专利名称：一种羧酸酯酶基因及其编码的蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种羧酸酯酶及其基因序列。
背景技术：
生物素(biotin)是一种存在于所有活细胞中的必需维生素。它的生物合成途径包括7，8- 二氨基壬酸合成酶、生物素合成酶、8-酮基-7氨基合成酶、甲基转移酶和脱硫生物素合成酶，分别由bioA、bioB、bioF、bioC和bioD基因编码，这五个基因组成bioABFCD 操纵子。庚二酰辅酶A(Pimeloyl-CoA)是生物素生物合成途径的起始底物，它本身则由不同途径产生。革兰氏阴性菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，通过修饰的脂肪酸合成途径产生庚二酰辅酶A，而革兰氏阳性芽孢杆菌 (Bacillus subtilis,B. spbaericus,)则通过庚二酰辅酶A合成酶将自由的庚二酸和辅酶 A合成为庚二酰辅酶A。尽管革兰氏阴性菌中庚二酰辅酶A的合成机制至今仍未完全阐明，但是可能涉及 BioC和BioH的联合作用。BioC作为庚二酰特异载体蛋白，而BioH不仅具有硫酯酶(从庚二酰-BioC复合体上水解一个硫酯键)，而且具有酰基转移酶(转移一个酰基给辅酶A)活性。尽管bioH基因不属于含有bioC的生物素合成操纵子bioABTOD，可是bioH是生物素合成的必需基因。近年来，已从E. colLSerratia spp.中克隆到bioH基因，并被鉴定编码一种新型的羧酸酯酶。羧酸酯酶(Carboxylesterase，CaEs, EC 3. 1. 1. 1)水解带羧基的脂肪酸族及芳香族酯类，对α -萘酚酯和对硝基苯酯类物质均具有较高的特异性，且对其相应的丁酸酯、戊酸酯活性最高，酶活性随碳链延长减弱。目前已从链霉菌属(Sti^ptomyces sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp·)、乳杆菌属(Lactobacillus sp·)、微球菌属(Micrococcus sp.)等微生物中克隆到羧酸酯酶基因，已经应用于食品、洗涤、皮革、纸张等工业中，主要用于水解反应。羧酸酯酶还被应用于制药、染料、杀虫剂和杀菌剂等工农业废水中硝基苯酚类毒性污染物的降解。然而，至今从微生物中克隆获得的羧酸酯酶仍然较少，难以满足食品、化工等工业快速发展，以及环境可持续、健康发展的需求；此外，国外对新型羧酸酯酶的研究还很少 (14篇研究论文，NCBI PUBMID数据库检索)，国内至今未见研究报道。本发明运用功能驱动的筛选策略和基因克隆技术，成功克隆到bioH基因，命名为APbioH，并获得了其全长基因序列。
发明内容
本发明旨在提供一种双功能羧酸酯酶及编码该羧酸酯酶的基因。一种双功能羧酸酯酶基因，其核苷酸序列包括SEQ ID No. 1所示的序列，是编码 SEQ ID No. 2所示羧酸酯酶蛋白的核苷酸序列，更优选的，其核苷酸序列是SEQ ID No. 1所示的序列，长度为780bp。
一种双功能羧酸酯酶，其氨基酸序列包括SEQ ID No. 2所示的序列，更优选的，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，含259个氨基酸。本发明提取无色杆菌AchromcAacter piechaudii基因组DNA，利用功能驱动的筛选策略和基因克隆技术，从中成功克隆到具有羧酸酯酶活性的生物素合成酶bioH基因，命名为ApbioH，并获得了其全长基因序列。该基因编码的蛋白是一种双功能羧酸酯酶(命名为APBioH)，由260个氨基酸构成，具有硫酯酶和酰基转移酶的活性。APBioH与GenBank数据库中BioH同源序列的相似性为96%，含有G-X-S-X-G-G保守结构域，属于新型的双功能羧酸酯酶。本发明填补了我国在该领域研究的空白，为我国酶制剂的发展及其在食品、化工工业，以及硝基苯酚类毒性污染物降解中的应用提供了新基因资源。
图 1 为实施例中 E. coliDH5 α (pCaEsSHOl-1)在选择性 SBA-Amp (100mg/mL)琼脂平板上的表型。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明。本发明所用主要试剂Trypton、YeastExtract、NaCl、琼脂糖(Agrose)、 50XTris-acetate-EDTA(TAE)buffer(上海生工生物工程技术服务有限公司)，ADNA/ HindIII DNA marker、X_gal、IPTG(天根生物工程北京有限公司)，T4DNA Polymerase、 Klenow Fragment、T4 DNA Ligase、Premix Ex Taq Version 2· O, dNTP (3· 2 μ mol)(大连宝生物工程有限公司)，Sprit Blue Agar、三丁酸甘油酯、Tween80、对硝基苯酯、乙腈 (Sigma-Aldrich，美国)，PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。本发明所用主要菌株、载体和培养基E. coli DH5a (大连宝生物工程有限公司)，pUC19(上海生工生物工程技术服务有限公司)，LB培养基(含TryptoruO. 5% Yeast Extracts. 5%NaCl,pH7. 2,1. 5% agar), Sprit Blue Agar (SBA)选择性培养基(含
