一种生产二元酸的菌株及其发酵方法

专利名称：一种生产二元酸的菌株及其发酵方法
一种生产二元酸的菌株及其发酵方法技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种生产二元酸的菌株及其发酵方法。
背景技术：
长链二元酸(LCDA ;也称为长链二羧酸和长链二酸)包括化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中η > 7。长链二元酸可以用来生产各种产品和中间品，例如生产聚酰胺，也称尼龙，用于电缆的皮层和牙刷丝；用于生产的共聚酰胺粘合剂和聚酯胶黏剂和高性能涂料； 用于制造汽车轮毂的GMA粉末涂料交联剂；用于在金属加工业和工业冷却系统中使用的防锈剂；用于制造合成润滑油，例如汽车润滑油；用于制造各种的个人护理产品以及家庭用品，例如香水和家用清洁剂。
本领域存在多种长链二元酸的化学合成方法，但使用化学方法工艺复杂且大部分得到的是长链二元酸与短链二元酸的混合物。因此，用这些方法生产长链二元酸时需要进一步纯化步骤。本领域熟知有几种酵母菌在以烷烃或脂肪酸作为碳源时可以生产长链二元酸。酵母对烷烃和脂肪酸进行新陈代谢时有三个生物化学过程烷烃至脂肪酸的alpha氧化，脂肪酸至alpha-, omega- 二元酸的omega氧化以及脂肪酸至CO2和水的降解型beta-氧化。
相对于非生物转化方法，生产二元酸的生物转化方法具有多种潜在优势。其中主要在于使用可再生的原料作为起始材料以及生产二元酸过程中不产生有害化学副产物的能力。使用生物方法的另一重要优势在于这种方法可容易地调节以利用相同生物催化剂和相同设备生产多种二元酸。因为现有化学合成法合成仅适于生产单种二元酸，不同二元酸合成将需要针对各二元酸开发新的合成方案。另一方面，酵母生物催化剂可以利用相同设备、培养基和步骤生产各种长度的二元酸，不同之处仅在于给酵母提供不同碳原子长度的底物。
虽然可以利用各种技术来提高现有的酵母例如热带假丝酵母(Candida tropicalis)发酵二元酸的产量，但还可以通过提供新的假丝酵母菌株以生产更高产量的长链二元酸，包括十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸和十六碳二元酸。发明内容
本发明的一个目的是提供新的菌株和利用这些菌株生产一种或多种长链二元酸的方法。使用该高转化率的假丝酵母来生产长链二元酸可以完全取代多步合成的化学法， 而且产量高，能耗低，起始原材料可以不采用石化原材料，虽然该材料也可用于本发明中。
本发明提供了一株新的清酒假丝酵母菌CAT H430,以及使用CAT H430生产二元酸的方法。
在本发明的一些实施例中，CAT H430在标准的500mL摇瓶中、按照下面所述的发酵条件下，可以产生至少100g/L的十二碳二元酸。在本发明的另一些实施例中，CAT H430 在标准的IOL发酵罐中、按照下面所述的发酵条件下，可以产生至少100g/L的十二碳二元酸，且达到90%以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。在本发明的其他一些实施例中，CAT H430在标准的200M3发酵罐中、按照下面所述的发酵条件下，可以产生至少100g/L的十二碳二元酸，且达到90%以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。在本发明的一些实施例中，CAT H430可以生产的二元酸的化学式为 H00C (CH2)nCOOH,其中η彡2。在本发明的一些实施例中，二元酸可以是丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸，或其组合物。
在本发明的一些实施例中，提供了用于生产二元酸的方法，所述方法包括以下步骤
a)、在含有至少一种氮源和至少一种有机底物的培养基中培养清酒假丝酵母CAT H430 ;和b)、从步骤a)中得到的培养液中回收二元酸。
