专利名称：云南红梨PyTTG1基因及其原核表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种云南红梨花青素合成调控、叶毛和毛状体发生发育的调控基因基因及其原核表达载体，以及应用原核表达载体制备云南红梨花青素合成及叶毛、毛状体发生发育调控蛋白PyTTGl。
背景技术：
植物花青素的合成是由转录复合物MYB-bHLH-WD40调控的。前人对MYB和bHLH 研究较多，而对植物中的WD40蛋白研究较少。WD40蛋白含WD40基序(约40氨基酸的保守序列，以甘氨酸-组氨酸(GH)开始，以色氨酸-天冬氨酸(WD)结尾)。WD40蛋白含
1-10个串联的WD40基序，一般认为至少4个以上的WD40基序才能形成高级和有功能的结构。现有研究表明WD40蛋白是一个结构多样、功能各异的蛋白家族，通常它们具有两个共同特征一是结构域折叠成β_螺旋桨结构，一是形成多蛋白可逆组装但不具任何催化活性的平台，它们主要是在真核生物的蛋白质-蛋白质复合物形成中起作用。Fritzius等人发现ProF蛋白是将激酶和底物汇集在一起的适配器蛋白。在植物中，WD40蛋白的作用主要是作为植物特异性发育事件如开花、花发育、分生组织形成、花粉发育和配子形成关键调节因子。WD40蛋白主要通过其WD结构域与其它蛋白互作，参与植物内众多代谢反应的调控。Morita等人在牵牛花中发现具有隐性基因ca (编码Jz7WDRl蛋白)的突变体中，除CHS 外，花青素合成途径的结构基因的表达都协同地减少。Walker等人首次通过定位克隆和互补试验发现TTGl蛋白调控花青素的合成和毛状体分化。拟南芥TTGl蛋白含4个WD40基序，其(反2突变体的特点是缺乏表皮毛、种皮透明、种子不经休眠就直接萌发、植株完全缺乏花青素、具有异常的根发育模式等突变表型，这表明TTGl的功能是多效的。棉花GhTTGl 和GhTTG3具有拟南芥AtTTGl的类似功能不仅能够恢复拟南芥ttgl突变体形成毛状体和花青素，而且还能互补紫罗兰ttgl突变体在花瓣产生紫色斑点。De等人在矮牵牛中首次发现WD40蛋白PhANlI，其定位于细胞质，能够连接信号转导与转录激活，能够调控PhAN2 (MYB)的功能。玉米中的PACl与矮牵牛和拟南芥中花青素调节蛋白ANl 1、TTG1极为类似，且 35S-PAC1能够互补ttgl突变体。Dressel等人发现WD基序中单个氨基酸的突变(W158R) 就可抑制DFR基因的表达，进而导致白花表型，且MiTTGl的54. 1%高GC含量是进化的信号。Matus等人在拟南芥中异位表达葡萄勝ZtV导致拟南芥地上部分和莲座叶中花青素的合成，并通过GFP融合蛋白技术证明WDRl定位于细胞质和细胞核。Zhang等人通过酵母双杂交和植物过表达技术发现EGL3、GL3能够与TTGl (WD40)和MYB蛋白(GL1，PAPl、PAP2、 CPC、TRY)组合，形成MYB/TTG1/WD40复合物进行包括花青素生物合成和毛状体形成的多功能的调控。Brueggemann等人通过互补试验证实了苹果MdTTGl具有类似拟南芥AtTTGl的功能。Baudry等人通过遗传和分子的方法发现TT2 (MYB)、TT8 (TTGl)和TTGl (WDR)能够形成四元复合物直接调控BAN在植物中的表达。Payne等通过酵母双杂交证实了在拟南芥中GL3/GL1/TTG1复合物调控毛状体的发育。Bouyer通过克隆分析、异位表达和微注射试验提出了毛状体形成的捕获-耗尽机制在高浓度的毛状体促进蛋白GL3细胞中，GL3通过结合毛状体形成蛋白TTGl来耗尽临近细胞中的TTGl，从而导致毛状体形成，而周围的细胞因 TTGl的减少而不能形成毛状体。而Zhao等人通过离子轰击试验证明了 TTGl, GL3, GLl和 GL2并不在邻近细胞间转移，而R3-MYB，CPC则可在邻近细胞间转移，提出TTGl复合物直接调节激活子和抑制子，而抑制子的运动影响拟南芥叶上毛状体的类型。TTG是多功效基因， Gonzalez等人还发现TTGl能够与MYB5和TT2 (MYB)形成复合物控制外种皮的分化。在苹果中，Brueggemann等人克隆并验证了 MdTTGl基因的功能,但是并没有进行原核表达和纯化蛋白。但是，在体外验证苹果和梨中的TTGl-MYB及TTGl-bHLH的互作，需要纯化TTGl蛋白。本发明选择着色最好且稳定的‘云红梨I号’作为实验材料，克隆云南红梨‘云红梨I号’ PyTTGl基因，进行原核表达和蛋白纯化的研究，将为在体外验证苹果核梨中的TTGl-MYB及TTGl-bHLH的互作，进而在苹果和梨中构建MYB-bHLH_WD40复合物模型及果树和花卉的分子育种奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种云南红梨/TiW基因，该基因具有如SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白质。