三丁酸甘油酯、0.05% Tween 80)。本发明所用主要仪器设备Mili-Q超纯水仪(Millipore Billerica，美国)，酶标仪(Synergy 2，北京基因有限公司)，超声波细胞粉碎仪(YJ92-IIN，宁波新芝生物科技股份有限公司)，SMA4000UV-Spectrophotometer(Merinton技术有限公司，北京)，核酸电泳仪(Model No. PowerPac basic)、凝胶成像系统(Bio-RAD Molecular Imager GEL DoctmXR+) (Bio-RAD,美国)，PCR 仪(Mastercycler ，Eppendorf，德国)。离心机(5810R， Eppendorf 德国)。实施例1采用无菌水系列梯度稀释法，将无色杆菌涂布于SBA选择性培养基，涂布100 μ 1/ 琼脂平板(90mm直径)，涂布后的平板倒置于37°C培养箱培养2天。挑取SBA选择性培养基上有较大透明圈的菌落，于SBA选择性培养基纯化两次后，加入终浓度为20%的甘油后置于-40°C保存。酶活性测定对硝基苯酯乙腈转化为对硝基苯酚
配制IOmM对硝基苯酯乙腈溶液作为底物溶液；配制反应溶液lmL底物溶液、 4mL无水乙醇、95mL 50mM Tris-Hcl (pH 8. 5)。接种分离菌株于5mL LB液体培养基，37°C， 160rpm震荡培养16-l i、5000g离心lOmin，取上清液50 μ L加入150 μ L上述反应溶液中， 45°C反应条件下用酶标仪测定405nm处吸光值，测定时间为20min，每Imin测定一次，记录吸光值变化；制备对硝基苯酚标准曲线，将羧酸酯酶Imin释放1 μ mol的对硝基苯酚的量定义为一个酶活单位；采用BCA蛋白质定量检测试剂盒(BCA Protein Assay Kit，上海生工生物工程技术服务有限公司)测定培养上清液的总蛋白含量。取其中一株羧酸酯酶酶活性为0. lU/mg总蛋白的菌株建立基因组DNA文库。实施例2分离菌株16S rRNA基因的PCR扩增、序列测定和分析基因组DNA的提取接种分离实施例1得到的菌株于5mL LB液体培养基，37°C， 160rpm震荡培养16_18h，12000g离心Imin收集菌体，吸弃上清。采用Biospin细菌基因组 DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)，提取基因组DNA，根据试剂盒说明书步骤进行操作。采用0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA，采用SAM 4000Spectrophotometer 测定DNA浓度。提取的基因组DNA模板置于-20°C备用。16S rRNA基因的PCR扩增PCR反应体系(总体系25 μ L)无菌水 9· 5μ L ;2xPremix Ex Taq (Version 2· 0) 12. 5 μ L ；弓| 物 27F(5 μ mol/ L,引物序列 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)1 μ L ；弓丨物 1492R(5 μ mol/L,引物序列 5，-TACCTTGTTACGACTT-3，) 1 μ L ；DNA 模板 1 μ L。PCR反应循环参数如下95°C预变性5min ；后经过25个循环，每个循环包括 94°C, 30s, 58°C, 30s, 72°C, 120s ；最后 72°C延伸 5min ；4°C保存。采用 0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。PCR产物DNA序列的测定与分析PCR产物的DNA序列由国家人类基因组南方中心测定。采用 BioEdit (Version 7. 0. 9，http //www, mbio. ncsu. edu/BioEdit)软件进行 DNA原始数据的处理和正反双向序列的拼接，拼接的Contig序列长1430bp，以Fasta格式与 GenBank 数据库(http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/Entrez)中的序列进行 BLASTN 比对分析。发现与无色杆菌A. piechaudii (EU129469. 1) 16SrRNA序列具有99%的核苷酸序列相似性。实施例3基因组DNA文库的构建及阳性克隆的筛选基因组DNA小片段的回收经超声法剪接的基因组DNA，进行0. 7%琼脂糖凝胶电泳；在紫外灯下切下约2-61Λ的DNA片段，计算凝胶重量；采用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒 [爱思进生物技术(杭州)有限公司]，回收DNA，根据试剂盒说明书步骤进行操作。基因组DNA 片段与载体的连接采用 T4DNA Polymerase DNA(2_5U/ul)和 Klenow Fragment (2-5U/ul)(大连宝生物工程有限公司)补平DNA片段末端，根据说明书步骤进行操作。连接反应体系(总体系20 μ L)无菌水 8 μ L ； 10XT4DNA Ligase Buffer2 μ L ；DNA 载体 DNA 1 μ L ； T4DNA Ligase (350U/μ 1) 2 μ L，16°C 反应过夜。重组载体的转化及阳性重组子的筛选DNA连接液1 μ L，加入含有100 μ L Ε. coli DH5a感受态细胞[天根生物工程(北京]有限公司]离心管中，冰浴30min，根据说明书步骤进行操作。取100 μ L转化细胞培养夜涂布于含有三丁酸甘油酯、Tween 80的选