在本发明的一些实施例中，所述的至少一种有机底物，从如下物质中选择具有4 到22个碳原子的烷烃，具有4到22个碳原子的羧酸(例如具有10到22个碳原子的脂肪酸)，具有I到12个碳原子的醇与具有10到22个碳原子的脂肪酸经酯化反应得到的脂肪酸烷基酯。在本发明的一些实施例中，所述的二元酸可以是丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、 辛二酸、壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸，十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸，或其组合物。
本发明的其他目的和优势可以在下文展现，也有可能在实施过程中得到展现。本发明的目的和优势通过技术特征及其结合得到，特别能从权利要求中体现这点。
应理解，上文的总体描述和下文的具体描述仅仅是对本发明的解释和示范，不应被认为是对本发明的限制。



图1为清酒假丝酵母CAT H430的筛选流程图。
具体实施方式
生物保藏信息
清酒假丝酵母CAT H430 (Candida sake CAT H430)根据《布达佩斯协议》于2011 年12月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉，武汉大学，保藏编号为 M2011489。
长链二元酸(LCDA ;也称为长链二羧酸和长链二酸)包括化学式HOOC(CH2)nCOOH 的二元酸，其中η彡7。LCDA的例子包括i^一碳二元酸(H00C(CH2)9C00H，1，9-九碳二羧酸或1，11-1^一碳二元酸，本发明中标记为“DC11”)，十二碳二元酸(H00C(CH2)ltlCOOH, 1，10-十碳二羧酸或1，12-十二碳二元酸，本发明中标记为“DC12”)，十三碳二元酸 (H00C(CH2)nC00H,l, 11-^^一碳二羧酸或I, 13-十三碳二元酸，本发明中标记为“DC13”)， 十四碳二元酸(HOOC(CH2) 12C00H，1，12-十二碳二羧酸或1，14-十四碳二元酸，本发明中标记为“DC14”)，十五碳二元酸(HOOC(CH2) 13C00H，1，13-十三碳二羧酸或I, 15-十五碳二元酸，本发明中标记为“DC15”)，十六碳二元酸(H00C(CH2)14COOH, I，14-十四碳二羧酸或1，16-十六碳二元酸，本发明中标记为“DC16”)，十七碳二元酸(H00C(CH2)15COOH, 1，15-十五碳二羧酸或1，17-十七碳二元酸，本发明中标记为“DC17”)，十八碳二元酸 (H00C(CH2)16C00H,1, 16-十六碳二羧酸或1，18-十八碳二元酸，本发明中标记为“DC18”)。
清酒假丝酵母CAT H430在不同的发酵过程中可以产生各种二元酸，尤其是长链二元酸。在本发明的一些实施例中，长链二元酸生产过程是在含有至少一种氮源和至少一种有机底物的培养基中培养清酒假丝酵母CAT H430。在本发明的一些实施例中，所述的至少一种有机底物可以是具有4到22个碳原子的烷烃，具有4到22个碳原子的羧酸(例如具有10至22个碳原子的脂肪酸)，具有从I到12个碳原子的醇与具有10到22个碳原子的脂肪酸经酯化反应得到的脂肪酸烷基酯。
本发明所述的菌株CAT H430是从山东省滨州市郊区胜利油田采集的样品中分离得到的。首先，将所采集得到的所有样品用O. 7%NaCl溶液稀释1000倍；稀释得到的样品经过培养，并分离得到单菌落；测试分离得到的单菌落的产长链二元酸的能力；得到一株产长碳链二元酸含量最高的菌株，并命名为清酒假丝酵母CAT H400 ;并以此菌株作为出发菌进行诱变筛选，诱变方法主要是紫外线和亚硝酸盐诱变。CAT H430就是经过诱变处理CAT H400后得到的诱变菌株。
清酒假丝酵母CAT H430可以在不同的培养基中生长，其中一种所述的培养基是 Yro培养基，“Yro培养基”为一种水溶液培养基，其包含如下成分20g/L葡萄糖，i0g/L酵母提取液，和20g/L蛋白胨。所述YPD培养基通过水与IN氢氧化钠溶液将pH调节至7. 0-7. 5 制备。将该培养基在121°C下灭菌20min。所述的“YH)培养基”再添加培养基重量2%的琼脂，就可以得到YPD固体培养基，该培养基在室温下成凝胶状，且同样适宜培养CAT H430。