本发明中PyTTGl基因来源于云南红梨。本发明另一目的是提供南红梨/TiW基因的原核表达载体pET32a-/y/7i 7，该载体含有r/i 7基因和r/i 7基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，/TiW基因的N端和C端均带有6 XHis标签。本发明另一目的是将原核表达载体应用在制备云南红梨花青素合成及叶毛、毛状体发生发育调控蛋白PyTTGl中，PyTTGl纯化蛋白应用于研究梨和苹果中TTGl与MYB和 bHLH等互作中。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案
I、云南红梨r/i 7基因、基因组序列的获得
(1)根据苹果量//TiW基因(GenBank登录号为AF220203)编码框序列和原核表达载体pET-32a多克隆酶切位点，设计I对特异弓I物PyTTGl-F 5 ' - 076CCATGGAGAACTCT ACGCAAGAATCG-3' , PyTTGl-R 5/ -07gCTCGAGAACCTTCAAAAGCTGCATCTTG-3'，在上下游引物的5'端分别加入Afc0I和ZAoI酶切位点及保护碱基(下划线部分为酶切位点，斜体部分为保护碱基);提取云南红梨果皮的总RNA，并以RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PyTTGl-F和PyTTGl-R进行扩增；提取云南红梨果皮中的基因组，使用上述引物进行扩增；
(2)回收的cDNA和gDNA全长片段。2、构建原核表达载体及gDNA的T/A克隆
使用AfcoI和通ol MPyTTGl基因全长片段和载体pET32a进行双酶切，分别获得5'和 3'末端分别带有Nco I和Xho I酶切位点的PyTTGl基因和pET32a载体，琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收，然后在16 °C连接16 h，获得原核表达载体pET32a-/y77^7，进行测序比对分析；使用PMD18T载体，将回收的gDNA片段进行T/A克隆，酶切验证后，进行测序分析，将测序结果进行生物信息学分析，并上传至GenBank数据库；
LPyTTGl的原核表达使用热刺激法将pET32a-/y/7i 7转入大肠杆菌力中，在终浓度I mM IPTG 诱导下筛选最佳表达条件，并在最适条件下进行大量表达；
4、PyTTGl蛋白纯化
收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于制作PyTTGl蛋白抗体和PyTTGl蛋白表达检测。5、云南红梨PyTTGl纯化蛋白在研究MYB-TTG1-WD40复合物功能中的应用
使用Far-western技术体外验证PyTTG与PyMYB及PyTTGl的互作，为梨和苹果中 MYB-bHLH-WD40复合物模型的建立奠定基础。本发明中克隆的基因是首次在梨中扩增得到，进行原核表达和蛋白纯化，获得的PyTTGI蛋白，将解决目前因缺乏该蛋白而无法在体外研究PyTTGI所结合的蛋白的问题，为在体外验证苹果核梨中的TTGl-MYB及TTGl-bHLH的互作，进而在苹果和梨中构建 MYB-bHLH-WD40复合物模型及果树花卉的分子育种中奠定了基础。
图I为本发明云南红梨果皮的总RNA电泳示意图。图2为本发明基因的扩增产物电泳示意图，其中I是DNA Marker III ；2 是PyTTGl基因的PCR产物。图3为本发明/TiW基因PCR产物的胶回收电泳示意图，其中I是DNA Marker III ；2良PyTTGl基因的PCR产物。图4为本发明原核表达载体pET32a-/y/7i 7电泳示意图，其中I是对照载体 pET32a-
PyMYB ,2-6 是载体 pET32a_/y/7^7。图5为本发明原核表达载体pET32a-/y/7i 7的酶切检测示意图，其中I是DNA Marker III ;2 是载体 pET32a-/y/7^i 的NcoI 和XhoI 双酶切结果。图6为本发明中PyTTGl蛋白与其它WD40蛋白的系统发育分析图。图7为本发明原核表达载体pET32a-/y/7^7在16 °〇和37 V IPTG终浓度为I mM条件下，诱导0、2、4、6、8 h的表达情况示意图,其中M是蛋白质分子量标准M0431 ；1是 pET-32a空载体转化菌未诱导菌体的总蛋白；2-5是16 °C、IPTG终浓度为I mM条件下，工程菌诱导2、4、6、8 h后菌体的总蛋白；6-10是37 V、IPTG终浓度为I mM条件下，工程菌诱导0、2、4、6、8 h后菌体的总蛋白；11是pET-32a空载体转化菌在37 V IPTG终浓度为I mM条件下诱导8 h后菌体的总蛋白。