5择性SBA-氨苄青霉素(Amp，100mg/mL)琼脂平板，平板涂布40 μ L X-gal (20mg/mL)和 16 μ L IPTG(50mg/mL)，37°C培养48h，结果在SBA-Amp选择性琼脂平板上筛选到有透明圈(降解三丁酸甘油酯、TweenSO产生的透明圈)的阳性克隆2个，分别命名为E. coli DH5 α (pCaEsSH01-l)(如图 1)，Ε· coli DH5 α (pCaEsSHOl—2)。制备Ε. coli DH5 α (pCaEsSHOl-1)过夜培养液，5000g离心IOmin收集菌体，采用超声法破碎细胞，于4°C、25000g离心25min，弃沉淀，取50 μ L上清液进行酶活性分析。 将羧酸酯酶Imin释放1 μ mol的对硝基苯酚的量定义为一个酶活单位，经测定，E. coli DH5 α (pCaEsSHOl-1)羧酸酯酶酶活为0. 05U/mg总蛋白，具有较高的酶活性。实施例4阳性重组子DNA克隆片段的序列测定及分析接种阳性克隆E. coli DH5a (pCaEsSHOl-1)于 5mL LB-Amp 液体培养基，37°C振荡培养过夜，于12000g离心lmin，收集菌体，吸弃上清。采样质粒抽提试剂盒[宝生物工程 (大连)有限公司]，抽提重组质粒pCaEsSHOl-lDNA，根据说明书进行操作。采用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的DNA。采用基因步行法，对重组质粒pCaEsSHOl-Ι上外源DNA插入片段的全长DNA序列进行了测定，获得了插入片段全长DNA序列。采用BLASTX软件与GenBank数据库中的序列进行了比对分析，发现其中780bp序列(序列如SEQ ID No. 1所示)与数据库中 Burkholderia sp. JV3bioH基因(YP_004794414. 1)具有96%氨基酸序列的相似性，是一种新型的双功能羧酸酯酶。为进一步验证，将SEQ ID No. 1的长度为780bp核苷酸功能片段(可根据核苷酸序列人工合成并扩增，或者从重组质粒pCaEsSHOl-Ι上扩增)与载体连接并用重组载体转化E. coli DH5 α感受态细胞(方法同实施例3)。采用与实施例3同样的鉴定方法，在SBA-Amp选择性琼脂平板上筛选到有透明圈的阳性克隆。将阳性的重组Ε. coli DH5 α过夜培养液，5000g离心IOmin收集菌体，采用超声法破碎细胞，于4°C下25000g离心25min，弃沉淀，取50 μ L上清液进行酶活性分析。将羧酸酯酶Imin释放1 μ mol的对硝基苯酚的量定义为一个酶活单位，经测定，重组子的羧酸酯酶酶活为0. 04 0. 07U/mg总蛋白，具有较高的酶活性。从实施例4可知，具有SEQ ID No. 1序列的DNA片段，可编码具有259个氨基酸序列的双功能羧酸酯酶，所编码的蛋白可将对硝基苯酯乙腈转化为对硝基苯酚，说明不仅具有硫酯酶和酰基转移酶的活性(即ApBioH在生物素生物合成途径中的活性，同时还具有羧酸酯酶酶活性)。
权利要求
1.一种羧酸酯酶基因，其特征在于，其核苷酸序列包括SEQ ID No. 1所示的序列。
2.权利要求1所述一种羧酸酯酶基因，其特征在于，是编码SEQID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。
3.权利要求1所述一种羧酸酯酶基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQID No. 1。
4.一种羧酸酯酶，其特征在于，其氨基酸序列包括SEQ ID No. 2所示的序列。
5.权利要求4所述一种羧酸酯酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No. 2所示。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，提取无色杆菌基因组DNA，利用功能驱动的筛选策略和基因克隆技术，提供了一种双功能羧酸酯酶基因，其核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列；其编码的蛋白是一种双功能羧酸酯酶，具有硫酯酶和酰基转移酶的活性，其氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示的序列。本发明填补了我国在该领域研究的空白，为我国酶制剂的发展及其在食品、化工工业，以及硝基苯酚类毒性污染物降解中的应用提供了新基因资源。
文档编号C12N15/55GK102559719SQ20121001916
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者时玉萍, 李柏林, 欧杰, 潘迎捷, 陈兰明, 陈兴华 申请人:上海海洋大学