另一适于培养本发明菌株CAT H430的培养基为“种子培养基”,其是一种水溶液培养基，包含如下成分10-30g/L蔗糖，1. 5-10g/L玉米浆液，l-10g/L酵母提取液，4_12g/L KH2PO4,0. 5-5g/L脲，和0-30ml/L十二烷。所述培养基用水制备，并在121°C下灭菌20m in。 尿素单独灭菌，110°C下灭菌15分钟，冷却后与灭过菌的其他成分混合，作为种子培养基使用。
另一适于培养本发明菌株CAT H430的培养基为“发酵培养基”,其是一种水溶液培养基，包含如下成分l-10g/L玉米浆液，l-10g/L酵母提取液，5-12g/LKH2P04，0_3g/L氯化钠，4-12g/L硝酸钾，10-40g/L蔗糖，O. 5_3g/L脲，和150_300mL/L单一烷烃或者混合烷烃。所述培养基用水与IN氢氧化钠溶液将pH调节至7. 5-7. 8。将该培养基在121°C下灭菌20min。尿素单独灭菌，110°C下灭菌15分钟，冷却后与灭过菌的其他成分混合，作为发酵培养基使用。
另一适于培养本发明菌株CAT H430的培养基为“生产发酵培养基”,其是一种水溶液培养基，包含如下成分5-12g/L KH2PO4,0-3g/L氯化钠，4_12g/L硝酸钾，10-40g/L葡萄糖，O. 1-0. 5g/L柠檬酸，O. 1-0. 5g/L CaCl2，其他金属盐，如ZnSO4, CuSO4等。所述培养基用水配制。将该培养基在121°C下灭菌20min。
根据本发明，菌株CAT H430可用于各种发酵工艺中。在本发明的一些实施例中， CAT H430采用的500mL发酵摇瓶工艺，其包括如下步骤
用接种环将菌株CATH430在试管斜面中已灭菌的YH)固体培养基上均匀铺展开。
将该斜面置于温度为29_30°C下培养CAT H430菌株2天。
然后将该斜面培养物上的部分菌种(譬如三分之一斜面培养菌种)接种到装在 500mL摇瓶中的30mL灭菌种子培养基中，并在温度为29_30°C下培养36-48小时，摇床速度为200_250rpm,摇动的幅度为2. 5-3. 5cm。
然后将种子发酵的肉汤接种至装在500ml发酵瓶中的灭菌发酵培养基里。该培养物在温度为29-30 °C下培养90-120小时，摇床速度为200_240rpm，摇动的幅度为 2. 5-3. 5cm，培养过程中用IN氢氧化钠溶液调节将pH维持在7. 0-8. O之间。该步骤结束后可以测定该发酵肉汤中的二元酸浓度。
在本发明的另一些实施例中，CAT H430采用的IOL发酵工艺，其包括如下步骤
(I)在含有种子培养基的种子罐中、29°C培养条件下制备CAT H430种子液。所述的种子罐参数可以是总体积10L，搅拌速度约为400-500rpm，通气量约为O. 2-1. OMVh,罐压(表压)约为O. 08-0.1MPa，培养时间约为15-24小时；
(2)将CAT H430种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中。所述的发酵罐可以是总体积约为10L，搅拌速度约为500-800rpm，通风量约为O. 2-1. 0M3/h，罐压(表压)约为 O. 08-0.1MPaJI^P 40%的液碱用于控制发酵液的pH ;发酵起始时的pH约为6. 0-6. 4，发酵的最初18小时内控制pH高于4. 0-4. 5，发酵18小时后直至发酵结束，控制pH在7. 0-8. O 之间。在发酵周期为15-20小时时第一次批加烷烃；之后当发酵液中烷烃含量低于5%时再批加烷烃。发酵过程中，通过补加葡萄糖来控制发酵过程中的beta氧化；总发酵周期约为 140-180 小时。
在本发明的另一些实施例中，CAT H430采用的200M3发酵工艺，其包括如下步骤
(I)在含有种子培养基的种子罐中、29°C培养条件下制备CAT H430种子液。所述的种子罐参数可以是总体积20M3，搅拌速度约为100-250rpm，通气量约为O. 2-0. 5vvm，罐压(表压)约为O. 08-0.1MPa，培养时间约为15-24小时；