图8为本发明原核表达载体pET32a-/y/7i 7在28 °C、IPTG终浓度为I mM时，诱导0、2、4、6、8 h的蛋白表达情况示意图，其中I是pET-32a空载体转化菌诱导8 h的菌体总蛋白；2_6是原核表达载体pET32a-/y/7i 7诱导0、2、4、6、8 h的细菌总蛋白。图9为本发明原核表达载体pET32a-/y/7i 7在16 °C、不同IPTG终浓度下诱导8 h的细菌总蛋白示意图，其中M是蛋白质分子量标准M0431 ; 1-7是IPTG终浓度为分别为O、 O. 1、0. 3、0. 5、0. 7、0. 9、1. O mM/L时表达载体诱导8 h的细菌总蛋白；8是pET_32a空载体转化IPTG终浓度为I mM/L诱导8 h的细菌总蛋白。图10为本发明PyTTGl蛋白的纯化电泳示意图，其中I是加IPTG诱导前的细菌总蛋白；2是16 °C、IPTG终浓度O. 5 mM下原核表达载体诱导8 h的细菌总蛋白；3是蛋白质分子量标准M0431 ；4-8是镍柱纯化PyTTGl时分别使用30、150、200、300和500 mM咪唑洗脱的结果。图11本发明原核表达载体pET32a-/y/7i 7构建策略示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围并不局限于所诉内容。实施例中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂，各种限制性内切酶、pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为大连宝生物工程有限公司产品，反转录酶为Promaga公司的， 质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，基因组提取试剂盒购自于上海生工生物工程技术公司，其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器设备。所有引物序列合成和基因测序均在上海捷瑞生物公司(上海，GeneRay)进行。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I :云南红梨基因、基因组序列的获得
(I)引物设计
根据苹果履/ni l基因(GenBank登录号为AF220203)编码框和原核表达载体pET_32a 多克隆酶切位点，设计I对特异引物如下
PyTTGl-V 5/ - 076CCATGGAGAACTCTACGCAAGAATCG-3'，
PyTTGl-R 5/ KgCTCGAGAACCTTCAAAAGC TGCATCTTG-3'
在上下游引物的5'端分别加入Afc0I和通Ol酶切位点及保护碱基(下划线部分为酶切位点，斜体部分为保护碱基)。(2)总RNA的提取
a、使用液氮将O.I g云南红梨红色果皮充分研磨成粉末以后，加入I ml RNA提取缓冲液(4 M异硫氰酸胍,25 mM朽1檬酸钠,0.5 % (w/v)十二烧基肌氨酸钠,2 %(w/v)聚乙烯批咯烷酮，巯基乙醇)，研磨均匀后，转入2 ml离心管中，加入1/10体积2 M醋酸钠(pH 4.2)；
b、颠倒离心管数次混匀，接着加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，盖紧离心管盖，剧烈振荡 5 min,冰上静置 15 min 后,4 °C离心 15 min (12000 g/min)；
C、转移上清液于新的离心管，加入等体积的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡5 min，冰上静置 15 min 后,4 °C离心 15 min (12000 g/min)；
d、转移上清液于新的离心管，加入等体积异丙醇，在-80°C沉淀RNA 30 min，再次4 °C离心15 min (12 000 g/min),让RNA沉淀在管壁；
e、RNA沉淀经75%乙醇清洗两次后进行真空干燥，然后加入20 μ I无RNase的DEPC 处理水彻底溶解RNA ；
f、使用I.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测RNA (见图I)。(3 )反转录及 PCR 扩增(RT-PCR)CN 102586279 A
以上述总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PyTTGl-Y和/yrTiW-R进行扩增，得到PyTTGl的cDNA序列片段。(4)云南红梨果皮基因组的提取及基因组序列的扩增
使用上海生工的植物基因组提取试剂盒，提取红梨果皮的基因组；使用基因引物进行扩增，结果如图2。 (5)PyTTGl的cDNA和gDNA全长片段的回收
