备鉴定或辅助鉴定H3亚型禽流感病毒试剂或试剂盒中的应用。
4.鉴定或辅助鉴定H3亚型禽流感病毒的PCR试剂，其特征在于所述PCR试剂中含有权利要求1所述的PCR引物对。
5.鉴定或辅助鉴定H3亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有权利要求4所述的PCR试剂。
6.权利要求1所述的PCR引物对的制备方法，其特征在于所述制备方法包括将权利要求1所述的PCR引物对中所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
7.权利要求5所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤将权利要求1所述的PCR引物对中所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂盒内DNA聚合酶和下述4种dNTP :dATP，dTTP, dCTP和dGTP。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定H3亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。本发明所提供的PCR引物对是由两条单链DNA组成，所述两条单链DNA是序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA。本发明所提供的引物对用于检测H3亚型禽流感病毒的特异性高，灵敏度可达1EID50/100μl，与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比的符合率为100％；不仅可以对待测病禽的口腔拭子、泄殖拭子进行检测，还可检测病禽尿囊液，操作简单、容易推广，便于基层操作和应用，可成为H3亚型禽流感病毒疫病诊断和流行病学调查的有用检测工具。
文档编号C12R1/93GK102304591SQ20111030217
公开日2012年1月4日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者刘金华, 包静楠, 唐庆冬, 孙洪磊, 王金亮, 蒲娟 申请人:中国农业大学