(2)将CAT H430种子液接种到含有生产发酵培养基的发酵罐中。所述的发酵罐可以是总体积约为200M3，搅拌速度约为100-150rpm，通气量约为O. 2-0. 5vvm，罐压(表压)约为O. 08-0.1MPaJI^P 40%的液碱用于控制发酵液的pH ;发酵起始时的pH约为6. 0-6. 4，发酵的最初18小时内控制pH高于4. 0-4. 5，发酵18小时后直至发酵结束，控制pH在7. 0-8. O 之间。在发酵周期为15-20小时时第一次批加烷烃；之后当发酵液中烷烃含量低于5%时再批加烷烃。发酵过程中，通过补加葡萄糖来控制发酵过程中的beta氧化；总发酵周期约为 140-180 小时。
在本发明中，测定培养液中的二元酸浓度，可以采用本领域技术人员熟知的技术， 例如中国专利ZL95117436. 3。具体来说，用盐酸溶液调节发酵液的pH到3. 0，然后加入 IOOmL乙醚用于萃取发酵液中的二元酸；再采用蒸发以去除乙醚，得到二元酸粉末；将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用O. lmol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液中的二元酸滴定量。
在本发明的一些实施例中，每个实施例都详细的描述了各种发酵条件。在一个非限制性的实例中，发酵培养基中可以含有蛋白胨、酵母提取物、酵母氮源、磷酸二氢钾、 蔗糖。在本发明的另一些实施例中，用于维持CAT H430生长的培养基中，含有(a)含有 10-60g/L葡萄糖的玉米糖浆；(b)由l_15g/L玉米浆和l-10g/L啤酒酵母提取物所组成的有机氮源；(C)无机氮源；(d)磷酸盐；(e)可选的微量元素；(f)酵母培养物；(g)可以被酵母转化为二元酸的底物，如美国专利US6004784中所述。
在本发明的一些实施例中，清酒假丝酵母CAT H430的二元酸转化率分别可以达到至少80%、至少85%、至少90%。在本发明的某些实施例中，CAT H430可以生产的二元酸可以是i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸中的一种或多种。在本发明的一些实施例中，CAT H430生产的二元酸是十二碳二元酸。
在本发明的一些实施例中，清酒假丝酵母CAT H430的二元酸产量分别是至少 95g/L、至少 100g/L、至少 110g/L、至少 120g/L、至少 130g/L、至少 140g/L、至少 150g/L、至少160g/L。在本发明的某些实施例中，CAT H430可以生产的二元酸可以是i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸中的一种或多种。在本发明的一些实施例中，CAT H430生产的二元酸是十二碳二元酸。
在本发明的一些实施例中，清酒假丝酵母CAT H430生产的二元酸化学式是 H00C(CH2)nC00H，其中6彡η彡2。在本发明的一些实施例中，二元酸可以是丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸，或是其组合物。
在本发明的一些实施例中，清酒假丝酵母CAT Η430生产的二元酸是长链二元酸， 其化学式是H00C(CH2)nC00H，其中η彡7。在本发明的一些实施例中，二元酸可以是壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二 元酸、 十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸，或是其组合物。
在一些实施例中，生产二元酸包括以下步骤，在包含至少一种氮源和至少一种有机底物的培养基中培养清酒假丝酵母CAT H430，然后从发酵液中回收二元酸；在一些实施例中，发酵液的有机反应底物为具有4到22个碳原子的烷烃，具有4到22个碳原子的羧酸 (例如具有10到22个碳原子的脂肪酸)以及具有10到22个碳原子的脂肪酸与具有I到12 个碳原子的醇类制得的脂肪酸脂。在一些实施例中，得到的二元酸是丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸，或是其组合物。