对/>77^1 cDNA及基因组PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段；使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收，结果如图3。实施例2 :原核表达载体的构建(见图11)及PyTTGl gDNA的T/A克隆
使用AfcoI和通ol对PCR纯化产物/TiW基因全长片段和载体pET32a按照说明书进行双酶切，分别获得5’端带有AfcoI和3’端带有通ol饱PyTTGl片段和pET32a载体， 电泳分析后分别进行胶回收，按目的基因载体=照摩尔比3 :1加样，然后加入连接液I， 16 °C连接16 h。将感受态大肠杆菌万.co7i DH5a 100 μ I加入6 μ I连接体系中混匀； 混合液冰浴30 min, 42 °C热刺激45 s后，冰浴2 min ;加入900 μ I液体培养基S0C，37 °C摇床200 rpm 60 min使菌体复苏；培养结束后,常温8 000 rpm离心I min收集菌体； 在超净台上吸去上清，剩余约O. I ml时,使用移液枪混勻,接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37 °C过夜培养；挑取白色菌落，接种于LB液体+ Amp的培养基，37 0C >180 rpm培养12 h后，提取质粒，结果如图4 ;进行酶切验证(见图5)后，再送至上海杰瑞生物工程公司测序进行测序验证插入基因的正确性，最后获得原核表达载体 m^a-PyTTGl。按照pMD18T的载体说明书进行操作，将基因组序列进行T/A克隆， 获得载体pMD18T-g/y/7i l，使用酶切进行验证后，送上海杰瑞生物公司测序。实施例3 -.PyTTGl基因及gDNA序列的生物信息学分析和GenBank登录号的获得测序结果表明，该基因的读码框为1029 bp,该基因编码342个氨基酸，分子量为
38. 4485 kDa，等电点为4. 87。BLASTp比对结果表明，PyTTGl与其它WD40类转录因子具有很高的同源性，如与桃中的PrTTGl的同源性为95. 32%，啤酒花HuWDR的为86. 69%，矮牵牛 PhANll的为83. 93%，拟南芥AtTTG182的为97%，与苹果MdTTGl的同源性高达99. 12%。结构域分析表明，其与苹果、棉花、拟南芥等的WD40蛋白具有相同的WD40结构域。因PyTTGl 与苹果MdTTGl相似性较高(见图6)，将其命名为随后将其上传至GenBank数据库， 获得其登录号为HQ641374。稀有密码子分析结果表明基因含有大约10 %的稀有密码子，其中三联体稀有密码子和二连体稀有密码子各I个，因此需要使用能够补充稀有密码子的大肠杆菌办力菌株进行原核表达。测序结果表明的gDNA序列与其cDNA序列完全相同，这说明该基因不含有内含子序列，在生物进化过程中高度保守，因此，TTGl (WD40蛋白)在生命代谢过程中具有重要作用。实施例4 =PyTTGl蛋白的原核表达
使用热刺激法将重组质粒pET32a-/y/7i 7转化入大肠杆菌TfoMiia (DE3)感受态细胞中。涂LB + Amp固体平板，挑取pET32a-/y/7i 7的重组菌落于LB + Amp液体培养基中 37 0C >200 rpm振荡培养过夜，按I :100的比例接种于相同的LB培养基上培养至OD6tltl为 O. 6-0. 8，加IPTG至终浓度为O. 5 mM，分别在37°C、28°C和16°C条件下培养0、2、4、6和8 h 后收集菌液用于分析总蛋白。4 0C ,12 000 rpm离心I min，弃上清液，沉淀用100 μ I SDS
7凝胶加样缓冲液(Tris-HCl 50 mM, pH 6. 8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚蓝(λ I % ;甘油 10 %)重悬，煮沸5 min后，12 000 rpm离心I min，取20 μ I上清液进行SDS-PAGE检测。用考马斯亮蓝R-250染色液(O. I %考马斯亮蓝R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脱色液 (25 %甲醇，6 %冰乙酸)进行脱色后，使用凝胶成像系统进行拍照。结果显示插入有外源片段的重组质粒pET32a-/y/7i 7经终浓度I mM IPTG诱导后，在37、28和16 °C下均诱导出了预期的蛋白分子量约59 kD (包括载体上TRX蛋白)的蛋白条带，而未诱导的转化重组质粒和pET-32a对照质粒未出现这条蛋白带(图7和图8)。表明重组质粒pET32a-/yr/i 7在大肠杆菌办Miia 力中诱导表达了 PyTTGl蛋白。为获得在16 °C条件下最佳诱导的 IPTG浓度，使用 IPTG终浓度梯度分别为 O mM/L、O. I mM/L、O. 3 mM/L、O. 5 mM/L、O. 7 mM/L、