培养基的选择对于菌株发酵是非常重要的。实施例中所描述的培养基是本发明能利用的培养基的一部分。一般来说，本发明的培养基包含了适于微生物发酵的所有的有机或无机氮源。无机氮源包括硝酸盐、氨水、液氨、铵盐、亚硝酸盐中的一种或多种，其中，硝酸盐例如硝酸钾、硝酸钠，铵盐例如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸铵以及类似物。有机氮源包括酵母膏、玉米浆、牛肉膏、豆柏水解液、蛋白胨、尿素、氨基酸、肽中的一种或多种。有机底物可以是至少一端末端为甲基的具有9个碳原子以上的脂肪族化合物。例如，烷烃、烯烃、 炔烃、羧酸及其酯类和芳烃。优选地，底物为具有9到22个碳原子的烷烃，具有9到22个碳原子的脂肪酸及其对应的具有10到22个碳原子酯基的脂肪酸烷基酯。更优选地，底物为十二烷烃，十三烷烃，十四烷烃，油酸，油酸甲酯，棕榈酸甲酯，棕榈油酸甲酯，肉豆蘧酸甲酯中的一种或多种。
本发明还公开了适合发酵的辅助碳源，包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘油和醋酸钠中的一种或多种。在一些实施例中使用的是葡萄糖。辅助碳源添加在清酒假丝酵母菌株中，解决了由于beta-氧化途径被阻止或抑制导致的底物氧化所需的能量不足的问题。葡萄糖以底物一定的比例添加，菌株在对底物进行alpha, omega-氧化生成alpha, omega- 二元酸时，不再需要beta-氧化以提供氧化所需能量。
使用上述生物基的方法生产的二元酸可以替代化学法生产的二元酸用于产品的制造。例如用生物基的二元酸生产聚酯，聚酰胺，抽丝制成纺织纤维，电缆的皮层以及牙刷丝；用于制造共聚酰胺胶粘剂、聚酯胶粘剂以及高性能涂料；用于制造汽车轮毂的GMA粉末涂层交联剂；用于在金属加工业和工业冷却系统中使用的金属防腐剂；用于制造合成润滑油，例如汽车润滑油；用于制造各种的个人护理产品以及家庭用品，例如香水和家用清洁剂。
前面的一般性描述和下面的详细描述都仅仅是为了对本发明的示范和解释，而不能认为是对本发明的限制。而且本发明不限于所提到的几个实施例。在实施例中所提到的技术方案不是对本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求的为准。
除非明确的指出，否则本发明中每个数值区间的最大值与最小值之间的中间值， 至少大于所述区间最小值十分之一。同时，本发明也包含文中公开的其他中间值。此外，本发明所涵盖的数值区间包含不处于本发明所列举的最小值与最大值之间的任何数值，除非该数值被明确排除。
除非明确定义，本发明中的科技术语应理解为本领技术人员一般理解的含义。本领域的技术人员应该认识到与说明书中公开的方法、材料、设备相似的方法、材料、设备也可以在本发明中运用。进一步地，所有本说明书提到的公开文献视为已经包含在本说明书中。
在本发明中，除非特别指出，在组分、反应 条件、浓度等参数中使用“大约”来修正数值。因此在说明书和权利要求书中的数值参数是一个近似值，取决于本发明所期望的性能。至少，不应认为是对本发明权利要求保护的等同原则应用的限制。至少，每个参数的数值运用四舍五入，根据记载的有效数字的位数来确定。虽然在具体实施例中的数值尽可能做到准确，但是由于实验测试方法的系统误差必然导致任何数据都会有一定的误差。
下面的实施例进一步说明本发明。这些实施例仅仅用来说明本专利，展示这些实施方案的有益效果。这些实施例不构成对本专利的限制。
实施例1、CAT H430菌株的筛选过程
CAT H430菌株是由CAT H400诱变得到的，CAT H400菌株是从中国山东省胜利油田采集的样本中分离得到的。具体的来说，首先将从胜利油田采集的样本用O. 7%NaCl溶液稀释1000倍，然后接种在含有YPD培养基的平板上。所有的样品在28-30°C培养。挑选平板上的菌落，然后接种到500mL标准摇瓶发酵以筛选出生产二元酸产量最高的菌株。其中一株二元酸产量达到10g/L的菌株被编号为CAT H400，并以该菌株作为后面的鉴定和诱变菌株。