0.9 mM/L、I mM/L分别对工程菌进行诱导8 h。结果表明，当IPTG终浓度为O. 5 mM/L时蛋白的表达量最高(图9)。为获得最大量的诱导目的蛋白，作者又进行了 16 °C、IPTG终浓度为O. 5 mM/L条件下诱导10 h和22 h的试验，结果表明随着时间的增加，蛋白的表达量继续增加，22 h的表达量最高。实施例5 =PyTTGl蛋白的纯化，具体步骤如下
a、菌体破碎将在16°C、0. 5 mM IPTG下大量诱导表达22 h的500 ml菌体，经超声破碎菌体(工作3 s,休息6 s) 5 min ；
b、收集上清和沉淀将菌体破碎液40C >12 000 rpm离心20 min，分别保留上清和沉
淀；
C、蛋白破碎上清液使用O. 22 μ M滤器进行过滤，除去杂质；
d、His-TrapHP柱的预处理使用5倍柱体积纯水洗柱；5倍柱体积结合缓冲液(磷酸钠缓冲液20 mM (pH7. 4), NaCl 0.5 M，咪唑30 mM)平衡柱子，流速为I ml/min ;
e、蛋白样品上柱流速为Iml/min,收集流出液；
f、洗柱使用5倍柱体积结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.4，NaCl O. 5M，咪唑30 mM)洗脱；
g、洗脱分别使用5倍柱体积洗脱缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.4，NaCl 0.5 M， 咪唑30、150、500 mM)依次洗脱，收集洗脱液；
h、His-TrapHP柱的后处理5柱体积洗脱缓冲液(磷酸钠缓冲液20 mM(pH7. 4)，NaCl
0.5 M，咪唑500 mM)洗去所有蛋白；5倍柱体积纯水洗柱；5倍柱体积20 %乙醇洗柱；柱子前后封口，于4 °C、20 %的乙醇中保存；
i、SDS-PAGE检测分别取50μ I各咪唑梯度流出液，加入5 μ I的5Χ蛋白上样缓冲液，混匀后，煮沸5 min,4 °C>13 000 rpm离心5 min后，各取20 μ I上样，进行SDS-PAGE 分析，纯化结果如图10，最终获得PyTTGl纯化蛋白。因为苹果中的MdTTGl和梨中的PyTTGl蛋白具有高度的相似性，所以本发明中的 PyTTGl纯化蛋白可用于研究梨和苹果中TTGl-MYB和TTGl-bHLH等与其它与TTGl互作的蛋白。本发明将为苹果和梨中MYB-bHLH-WD40互作模型的建立提供物质基础。
权利要求
1.云南红梨基因，其特征在于基因具有如SEQID NO. 3所示核苷酸序列或编码如SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的蛋白质。
2.根据权利要求I所述的云南红梨基因，其特征在于基因来源于云南红梨。
3.权利要求I所述云南红梨/TiW基因的原核表达载体pET32a-/y/7i 7，其特征在于该载体含有r/i 7基因，/yr/i 7基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS， T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，/TiW基因的N端和C端均带有6XHis 标签。
4.权利要求3的所述的原核表达载体在制备云南红梨花青素合成及叶毛、毛状体发生发育调控蛋白PyTTGl中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种云南红梨PyTTG1基因及其原核表达载体，具体涉及一种云南红梨花青素合成、根毛、叶毛和毛状体发生发育的调控蛋白PyTTG1基因及其原核表达载体，并将原核表达载体应用在制备云南红梨花青素合成及叶毛、毛状体发生发育调控蛋白PyTTG1中，具体是利用RT-PCR技术从云南红梨果皮中克隆PyTTG1基因全长cDNA，然后再利用原核表达载体将该全长基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达纯化，获得云南红梨PyTTG1纯化蛋白，及云南红梨PyTTG1纯化蛋白在研究TTG1-MYB、TTG1-bHLH等互作及MYB-bHLH-WD40模型构建中的应用。
文档编号C12N15/70GK102586279SQ20121006499
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者崔道磊, 张晓东, 李昆志, 樊磊, 舒群, 苏俊, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学