实施例2、CAT H400菌株的鉴定
2.1、形态
形态(生长在马铃薯葡萄糖琼脂上的菌落)乳白色、黄油状、椭圆形-卵形、芽殖。
2. 2、碳源和氮源的利用
利用公知的微生物鉴定方法进行营养物利用实验。在特定培养基中加入下列氮源或碳源，菌体培养2天或3天后，以是否生长为判断条件，判断阴性与阳性，结果如下
表1、CAT H400菌株的碳源和氮源的利用

添加N-乙酰葡糖胺为碳源、氮源生长为(+ );在37°C下生长为(_)；
添加脲酶生长为(_)。
综上所述，鉴定该菌株CAT H400为清酒假丝酵母(Candida sake)。
实施例3、CAT H430菌株的诱变和筛选方法
I JfCAT H400菌株用甘油试管保藏，保存在低温冰箱中。从甘油试管中取出一支，在室温下解冻，然后接入装有50mL YPD培养基的500mL摇瓶中，于29 °C旋转摇床中培养 20-24h，转速为 210rpm。
2、为了准备用于诱变的菌株悬浮液，在15mL的无菌离心管中加入上述IOmL的YPD 培养液，2000rpm离心2分钟，倒去上清液，用O. 85%的生理盐水离心洗涤3次。倒去上清液，加入2. 5%的无菌氯化锂10mL，制得菌株悬浮液。
3、称取O. 08mg的NTG诱变剂加入15mL无菌离心管中，并加入IOmL O. 85%的生理盐水,混匀。
4、将步骤3及4中的各IOmL液体混合,加入90mm的放有15mm*3mm搅拌子的无菌平皿中，盖好上盖。按同样方法处理再制备2块无菌培养皿。把三个无菌培养皿放磁力搅拌器上分别搅拌处理10、15、20分钟。
5、每个无菌培养皿分别按以下方法处理将上述的处理液取IOmL加入15mL无菌离心管中，2000rpm离心2分钟，倒去上清液，用O. 85%的生理盐水离心洗涤3次。
6、倒去上清液，用O. 85%的生理盐水进行逐级梯度稀释。每稀释度吸取O. 15mL菌液进行平板涂布。涂布后的平板放培养箱倒置在29°C下培养3-4天。
7、挑取培养成熟的单菌落接种到入15*150mm试管斜面，放培养箱于29°C下培养2 天。
8、斜面培养成熟后取三分之一斜面菌体接入装有IOmL发酵培养基的250mL摇瓶中，在旋转摇床中29°C下培养4天，转速为210rpm。剩余斜面放4°C冰箱冷藏。同时摇床每层放有6瓶装有对照菌株的摇瓶，而且均匀的放在6个不同的位置。
9、发酵过程最后一步，用移液枪将O. 05mol的酚酞试剂(浓度1%)加到每个摇瓶培养基中。随机或者根据菌株长势选取其中10瓶以及前面所提的6瓶对照菌株。
10、将这16个摇瓶称重记录,然后用O. 2N碱溶液滴定。达到滴定终点后,再次将这16个摇瓶称重并记录。
11、计算对照菌株的摇瓶平均耗碱量及筛选菌株的耗碱量，确定所要筛选菌株的耗碱水平，一般比初筛对照菌株耗碱量提高10%以上。
12、将O. 2N的碱溶液和O. 05mol的酚酞试剂(浓度1%)加到每个对比菌株的摇瓶中得到中和瓶中的酸需要的碱量。将此碱量的O. 2N的碱溶液和O. 05mol的酚酞试剂(浓度 1%)加到其他摇瓶中。如果摇瓶变为红色证明突变的菌株产酸量小于对比菌株。摇瓶继续震荡5分钟。5分钟后检查药品是否变色，所有变色的摇瓶全部去除。继续给没有变色的摇瓶碱溶液滴定，然后给这些摇瓶称重，计算耗碱量。
13、按照发酵摇瓶耗碱量的多少确定进行再次复筛的菌株。一般100株摇瓶初筛菌株中选取5株耗碱量闻的菌株进行复筛。
14、选取复筛菌株对应的初筛斜面，上述接初筛后剩余的三分之二斜面，再铲取五分之一斜面菌体转接斜面F2，放培养箱29°C下培养2天。剩余斜面继续放冰箱冷藏。
15、培养成熟的斜面菌体整支全部接入装有30mL种子培养基的500mL摇瓶中，在旋转摇床中29°C下培养44-48h，转速为210rpm。同时将对照菌株的I支甘油管菌液也全部接入I个种子摇瓶中。
16、培养成熟后的种子液吸取3ml加入装有15mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在旋转摇床中29°C下培养110h，转速为210rpm。
17、经多次筛选得到高产二元酸的菌株，编号为CAT H430。
实施例4、在500mL摇瓶中使用CAT H430生产长链二元酸
以CAT H400菌株为对照，将CAT H430使用500mL摇瓶发酵，发酵条件和十二碳二元酸、十三碳二元酸和十四碳二元酸的平均产量如表2所示。
表2、500mL摇瓶中发酵CAT H430生产二元酸的平均产量
权利要求
1.一种生产二元酸的菌株，其特征在于，所述菌株为清酒假丝酵母CCTCCNo. M2011489。
2.如权利要求1所述的菌株的发酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)、在含至少一种氮源和至少一种有机底物的培养基中培养清酒假丝酵母CCTCCNo. M2011489 ;和b)、从步骤a)中得到的培养液中回收二元酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮源为有机氮源或者无机氮源。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述有机氮源为酵母膏、玉米浆、牛肉膏、豆柏水解液、蛋白胨、尿素、氨基酸、肽中的一种或多种；所述无机氮源为硝酸盐、氨水、液氨、铵盐、亚硝酸盐中的一种或多种。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基中还包括辅助碳源，优选地，所述辅助碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘油、醋酸钠中的一种或多种。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机底物选自具有4到22个碳原子的烷烃、具有4到22个碳原子的羧酸、具有I到12个碳原子的醇与具有10到22个碳原子的脂肪酸经酯化反应得到的脂肪酸烷基酯。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有机底物选自具有9到22个碳原子的烷烃、具有9到22个碳原子的脂肪酸及其对应的具有10到22个碳原子酯基的脂肪酸烷基酷。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机底物为十二烷烃、十三烷烃、十四烷烃、油酸、油酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、肉豆蘧酸甲酯中的一种或多种。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二元酸为丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、i^一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸中的一种或多种。
10.如权利要求1所述的清酒假丝酵母CCTCCNo. M2011489生产二元酸的应用。
全文摘要
本发明公开了一种生产二元酸的菌株及其发酵方法，所述菌株为清酒假丝酵母CCTCC No.M2011489。所述方法包括以下步骤a)在含至少一种氮源和至少一种有机底物的培养基中培养清酒假丝酵母CCTCC No.M2011489；和b)从步骤a)中得到的培养液中回收二元酸。使用本发明的高转化率的假丝酵母生产长链二元酸可以完全取代多步合成的化学法，而且产量高，能耗低，起始原材料可以不采用石化原材料。
文档编号C12N1/16GK102994402SQ20121016589
公开日2013年3月27日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年3月9日
发明者刘驰, 廖锦绣, 汪江林, 秦海斌, 李乃强 申请人:上海凯赛生物技术研发中心有限公司, 山东凯赛生物科技材料有限公司, 上海凯赛生物科技有限公司, 凯赛生物产业有限公司